（材料学专业论文）分层自组装磁性复合功能药物载体系统的研究.pdf

中文摘要 本文先以e d c 为偶联剂，将硬脂酸接枝到赖氨酸改性的壳聚糖主链的胺基 上，得到一系列硬脂酸取代度相同( 4 9 ) 而赖氨酸取代度不同( 2 3 ，4 4 ，9 6 ) 的双亲性壳聚糖衍生物( s a l y s c s ) ，利用f t - i r , i h - n m r 对其结构进行表征。 s a l y s c s 在水相中可自组装形成白聚集体。以芘为荧光探针对其自聚集行为进 行了研究，结果显示制得的自聚集体具有较之小分子表面活性剂较低的c a c ( 1 1 1 0 - 2 - 5 3 xl f f 2 m g m l ) ，表明自聚集体可在水相中形成稳定的胶束。且随着赖氨 酸取代度的增加，c a c 值随之增大。以激光粒度仪对自聚集体水相中的粒径分布 进行了研究，发现其平均粒径随着赖氨酸取代度的增大有所增加( 1 3 2 6 3 0 0 2 n m ) 。 用中性脂质体包载磁流体，成功制备了磁性中性脂质体，后将其与上述制备 的高分子胶束复合，制备出分层自组装胶束，通过x 光电子能谱分析( x p s ) 、透 射电子显微镜( t e m ) 和v s m 法磁性能分析等手段对其进行表征。在此基础上， 将靶向性物质叶酸和跨膜多肽t a t 与载体连接，构建出同时具有跨血脑屏障、磁 性和受体介导复合靶向功能的分层白组装载体系统，并用差量法定量测定出载体 所携带的t a t 和叶酸含量。 对上述载体进行放射性9 9 t c 标记，用s p e c t 考察了上述载体载p g l 3 质粒在正 常s d 大鼠体内脑、心、肺、肝、脾、肾、膀胱等脏器的分布情况，并详细考察了 t a t 、叶酸( f a ) 和外加磁场对载体在大鼠脑及各脏器分布产生的影响。 将抗癫痫药物丙戊酸钠( p a ) 与载体连接，并用s p e c t 在癫痫模型鼠中 证实其可成功跨越血脑屏障；与其它对照组比较，t a t f a v p a 分层自组装磁性 复合功能载体( t a t - f a v p a l s m m ) 的脑内分布最高。 在s d 大鼠上成功建立了癫痫动物模型，并根据体内分布的结果，选择载体 t a t f a - v p a l s m m 进行癫痫治疗的动物实验。经过对治疗前后脑电图、病理、 细胞凋亡和免疫组化等指标检测，证实t a t f a v p a 分层自组装载体治疗组的治 疗效果要优于单纯药物治疗组和生理盐水对照组。 综上所述，本研究所制备的分层自组装磁性复合功能载体可用于跨血脑屏障 治疗脑部疾病的基因和药物载体。 关键词：壳聚糖，磁性脂质体，分层自组装，靶向，血脑屏障，癫痫，治疗。 a b s t r a c t v a r i o u ss t e a r i ca c i dm o d i f i e dl y s i n eg r a f t e dc h i t o s a n ( s a l y s c s ) w i t ht h es a m e d e g r e e so fs u b s t i t u t e ( d s ) o fs t e a r i ca c i d ( 4 9 ) a n dd i f f e r e n td e g r e e so fs u b s t i t u t e ( d s ) o f l y s i n e ( 2 3 ，4 7 ，9 3 ) w e r es y n t h e s i z e dt h r o u g ht h e1 - e t h y l - 3 - ( 3 - d i m e t h y l - a m i n o p r o p y y l ) - c a r b o d i i m i d e - m e d i a t e dr e a c t i o n s t r u c t u r a lc h a r a c t e r i s t i c so ft h e s e p r o d u c t sw e r ei n v e s t i g a t e du s i n gf t - i ra n d1 h n m r t h ec r i t i c a la g g r e g a t i o n c o n c e n t r a t i o n ( c a c ) o ft h es e l f - a g g r e g a t eo fs a l y s c sw e r ed e t e r m i n e db y m e a s u r i n gt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo ft h ep y r e n ea saf l u o r e s c e n tp r o b e ，w h i c h i n c r e a s e dw i t hi n c r e a s eo fd so fl y s i n ei nt h er a n g eo f1 1 - 5 3 1 0 2m e g m l t h e a v e r a g ep a r t i c l es i z eo fs e l f - a g g r e g a t e si np h y s i o l o g i c a ls a l i n ea l s oi n c r e a s e dw i t ht h e i n c r e a s eo f t h ed so fl y s i n ei nt h er a n g eo f13 2 6 3 0 0 2 n m m a g n e t i c n e u t r a l l i p o s o m e h a db e e n p r e p a r e ds u c c e s s f u l l y f r o mf e 3 0 4 n a n o p a r i t i c l e se n c a p s u l a t e db yl i p o s o m e t h e s em a g n e t i cn e u t r a ll i p o s o m ec o m p l e x e d w i t ht h es e l f - a g g r e g a t eo fs a l y s c s ，w h i c hw e r ek n o w na sl a y e r e ds e l f - a s s e m b l y m a g n e t i cm u l t i f u n c t i o n a lm i c e l l s ( l s m n o ，a n dc h a r a c t e r i z e du s i n gx p s ，t e m ， v s ma n ds oo n t h e nt h e s el s m mw e r es u r f a c ef u n c t i o n a l i s e db yf o l i ca c i d ( f a ) a n dt a to l i g o p e p t i d e8 0t h a tt h el s m mh a dm u l t i f u n c t i o n si n c l u d i n ga c t i v et a r g e t i n g ， p h y s i c a l m a g n e t i ct a r g e t i n gt r a n s d u c a t i o nf o r t h eb l o o d - b r a i nb a r r i e r ( b b b ) t h e q u a n t i t i e so f b o t hf aa n dt a to nl s m mw e r et e s t e db ya d o p t i n gd i s p e r s i o nm e t h o d t h eb i o d i s t r i b u t i o no fs u r f a c ef u n c t i o n a l i s e dl s m mi n b r a i n ，h e a r t & l u n g ， l i v e r & s p l e e n , k i d n e ya n db l a d d e ro fs dn o r m a lr a t sw a si n v e s t i g a t e db y9 9 t c 1 a b e l e d s p e c t t h ef u n c t i o n so ff o l i oa c i d ，t a ta n de f f e c to fa c t i o nt i m eo fm a g n e t i cf i e l d h a da l s ob e e nf u r t h e ri n v e s t i g a t e d d r u gd e l i v e r ys y s t e m sc a r r y i n gs o d i u mv a l p r o a t e ( v p a ) ，c a l l e dt a t - f a - l s m m ， h a db e e np r e p a r e ds u c c e s s f u l l y t h eb i o d i s t r i b u t i o np r o v e dt h e yw e r es u c c e s s f u l l y p a s s e dt h eb l o o d - b r a i nb a r r i e ru n d e rt h em a g n e t i cf i e l d ，a n dt h eb r a i nd i s t r i b u t i n gw a s m u c hh i g h e rt h a no t h e rg r o u p s t h ee p i l e p t i ca n i m a ls e i z u r em o d a lh a db e e ne s t a b l i s h e d ，a n ds dm o d a lr a t sw e r e 18c a s e sw e r ed i v i d e dr a n d o m l yi n t o3g r o u p s ，p h y s i o l o g i c a ls a l i n ea n ds o d i u m v a l p r o a t e ( v p a ) w e r ep e r f o r m e di ng r o u pla n d2r e s p e c t i v e l y , a n dt a t - f a l s m m w a su s e di ng r o u p3 t h er e s u l t so fe l e c t r o e n c e p h a l o g r a p h ，a p o p t o s i st e s ta n d i m m u n o p h e n o t y p et e s th a dp r o v e dt h a tt h et h e r a p e u t i ce f f i c i e n c yo ft a t - - f a - - l s m m w e r em u c hb e t t e rt h a nt h a to f p h y s i o l o g i c a ls a l i n ea n ds o d i u mv a l p r o a t e ( v p a ) i ns u m ，l a y e r e ds e l f - a s s e m b l ym a g n e t i cm u l t i f u n c t i o n a ld e l i v e r ys y s t e mc o u l db e a p p l i e di nt h eg e n e d r u gt h e r a p yo fb r a i nd i s e a s e sw h i c hn e e dc r o s st h eb l o o d b r a i n b a r r i e r ( b b b ) k e y w o r d s ：c h i t o s a n , m a g n e t i cl i p o s o m e ，l a y e r e ds e l f - a s s e m b l y , t a r g e t i n g ， b l o o d b r a i nb a r r i e r , e p i l e p s y , t h e r a p y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得盘壅苤堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 签字日期：、莉7 年钿7 e l 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解墨生盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权苤盗盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 一警缈新虢备乙f ， 第一章绪论 1 1 前言 第一章绪论 基因治疗是将人类的正常基因或有治疗作用的外源目的基因，通过一定的基 因转运系统导入人体靶细胞或直接注入人体，表达具有功能的蛋白质，以达到补 充、纠正基因的缺陷，从而达到治疗疾病的目的。自从1 9 9 0 年美国国立卫生研究 院和其下属重组d n a 顾问委员会批准了美国第一例临床基因治疗申请以来，基因 治疗对象已从单基因遗传病扩展到多基因遗传病、恶性肿瘤、心血管疾病以及艾 滋病等感染性疾病。目前，全球已有l ，0 2 0 种基因治疗方案用于临床，其中美国 占6 6 。用于肿瘤治疗的有6 7 5 种，显示肿瘤已经成为基因治疗的重要研究对象 n 】。近年来，随着对肿瘤发病的分子机制及细胞生长调节控制研究的深入，肿瘤 的基因治疗研究取得了巨大进展，例如将抑癌基因、自杀基因和免疫调节基因等 连接至载体转染肿瘤细胞，以抑制或消除肿瘤细胞。 肿瘤基因治疗的方法有直接体内疗法和间接体内疗法。前者是指将外源基因 装配于特定的真核细胞表达载体，直接导入体内；后者是指将治疗基因连接至载 体并存体外导入受体细胞，筛选转化细胞扩增后回输体内。但无论是那种方法， 其要素均为目的基因、载体和靶细胞，而构建安全、有效、可控的基因载体为基 因治疗的瓶颈犯1 。随着人类基因组计划的初步完成，分子病毒学和材料学的发展， 在原有以病毒载体为主的基础上，新型肿瘤基因治疗载体不断出现。 基因治疗研究的内容包括【3 】：( 1 ) 目的基因的获得；( 2 ) 目的基因的克隆、测 序基因表达及其产物的功能特点研究；( 3 ) 目的基因转移传递系统的研究；( 4 ) 目 的基因表达调控的研究；( 5 ) 疗效及安全性的研究。随着分子生物学，基因重组 技术的发展，有关目的基因的研究已日益成熟，获得各种治疗基因已不是基因治 疗的难点，而建立有效的基因转移方法，并使得转移基因高效表达正成为目前基 因治疗研究的难点与热点。目前人类疾病的基因治疗技术一般集中在二个方面； 一方面是体外对细胞遗传进行调整，随后将修饰的细胞移植至存活的靶细胞中， 这种方法首先要容易得到靶细胞，并能在体外进行遗传控制，随后能有效地进入 宿主受体；另一方面是将基因载体直接介入宿主受体的组织中，使基因产生治疗 效果。基囚治疗首先应了解致病基因是什么；其次是能取得目的基因并将它克 隆在载体中，在治疗上很重要一点是能得到有效的基因转运载体以及这些载体能 在体内释放基因并能产生治疗效果。基因治疗必须克服下述几个障碍才能使d n a 或r n a 达到期望的效果h 1 ： 第一章绪论 向靶细胞的传递受到各种屏障如血清失活的阻碍。 附着并进入细胞时受到受体减少或缺失的阻碍。 释放入胞质时可能受溶酶体降解的阻碍。 进入细胞核由于缺乏有丝分裂( 逆转录病毒载体所需要) 而受阻。 虽然整合确实发生了，但最后一步的表达并不充分。 因此，基因治疗对基因载体的要求颇高，理论上说，理想的基因治疗载体应 该具备下述性质： 易于进入靶细胞。 在特异细胞或组织达到有规律、充分及持续的外源基因表达。 外源基因应含或整合于基因组活化区内或能自主复制的构件。 整个过程应安全有效并具有选择性。 易于大量生产。 把供治疗用的基因或核酸传送到特定的病变细胞或组织中去的过程被称为 基因转移或转染( t r a n s f e c t i o n ) 。基因转移可分为体内法o nv i v o ) 和体外法( e x v i v o ) 。s m i t h 等【5 】认为基因转移的效率是由转移载体，聚核苷酸及目标细胞的 性质共同决定的。磷酸钙沉淀法【6 】早在8 0 年代就被用于基因转移，但这种方法 对细胞膜有很大破坏作用，将目的基因直接转入靶细胞，却存在目的基因随机整 合之弊，况且人体只有少数几种细胞或组织可接收直接导入的裸露d n a ，其它 细胞或组织对这种方法具有抗性，于是帮助转移外源基因的载体被广泛研究。 1 2 基因载体 理想的基因载体应具备【7 】：( 1 ) 靶向特异性，并且可被免疫系统识别；( 2 ) 高度 稳定，容易制备，可浓缩和纯化；( 3 ) 无毒性，对病人及环境安全无害；( 4 ) 有利于基 因高效转移和长期表达。目前，在基因载体的设计上，大致可分为两大类：病毒 类和非病毒类。在临床治疗成为可能，以前没有一种是对基因转移的万能选择， 两类载体都有许多问题亟待解决，都不能够达到理想载体( 能够标准转移核酸并 无毒副作用) 的标准。 1 2 1 病毒性基因载体 病毒是天然的基因转运系统。病毒已进化了上亿年，它们有自己的一套侵染 细胞并使自身的遗传信息表达的“策略”。病毒在感染宿主时，病毒的核酸能够 进入哺乳动物细胞并在细胞内进行复制、转录和翻译，生成子代病毒。野生型病 第一章绪论 毒株可经过修饰去除致病基因而保留其感染和复制能力，构建能够携带外源目的 基因的载体。病毒性载体有：反转录病毒载体、腺病毒载体、单纯疱疹病毒载体、 腺病毒相关病毒载体、痘病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、仙台病毒载体、 脊髓灰质炎病毒载体和杂交病毒载体嘲。目前临床试验中最常用的是逆转录病毒 载体，其次为腺病毒载体。逆转录载体可容纳9 k b 的外源信息，整合进入宿主 细胞基因组，长期表达外源基因，结合已经建立的与之相配套的包装细胞系统， 可以产生高滴度的病毒液，从而高效率地将外源性基因导入靶细胞，其不足之处 是整合是非位点特异的，而且只整合进入处于分裂期的细胞，由于包装细胞产生 的病毒子非常容易失活；不能经受浓缩过程，所以不能直接用于体内过程。腺病 毒可以感染处于非分裂期细胞，病毒稳定，又可经受浓缩纯化，但它可能引起免 疫反应。总之病毒类载体具有：( 1 ) 在载体中可能产生有传染性，野型或辅助型 病毒；( 2 ) n - - l f l 皂随机整合于宿主基因组中，从而活化癌基因或使抑制癌基因失活； ( 3 ) 其自身或编码的基因产物过度表达等不安全因素1 9 】。正是由于安全性问题及 大量获得重组病毒载体相对困难等原因，科学家正在寻找更安全，高效又易识别 的非病毒类。 1 2 2 非病毒类基因载体 非病毒性载体主要是针对病毒载体的缺点而研制的，近年来发展很快。常见 的非病毒性载体有：真核细胞表达质粒载体、阳离子聚合物、阳离子脂质体、人 工染色体、活菌载体和拟病毒颗粒等。与病毒载体相比，非病毒载体的优点如下： ( 1 ) 对受转移的d n a 大小没有限制；( 2 ) d n a 容易进行操作，对于包装与复制需要 的d n a 序列没有特殊要求；( 3 ) 比构建的病毒载体安全，不会诱发任何感染：( 4 ) 免疫原性问题较少。s m i t h 等【lo 】认为理想的非病毒d n a 传递系统应具备的性质包 括：载体结构及成分已知；在生物液体( b i o f l u i d ) 中，传递系统的稳定性受到复合 物成分的控制；能迅速从内吞泡中释放( 依赖于p h 值) ；能有效地脱离内含体或 溶酶体，经细胞质将d n a 运输至细胞核并得到充分摄取与表达目前，临床实验 中最常用的是真核细胞表达质粒载体，其次为阳离子脂质体1 1 引。 1 2 2 1 脂质体 利用磷脂具有亲水头疏水尾可在水溶液中形成双分子层球体( 脂质体) 的特 点，将d n a 用脂质体包裹起来，脂质体通过与细胞膜的融合进入细胞核并使d n a 免受核酸酶的降解，这样基因的转染率较不加载体的方法明显提高了。阳离子脂 质体通常由一个单一的阳离子两亲化合物和一个中性脂质组成，而具有两亲性的 第一章绪论 单一阳离子化合物又称为细胞转染素( c y t o f e c t i n ) 。细胞转染素介导核酸转运的机 制是带正电荷的阳离子脂质体与带负电荷的核酸序列通过静电作用形成能进入 细胞的缀合物，利用其亲脂性进入细胞，在细胞内核酸序列被慢慢释放出来并在 细胞核表达或控制基因表达。1 9 8 7 年f e l g n e r 等【1 4 】首次发明了用阳离子脂质体 l i p o f e c t i n 进行基因转染，l i p o f e c t i n 是由细胞转染素n 1 ( 2 ，3 ) 二油烯氧基】丙基 - n ，n ，n 三甲基胺( d o t m a ) 与中性脂质二油酰磷脂酰乙醇胺( d o p e ) 按l ：1 摩尔比 组合而成，随着以后对阳离子脂质体的进一步研究，人们发现细胞转染素的结构 和它与中性脂质的组合对阳离子脂质体有重要影响。 1 2 2 2 人工合成聚合物载体 许多人工合成聚合物已经在生物医学工程领域得到应用，有的已规模化生产 并进行了临床应用。但将高分子材料用于基因载体，还处在实验研究阶段。主要 材料有聚乳酸( p l a ) 、聚丙交酯乙交酯( p l g a ) 、聚乙烯亚胺( p e i ) 、多聚赖氨酸等。 聚酯类微球是抗原载体系统中研究最多的载体，它可以包裹d n a 、激素等 活性物质，帮助基因导入细胞。目前聚乳酸( p l a ) ，聚乳酸一乙醇酸共聚物( p l g a ) 等材料包裹药物的微球剂已投入使用。这类材料作为转基因的载体有其优越性： 生物相容性好，无毒副作用；可刺激机体的体液免疫，口服免疫还可引起较强的 粘膜免疫应答；制备容易，具有缓释抗原和佐剂效应；调节微球粒径的大小，对 宿主细胞具有靶向性等。目前多用于疫苗载体的研究有广阔的前景。然而，在实 际应用中，还存在许多问题，微球制备工艺中，需要的有机金属催化剂以及所使 用的有机溶剂、稳定剂的残存可能会在转染中引起不容忽视的副作用。微球包裹 外源基因也可能在制备消毒过程中受损，目前这些问题还在不断的探索当中【l 5 。 聚赖氨酸( p o l y l 1 y s i n e ，p l l ) 是一种多肽类聚合物，单独使用p l l 作为载体， 当p l l d n a 进入浆后易产生聚集，不稳定。h a r a d a 等【1 4 1 用嵌段聚乙二醇( p e g ) 共 聚p l l 阳离子与p e g 嵌段共聚的聚天冬酸阴离子( p e g , p o l y a s p a r t i ca c i d ) 在溶液中 自发形成稳定单分散的聚电解质复合物纳米粒子，内层为聚阳离子聚阴离子通 过静电形成的复合物疏水内核，外层为p e g 亲水链段，被称为聚离子复合物胶束 1 6 1 。该离子复合物胶束可作为基因载体。与p l l d n a 复合物相比，p l l b p e g d n a 复合物更稳定，也更易在细胞中溶解，同时可大大降低对细胞的毒性作 用，提高基因的转染率1 1 。k a t a o k a 等1 1 8 1 用反义核苷酸代替聚天冬酸与阳离子嵌 段共聚物形成阴离子复合物胶束，得到类似结果。k i m 等【1 9 】报道用硬脂酰化聚赖 氨酸，低密度脂蛋白( l d l ) 和基因形成三元复合物，1 h n m r 谱揭示p l l 分子链上 硬脂酰基团与l d l 间存在很强的疏水作用。用琼脂凝胶电泳测试表明硬脂酰化聚 赖氨酸的加入使三元复合物表面正净电荷明显增加。z a u m e r 等【2 0 】试验两种类型 4 第章绪论 非病毒类载体：一种是阳离子脂质体为载体( 1 i p o f e c t a m i n e ) ，另一种聚阳离子为 载体以p l l 为基础并用甘油强化的转铁蛋i 刍( t r a n s f e r r i n f e c - t i o n ) ，测试两种载体在 人成纤细胞中转染率。试验证明用质粒d n a p l l 复合物注射入成纤细胞的浆中， 比单独注射质粒d n a 产生更多数量的细胞表达，很好地解释了聚赖氨酸在细胞 核转运过程中更高水平的转染率。 多聚乙烯亚胺( p o l y e h y l e n i m i n e ，p e i ) 是具有最高正电荷密度的有机大分子。 由于分子中含有大量的亚胺基，p e i 具有很强的缓冲能力，p h 范围宽。在中性水 体系中p e i 能充分质子化，形成“质子棉球”，从而可以捕获d n a 。科学家认为 p e i 是基因治疗的高度有效的载体，可进行体内外寡核苷酸和质粒的传递【2 1 1 。p e i 对基因输送的高效率是由于广泛的溶酶体缓冲作用保护了d n a 不受降解，而随 后的溶酶体肿胀与破裂可使p e u d n a 颗粒释放。p e i 已用于将基因转入鼠肾脏【2 1 l 。 这是病毒介导的基因转移的一种代替方法，可将基因转入肾脏，在肾脏水平修复 遗传缺陷并称之为多聚转染( p o l y f e c t i o n ) 。 合成多肽已用于创建新的转染系统，它不同于脂质体系统，该方法的特点为 不同的功能结合以获得多功能复合物，并且功能类似病毒衣壳。仅含三种特定分 子成分的合成多肽具有基因传递的一般用途，并可在基因治疗的某些应用中替代 病毒载体。机体对这些d n a 组成物几乎没有免疫反应，但是这样基于多肽的系 统进行有效转染需要有丝分裂活动【2 2 1 ，这可能使在靶细胞处于静止时进行的体内 应用受到限制。 1 2 2 3 天然高分子载体 天然高分子生物材料如胶原、透明质酸、壳聚糖、藻酸盐等均用于基因载体 研究，其中壳聚糖及其衍生物在基因释放载体方面研究和应用的较多。壳聚糖是 一种价格较低、生物相容性好、可降解、低毒的阳离子天然高分子聚合物，它易 与d n a 结合，形成聚电解质复合体，使d n a 具有更强的抵抗核酸酶降解能力心引。因 此，壳聚糖及其衍生物可能成为一种安全而有效的阳离子聚合物基因释放载体， 替代病毒和脂质体进行基因转染1 。m u m p e rr j 等将壳聚糖溶液和d n a 溶液混合， 第一次制备出壳聚糖d n a 复合物并用于基因释放研究。他们发现壳聚糖d n a 复合物纳米颗粒的大小与壳聚糖的分子量有关堙5 l ，与溶液的成分无关；另外一 些学者发现，复合物颗粒的大小也取决于壳聚糖与d n a 的配比馏毛矧。壳聚糖与d n a 的配比常用n p ( 氮磷比) 表示，有学者在5 5 。c ，p h 5 5 的硫酸钠溶液中制备壳聚 糖d n a 复合物，发现硫酸钠溶液的浓度对复合物颗粒的大小没有影响；当氮磷 比在3 , - - 8 ，复合物颗粒直径在1 5 0 2 5 0 n m 之间；质粒d n a 的大小( 5 1 11 9 k b ) 对复合物颗粒大小无影响乜引。研究发现，壳聚糖d n a 复合物可抵抗核酸酶的降 第一章绪论 解，转染c o s 1 细胞，以分子量低于l o s d a 的壳聚糖为载体，制备出1 0 0 2 0 0n m 大小的壳聚糖d n a 复合体颗粒，在含有1 0 血清的培养液中，仍有稳定的转染 能力，壳聚糖的分子量对质粒o n a 的转染能力影响很小瞳 。最近，t h a n o um 等发 现，季铵化的壳聚糖( n 一三甲基壳聚糖) 寡聚体d n a ( 含荧光素酶基因的质粒) 复 合物对c a c o 一2 细胞的转染能力比壳聚糖d n a 复合物的转染能力强，前者在含血 清的培养液中转染能力很稳定，其细胞毒性比脂质体要低得多汹1 ，达到医用生 物材料的标准，可见季铵化的壳聚糖寡聚体是一种优良的基因释放载体。将一定 的糖基连接到壳聚糖上，可得到靶向的基因载体系统，乳糖基化的壳聚糖可作为 一种专门转染表达半乳糖特异性膜凝集素的细胞的靶向基因载体，半乳糖基 化壳聚糖可作为转染肝细胞( 表达脱唾液酸糖蛋白受体) 的靶向基因载，这些载 体可用于肿瘤的基因治疗。 除壳聚糖d n a 复合物的大小外，其稳定性、细胞毒性及转染效率也是影响其 临床应用的关键因素。m a o 等发现，在水中储存交联的壳聚糖o n h 复合物可保持 稳定三个月以上，而在同样条件下储存在p b s 中的未交联复合物仅能保持稳定几 小时啪1 。冻干的壳聚糖d n a 复合物可维持其转染效率达四周以上m a c l a u g h li n 等口报道壳聚糖分子量较高时，其与d n a 的复合物在盐和血清中更稳定，且n p 比为2 时最稳定；复合物在c o s - 1 ( 肾细胞) 中，无血清时，分子量为1 0 2 k d a 的壳聚 糖与d n a 形成的复合物具有相对最高的基因表达水平，而在1 0 的血清溶液中， 分子量为5 4 0 k d a 的壳聚糖与d n a 形成的复合物具有相对最高的表达水平，且表达 水平随壳聚糖分子量的降低而降低；在兔小肠内，壳聚糖d n a 复合物基因表达 水平比裸露质粒高得多。r i c h a r d s o n 等嘞1 制备了高纯度低聚壳聚糖及其d n a 复合 物，发现静电作用和氢键是形成壳聚糖d n a 复合物的重要因素；不同低分子量 的壳聚糖均无细胞毒性和溶血活性，其细胞毒性随着壳聚糖分子量的增加而增 加；在n p 比为1 时，复合物可完全抑$ i j d n a s ei i 对d n a 的降解，可能因壳聚糖与 d n a 复合物所形成的三维空间结构所产生的位阻影响。s a t o 等于不同p h 值的血 清介质中通过荧光素酶质粒( p g l 3 ) 转染人肺癌a 5 4 9 细胞，发现p h 为6 9 的转染效 率比p h 为7 6 时高，因为p h 低于7 时，壳聚糖中的氨基被部分质子化，壳聚糖d n a 复合物带正电荷，易与带负电荷的细胞结合；p h 为6 9 ，n p 比为6 9 d 寸的转染效 率比p h 为7 6 时高，5 时转染效率最高，分子量大于i o o k d a 的壳聚糖转染效率低于 分子量为1 5 k d a 和5 2 k d a 的壳聚糖；分子量为5 2 k d a 的壳聚糖和p g l 一3 在n p i ：i 二为5 时形成的复合物在不同血清浓度下转染a 5 4 9 细胞，发现血清含量为2 0 时，复合 物的基因表达比无血清时提高了2 - - - 3 倍，但血清含量为5 0 时会损害细胞，使 转染效率降低。 k s p i n g h s g g a r d 等m 1 制备了完全脱乙酰化单分散的壳聚糖低聚物( 6 ，8 ，1 0 ， 6 第一章绪论 1 2 ，1 4 一聚体) 和脱乙酰度为8 5 的多分散2 4 一聚体壳聚糖低聚物，发现不同壳 聚糖链长、电荷比和缓冲液条件下，噬菌体t 4 d n a 壳聚糖复合物的物理形状也 不同，如卷曲状的，可溶球状的，可溶聚集状的，沉淀球状的，沉淀聚集状的； 卷曲和球状共存的复合物不能有效介导荧光素酶在2 9 3 细胞的体外表达，而球状 或聚集结构的复合物则有较高的表达水平；与其它壳聚糖低聚物相比，只有2 4 一 聚体壳聚糖和高纯壳聚糖( u p c ) 能与d n a 形成稳定的复合物，并有效介导荧光素酶 在2 9 3 细胞的体外表达和在一种6 - 8 周大小鼠的体内表达，且2 4 - 聚体介导的体内、 外基因表达效率均高于u p c ；因此低分子量的2 4 一聚体壳聚糖作基因载体比常规的 高分子量壳聚糖更有优势。与分子量类似，脱乙酰度也是影响基因转染效率的因 素之一，壳聚糖主链上的n 一乙酰基具有疏水性质，会使壳聚糖在水溶液中发生自 聚集，影响壳聚糖与d n a 的相互作用。l e o n g 等b 5 1 制备了不同脱乙酰度( d o ) 的壳 聚糖，发现在血清中的基因表达随d d 的降低而降低可能因低d d 的壳聚糖d n a 复合物稳定性较低，但这种不稳定性却使复合物在肌肉细胞中有较高水平的基因 表达。i s h ii 等m 3 报道影响壳聚糖d n a 复合物在s o j 细胞中转染效率的主要因素 包括壳聚糖的分子量、n p l t 、血清浓度和介质的p h 值等，在n p 比为5 、质粒 d n a 浓度为1 f g m l 时，分子量为4 0 k d a 和8 4 k d a 的壳聚糖与d n a 形成的复合物转染 效率较高，而分子量l k d a 和1l o k d a 的壳聚糖与d n a 的复合物没有发现转染，但分 子量为l k d a 的壳聚糖与d n a 形成的复合物很容易与细胞缔合；分子量为4 0 k d a 壳聚 糖与d n a 的复合物在n p 比为5 时，随着质粒d n a 浓度的增大，复合物的转染效率 增加；在壳聚糖分子量为4 0 k d a 和8 4 k d a 、n p 比为5 、p h 为7 的1 0 血清溶液， 壳聚糖d n a 复合物具有最高的转染效率；研究其与细胞作用机理发现，壳聚糖 d n a 复合物可能凝聚，从而形成一个大的聚集体吸附在细胞表面，它还具有较 高的核酸堆积作用和抑制细胞及核酸酶降解作用。为了进一步揭示壳聚糖介导的 基因转染机理，最近，l i u 等m 1 用分子量为5 k d a 、脱乙酰度9 9 的水溶性壳聚糖 与d n a 形成复合物，壳聚糖的水溶性可保证复合物的稳定性，高脱乙酰度可消除 壳聚糖上n 一乙酰基对壳聚糖与d n a 相互作用的影响，研究复合物的物理化学特征 发现，与壳聚糖作用时，d n a 分子保持着b 型构象；壳聚糖与d n a 的键合能力取决 于介质的p h 值；壳聚糖与d n a 的n p 比强烈影响复合物的形态，在较低n p 比时， d n a 不能被完全包覆在复合物中，在较高n p 比时，d n a 被完全包覆，形成纳米尺 度的球形复合物；壳聚糖与d n a 间特异性作用位点仍不清楚，但p h 值低于壳聚糖 的p k a 时，强烈的静电作用可能会阻止d n a 从载体中的释放，从而抑制细胞核内的 基因表达。从上述一系列研究可以看出，壳聚糖的分子量及脱乙酰度、n p 比、 血清浓度和介质的p h 值等因素对壳聚糖d n a 复合物的大小、稳定性、转染效率 都有一定程度的影响，其中壳聚糖的分子量和n p 比至关重要。但壳聚糖只溶于 7 第一章绪论 醋酸水溶液，醋酸的使用会影响某些细胞的活性；壳聚糖d n a 复合物虽然能够 转染某些细胞，但其转染效率低于市售l i p o f e c ti n 试剂，同时壳聚糖d n a 复合 物对细胞的靶向识别能力有待提高。 许多研究表明壳聚糖能和d n a 形成微囊，可转运治疗性基因和基因疫苗b 卜驯。 r o y 等m 1 报道，壳聚糖d n a 纳米微囊能将所需基因转移到一种对花生过敏的小鼠 肠内，并在其肠道上皮诱导基因表达，有效缓解小鼠的过敏反应。潘善培等制 备了壳聚糖卵透明带d n a 免疫微囊，在体外有效转染h e l a 细胞，用问接免疫荧 光法检测到了卵透明带特异抗原p z p 3 a d n a 在细胞内的表达。为进一步发展更安 全、方便、有效的卵透明带d n a 避孕疫苗打下了基础。刘世贵等1 副用壳聚糖纳 米颗粒包裹小鼠白细胞介素2 基因( m l l 2 2 ) 真核表达质粒( v r m i l 2 2 ) ，肌注接种2 1 d 昆明小鼠，观察m i l 2 2 基因体内表达及其对免疫应答和免疫保护的影响，发现壳 聚糖纳米颗粒包裹v r m i l 2 2 可显著提高外源i l 2 2 基因体内表达水平，明显增强体 液和细胞免疫水平的效应，增强对大肠杆菌的抗病力，可望作为有效的抗感染免 疫调节剂。壳聚糖良好的低免疫性、生物相容性等诸多性质使其成为很有发展前 途的粘膜免疫d n a 疫苗载体。 1 3 作为基因载体的壳聚糖的改性 1 3 1 季铵化壳聚糖 壳聚糖在生理p h 值时不溶，p h 值大于6 时会发生聚集，只有质子化的可溶性 壳聚糖才使细胞膜形成暂短的通道，提高基因跨膜运输效率。为了克服这一缺点， 提高基因转染效率，t h a n o u 等m 1 用低聚壳聚糖与碘甲烷反应，合成了几种壳聚糖 季铵盐( t m o s ) ，研究了季铵度为4 0 ( t m o - 4 0 ) 和5 0 ( t m o - 5 0 ) 的两种壳聚 糖与d n a 复合的能力，及其复合物对细胞的毒性和转染效率。所合成的壳聚糖衍 生物在不同p h 值下都有良好的水溶性，壳聚糖和季铵化低聚壳聚糖与d n a 混合后， 都能自发形成复合物，质粒d n a 低聚物之比为2 1 0 0 0 ( m g m g ) 时形成的复合物 尺寸较小，2 1 0 0 时形成的复合物尺寸较大，且在2 1 0 0 和2 1 0 时，季铵化壳聚糖 与d n a 形成的复合物颗粒都小于未改性的壳聚糖与d n a 形成的复合物颗粒，说明季 铵化改性增强了低聚壳聚糖在中性p h 值下与d n a 的键合作用；壳聚糖d n a 复合物 对c o s - 1 和c a c o - 2 细胞( 上皮细胞) 的毒性和转染实验表明，在c o s - 1 细胞中，与 裸d n a 相比，壳聚糖低聚物可使转染效率提高2 , - - 4 倍，季铵化低聚壳聚糖可使转 染效率提高更多，当d n a t m o 之比从1 6 变化到1 1 4 时，t m o - 5 0 在c o s 一1 细胞中的 转染效率从5 倍增2 h 至1 1 5 2 倍，t m o - 4 0 贝j j 从2 6 倍增加到1 3 1 倍，因此1 1 4 时d n a 与t m o 8 第一章绪论 的最佳比；壳聚糖和季铵化壳聚糖在c a c o 一2 细胞均无毒性。可见，季铵化增强了 低聚壳聚糖对d n a 的复合作用，能大大提高对c o s 一1 细胞的转染效率，且对细胞无 毒，部分季铵化的低聚壳聚糖可用作上皮细胞系的基因转移载体。 m u r a t a 等h 3 州1 在三甲基壳聚糖上引入半乳糖侧链，合成了一系列含有半乳 糖的季铵化壳聚糖，研究了这种壳聚糖衍生物d n a 复合物的形成条件、复合物的 细胞毒性及识别能力，发现半乳糖化程度为5 和2 0 的两种季铵化壳聚糖 ( t c g a l 5 和t c g a l 2 0 ) 与d n a 的复合物对h e l a 细胞的体外实验毒性很低： t c g a l d n a 复合物可识别a p a ( a b r u sp r e c a t o r i u sa g g l u ti n i n ) 外源凝集素，但 识别能力不是太高；随着半乳糖化程度的增加，t c g a l d n a 复合物对a p a # f 源凝 集素的识别能力有所增加。为了进一步提高通过受体介导内吞的基因转染效率， m u r a t a 等制备了一个壳聚糖单元上连接有四条半乳糖链的季铵化壳聚糖 ( t c g a l 4 a 2 0 ) 壳聚糖衍生物d n a 复合物与r c a l 2 0 ( r i c i n u sc o m m u n i s a g g l u t i n i n 一1 2 0 ) 外源凝集素作用的研究发现，不含半乳糖基的季铵化壳聚糖对 r c a l 2 0 外源凝集素表现亲合常数较低，半乳糖化的季铵化的壳聚糖( t c g a l 5 和 t c - g a l 2 0 ) 对r c a l 2 0 # 源凝集素表观亲和常数较高，t c - - g a l 4 a 2 0 的表观亲和常 数最高，并随着半乳糖化程度的增大其表观亲和常数也增大；研究三种半乳糖的 季铵化壳聚糖( t c - ( ；a 1 5 、t c - g a l 2 0 和t c - g a l 4 a 2 0 ) 与d n a 的复合物在h e p g 2 细胞 中表达b 一半乳糖苷酶活力的能力发现三种壳聚糖衍生物的d n a 复合物都能有效 转染h e p g 2 细胞，但在抑制剂存在的情况下其转染效率下降很多，这表明复合物 主要通过h e p g 2 细胞表面的半乳糖受体介导内吞转染。可见，将多个无分支的半 乳糖链引入壳聚糖可增强细胞靶向识别能力，这类半乳糖化的壳聚糖衍生物可作 对肝细胞具有特异性识别能力的基因载体。 1 3 2 糖基化壳聚糖 c h o 等h 6 1 将高分子量壳聚糖( h m w c ) 降解，得到的低分子量( l m w c ) 再与l a 反应制得半乳糖化程度不同的一系列壳聚糖衍生物( g a l l 1 1 i c ) 及其与d n a 的复 合物( h m l | | f c d n a 、l m w c d n a 、g a i - l m w c d n a ) ，对复合物的特性和转染效率作了 详尽的研究和比较。在制备过程中，随着l a 几m w c 摩尔比的升高，g a i - l m w c 半乳 糖化程度呈线性增长趋势，当l a