（遗传学专业论文）拟南芥雄性不育突变体的筛选及相关基因的定位.pdf

上海师范大学硕士毕业论文 拟南芥雄性不育突变体的筛选及相关基因的定位 摘要 花药及花粉的发育是植物有性生殖的基础。目前已发表的雄性不育突变体的基因大 约有2 0 多个，但大部分雄性不育基因还没有被克隆出来。 本研究用e m s 处理拟南芥l e r 野生型种子，筛选获得了9 5 株雄性不育突变体。经过 背景纯化，确定其中6 t i e y c 为单位点隐性突变，并对着6 株突变体进行了定位。这些雄性不 育突变体为深入开展花药和花粉发育分子机理研究奠定了基础。 e c 2 - 2 1 4 为e m s 诱变得到的环境性雄性不育突变体。它的育性受环境湿度的影响， 茎和果荚表现为与野生型不同的亮绿色。扫描电镜的结果显示e c 2 - 2 1 4 的茎和果荚的上 表皮没有蜡质的形成，成熟花粉粒表面的含油层的成分有所变异。通过图位克隆的方法 对e c 2 2 1 4 进行了基因定位，将其定位在拟南芥第一条染色体b a cf 1 0 0 3 至染色体顶部 7 0 0 k b 的区间内。 m s l s 0 2 是通过e m s 诱变所获得的单基因控制的隐性突变体。细胞学分析的结果显 示，突变体在小孢子从四分体释放出后花药绒毡层过早衰亡，小孢子的内容物异常地凝 聚，最终无法形成正常的花粉粒。荧光染色的结果显示，花粉外壁基本骨架存在，但结 构异常，而且没有可见的花粉内壁。用图位克隆的方法对m s l 5 0 2 进行了基因定位，结 果表明m s l 5 0 2 位于拟南芥第四条染色体上分子标记f 2 5 1 2 4 之间4 1 k b 区间内。目前该 区间内尚未见到花药发育必需基因( 不育基因) 的报道，因此m s l 5 0 2 是一个控制花粉 发育的新基因。目前对候选基因的分析和互补实验正在进行当中。本项工作为我们克隆 花粉发育必需基因k l s l 5 0 2 及其深入的功能分析奠定基础。 关键词：图位克隆；花药发育；雄性不育 上海师范大学硕士毕业论文拟南芥雄性不育突变体的筛选及相关基因的定位 a b s t r a c t a n t h e ra n dp o l l e nd e v e l o p m e n ti st h eb a s i sf o rp l a n ts e x u a lr e p r o d u c t i o n a l t h o u g ha b o u t2 0 g e n e sr e q u i r e df o ra n t h e ra n dp o l l e nd e v e l o p m e n th a v eb e e nc l o n e di na r a b i d o p s i s ，m o s t g e n e sr e g u l a t i n ga n t h e ra n dp o l l e nd e v e l o p m e n th a v en o tb e e nc l o n e dy e t a f t e re m st r e a t m e n to fa r a b i d o p s i st h a l i a h al a n d s b e r gs e e d s at o t a lo f9 5m a l es t e r i l e m u t a n t sw e r es c r e e n e d t h e s em u t a n t sw e r ef u r t h e rc r o s s e dw i t hw i l dt y p el a n d s b e r gf o r1 - 3 t i m e o ft h e m ，6m a l es t e r i l em u t a n t ss h o wt ob ec o n t r o l l e db yas i n g l er e c e s s i v eg e n e t h e c o r r e s p o n d i n gg e n e so ft h e s em u t a n t sw e r em a p p e dt oa r a b i d o p s i sc h r o m o s o m e s t h e s e m u t a n t sa r eau s e f o lr e s o u r c ef o rt h ei n v e s t i g a t i o no fm o l e c u l a rm e c h a n i s mo fa n t h e ra n d p o l l e nd e v e l o p m e n t _ e c 2 2 1 4 ，ac o n d i t i o n a l l ym a l es t e r i l em u t a n tf r o me m st r e a t m e n td i s p l a y sas t r o n gg l o s s y s t e ma n df r u i tp h e n o t y p e ，w i t h o u ta n yv i s i b l es i g no fw a xp r o d u c t i o n w a xp r o d u c t i o no n o t h e ro r g a n so ft h ep l a n tw a sa p p a r e n t l yn o ta l t e r e d 。b u te p i c u t i c u l a rw a xp r o d u c t i o ni n w i l d - t y p ep l a n t si sm a i n l yc o n f i n e dt os t e ma n df r u i ts u r f a c ea n dn o tv i s u a l l yd e t e c t a b l eo n o t h e rp a r t so ft h ep l a n t s e l f - f e r t i l i t yw a si n c r e a s e dt ot h ew i l d t y p el e v e lb yg r o w i n gt h e p l a n t su n d e rh i g hh u m i d i t y ( 9 0t o10 0 r e l a t i v eh u m i d i t y ) s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p yo f ap o l l e ng r a i nw i t ht r y p h i n ec o v e n n gi t se n t i r es u r f a c ea n di t sc o m p o n e n ts e e m sa b n o r m a l t h eg e n ew a sm a p p e dt oar e g i o no f a b o u t7 0 0 k bo f c h r o m o s o m e1 i nt h es t u d y , t h ep h e n o t y p eo fa na r a b i d o p s i sm a l es t e r i l em u t a n tm s l 5 0 2w a sd e s c r i b e d ，a n d t h ec o r r e s p o n d i n gg e n ew a sf i n e - s c a l em a p p e d g e n e t i ca n a l y s i si n d i c a t e dt h a tm s l 5 0 2i s c o n t r o l l e db yas i n g l er e c e s s i v eg e n ec a l l e dm s l 5 0 2 c y t o l o g i c a la n a l y s i ss h o w e dt h a tt h e a n t h e rt a p e t u mo f m u t a n td e g e n e r a t e de a r l i e rt h a nt h a to f t h ew i l dt y p ea f t e rm i c r o s p o r e sw e r e r e l e a s e df r o mt h et e t r a d s ，a n dc y t o p l a s mo fm i c r o s p o r e sc o n d e n s e da b n o r m a l l y t h e c o n f o r m a t i o no fe x i n ea n di n t i n ew e r ea l s oa b n o r m a l s ot h em u t a n tc a n n o tp r o d u c ev i a b l e p o l l e n s f o rt h ef u r t h e rg e n e t i ca n a l y s i sa n dt h em a p - b a s e dc l o n i n go f g e n em s i 5 0 2 w eh a v e m a p p e di t t oar e g i o no f4 1 k bb e t w e e nt h em o l e c u l a rm a r k e r sf 2 5 1 2 4a n df 2 4 1 2 4 0 n c h r o m o s o m e4u s i n gm a p b a s e dc l o n i n gt e c h n i q u e t h em o l e c u l a rc l o n i n ga n df u n c t i o n a l a n a l y s i so f t h i sg e n ew i l lb ef u r t h e ru n d e r t a k e n k e y w o r d ：m a p - b a s e dc l o n i n ga n t h e rd e v e l o p m e n tm a l es t e r i l i t y 4 上海师范大学硕士毕业论文拟南芥雄性不育突变体的筛选及相关基因的定位 1 文献综述 1 1 化学诱变法筛选突变体 1 1 1 化学诱变法筛选突变体概述 突变可以自发产生，也可以通过人工诱变产生，但是自发突变的频率很低，而人工 诱变可明显提高变频率。到目前为止，通过人工诱变的方法在很多高等植物中已经发现 了雄性不育突变体( x u ey b2 0 0 0 ，c h a n g y i nw u2 0 0 3 ) 。这些突变包括花药形态、小孢子 发生过程、花粉发育、花粉功能。人工诱变中常用的突变体分离方法有转座子标签法， t - d n a 标签法以及化学试剂处理主要是e m s 处理的化学法。 用化学诱变产生突变体是创造新种质和研究基因功能的有效途径之一。化学诱变是 用化学诱变剂处理作物的植株、种子、花粉、花药、合子或单细胞培养物等，以引起碱 基置换、染色体断裂、基因重组或基因突变等生物学效应，使后代 产生变异，并对突变体进行研究筛选和鉴定的一门现代生物学技术( sa ，r i c kd2 0 0 2 ， w e l l e tj i 1 9 9 3 ) 。 其特点有：可操作性强，简单易行；特异性较强，能诱变定位到d n a 上的某些碱基； 后代较易稳定遗传，一般到f 3 代就可稳定；应用于遗传标记，是细胞融合技术的基础。 诱变剂主要包括4 类，他们的特点、机理和应用如下： 1 、烷化剂：能使一些碱基烷基化，比如使鸟苷酸甲基化，影响m r n a 的转录，从而使蛋 白质的表达紊乱，使得蛋白质重组，而改变了性状。l 临床上应用此类物质作为抗癌药物， 具有强烈杀伤癌细胞的作用，所以在应用在于植物上时，也要注意他的强烈杀伤性。主 要有：甲基磺酸乙酯( e m s ) ，硫酸二乙酯( d m s ) 等。 2 、碱基类似物：分子结构类似碱基，导致d n a 复制时产生错配，m r n a 转录紊乱，功能 蛋白重组，表型改变。该类物质毒性相对较小，但负诱变率很高，往往不易得到好的突 变体。主要有：6 一溴尿嘧啶、6 - b u d r 、马来酰肼、2 一氨基嘌呤等。 3 、嵌入剂：是分子生物学比较常用的一类，诱导率较高。原理是这类分子的大小正好 可以嵌入碱基分子中，导致错配，最常用溴化乙锭( e b ) 。 4 、无机化合物：效果一般，危险眭较小。常用有氯化锂亚，硝酸过氧化氢。 上海师范大学硕士毕业论文 拟南芥雄性不育突变体的筛选及相关基因的定位 1 1 2e m s 的作用机制与作用特点 1 1 2 1e m s 的作用机制 e m s 所诱发的突变是通过以下步骤来完成。烷基化位点主要在鸟嘌岭g 的n 一7 位上， 由于g 上n 一7 的烷基化，使之成为带一个正电荷的季铵基团。这个季铵基团产生两个效 应：一是促进第一位氨基上氢的解离，使g 不再与c 配对而与t 配对，从而造成g ：c a ：t 转换( 见图1 卜1 ) 。二是n 一7 成为季铵基团后，减弱了n - 9 位上的n 一糖苷键，而 产生去嘌岭作用。大部分的无嘌岭位点都可以被无嘌岭内切酶系统所修复，但是有时复 制在修复之前进行，则在无碱基位置上可以插入任何一个碱基，在第二轮复制以后，原 来的g ：c 对可以变为任何碱基对g ：c 、c ：g 、a ：t 、t ：a ，既有转换，又有颠换( 见图 l _ 卜2 ) 。此外，它也可与核苷结构的磷酸反应，形成酯类而将核苷酸从磷酸与糖分子之 间切断，产生染色体缺失( 见图1 卜3 ) 。 图1 卜1n - 7 烷基化鸟嘌岭由于n - 1 位上h 的电离而 与腺嘧啶配对，从而导致g ：ca ：t 转换 图1 1 2n - - 7 烷基化鸟嘌呤通过去嘌呤导致转换和颠换 烷化剂+ 核苷酸的磷酸分子酯类 i 切 i j 断 核苷酸( 磷酸糖) 染色体缺失 目 图1 1 3 烷化剂诱导染色体缺失模式图 b u m s 等报道用e m s 诱导的1 8 4 个大肠杆菌突变，都是单个碱基对改 变，其中1 8 3 个是g ：c 变为a ：t 。l e b k o w 研究表明e m s 诱导的人类5 4 6 上海师范大学硕士毕业论文 拟南芥雄性不育突变体的筛选及相关基因的定位 个突变中有5 3 个也是由g ：c 变为a ：t 。h a k e 等人采用分子遗传学手段， 验证了e m s 诱导的8 个稳定玉米乙醇脱氢酶a d h 突变体均为点突变。这些表 明e m s 诱导的突变主要是点突变( 史桂荣， 1 9 9 0 ：祝丽英，2 0 0 2 ) 。 1 1 2 2e m s 诱变的特点( 游晴如，2 0 0 3 ) 诱变频率较高 b i r d 报道用e m s 处理玉米花粉，突变频率可高达7 8 o 。并且与其它 诱变剂相比，e m s 诱变后产生的显性突变体相对较多，因而易于进行突变体 筛选。 诱变范围广 诱变范围广，出现的突变体类型较多。虽然烷化作用主要引起的是g ：c ， a ：t 碱基对之间的转换，但是同时也可出现其它各种类型的突变体，因而具 有多效性。 诱变效率高 e m s 化学诱变产生的点突变的频率相对较高，而染色体畸变相对较少，生 理损伤小，且容易出现高产、质优的突变体。 1 2 拟南芥花药发育与雄性不育 1 2 1 拟南芥花药发育的过程 十字花科植物种类繁多，在农业生产上有着十分重要的地位。其中多种植物也是植 物学家感兴趣的花药发育研究对象( g e y e r o w i t z ， 1 9 8 7 ：k o n c z ， 1 9 9 2 ) 。尤其是当拟 南芥成为模式植物后，其花药发育的研究更是备受关注和迅速发展。花粉发育包含许多 相互联系的步骤，且极其复杂。 花药的发育可以分为两个过程：第一个过程是花药的形态建成，在这一过程中细胞 与组织发生分化，小孢子母细胞进行减数分裂。在第一个过程结束时，花药中含有大量 的特异性的细胞与组织，并且小孢子四分体包裹在花粉囊中；第二个过程是细胞的衰退 与凋亡阶段，在这一过程中花粉粒发生分化，花药膨大并被花丝托到合适的位置，组织 发生衰退开裂，花粉囊破裂，花粉粒释放( g o l d b e r g ， 1 9 9 3 ) ( 图1 2 1 ) 。按照细胞类型 的不同，花药发育的这两个过程又可以分为1 4 个步骤( s a n d e r s ，1 9 9 9 ) ( 表1 2 1 ) 。 上海师范大学硕士毕业论文拟南芥雄性不育突变体的筛选及相关基因的定位 花原基出现l 1 。l 2 ，l 3 5 l 2 层四个角隔处分化出孢子细胞表皮，孢子细胞 原基细胞变为卵圆形 由孢子细胞分化为初级母细胞与表皮，2 层母细胞 7 初级造孢细胞，进一步分化为二级母细胞l 层造孢细胞 花药呈四角形，维管束细胞开始分化e ，e n ，m l ，t ，v ，c 8 花药形态建成，四个角隔分隔明显e ，e n ，m l ，t v c 93 小孢子母细胞开始分化m m c 小孢子母细胞减数分裂形成花粉母细胞，中间e ，e n m l ，l v c 层开始衰退，绒造层内出现空泡，花药体积变大m c 4 减数分裂完成，四分体结构形成，e ，e n ，m l 。t v ，c 残存中间层细胞tds 胼质层壁破裂 ，j 、孢子释放出来 e ，e n ，t v c ，m s p 1 05 花药继续扩大，j 、孢产生外壁并且小孢 e ，e n ，t v ，c ，m s p 6 - 7 内出现空泡，在电镜下可观察到隔膜细胞 s m 绒毡层细胞开始衰退 e ，e n ，t v c ，m s p ，s m 1 1 1 2 花粉粒开始有丝分裂，绒毡层降解，药室内壁与e ，e n ，t , v , c 。s m8 - 9 连接层细胞开始纤维增厚，s m 开始衰退，s t 层开始分化 s t 花粉粒呈三层，隔膜细胞开裂，花药分为两个药室e ，e n p g , v , c s t 1 0 花药在裂缝处开裂，花粉粒释放e ，e n p g , v c 1 3 1 4 雄蕊开始衰老，细胞与花药结构收缩e ，e n ，v ，c1 5 1 6 雄蕊从衰老的花中脱落下来1 7 图1 2 1 花药发育的过程 8 ，2 3 4 5 6 7 8 9 m 他”m ” 上海师范大学硕士毕业论文 拟南芥雄性不育突变体的筛选及相关基因的定位 1 2 2 拟南芥花药发育的分子机理 至今关于花药发育过程的分子机制所知不多。目前研究这些过程的个主要切入点 是分离鉴定突变体及其对应的基因。近年来，运用筛选育性降低的突变体以及结合反向 遗传学手段已经在拟南芥中鉴定了一系列影响花药发育关键步骤的突变体，成为研究花 药发育的模式植物。 拟南芥基因组测序的完成也使得在基因组范围内研究花粉基因表达概况成为可能。 最近，数篇文章报道了花粉粒转录组的特征，揭示了花粉和其他植物组织基因表达的巨 大差异。通过用a t h l 基因芯片对花粉和孢子体组织的比较分析 确定了其中1 0 或4 0 的花粉表达m i 讣i a 是花粉特异的。这些研究使已知的花粉表达基 因的数目增加了5 0 倍，并且鉴定了许多潜在的花粉特异表达基因。近来收集到的已经克 隆的不同的小孢子和花粉表达基因大约有1 5 0 个，有确凿证据证明在花药中特异表达的 约有3 0 个这些基因在花粉发育的各个阶段发挥功能，被分为1 6 个功能组，其中不乏有多 个大功能组。如胶质降解酶、细胞骨架蛋白、转录因子和蛋白激酶等调控蛋白。 与花粉发育起始相关的基因 小孢子的发生开始于花药下表皮细胞的分化并形成孢原细胞。后者继续分化成孢子 囊并进行减数分裂。花粉的形成依赖于花药中两种细胞类型目l a d , 孢子母细胞和绒毡层 细胞的分化和互作。小孢子母细胞发育成小孢子，而绒毡层细胞在支撑小孢子发育为成 熟花粉粒的过程中发挥重要作用。 拟南芥s p l 基因被认为是小孢子发生起始所必需的。在s p l 突变体中，花药下表皮 细胞能够形成孢原细胞，但是后来不能形成小孢子母细胞。在s p l 花药中，花粉壁和绒 毡层的形成被破坏，造孢细胞和初生周缘细胞的进一步发育被阻断。s p l 仅在花药造孢 细胞和小孢子母细胞中表达。推测该基因最主要的功能可能是促进孢子囊的形成，并且 很可能间接地影响了花药壁的发育，这暗示花药壁和绒毡层的发育依赖于小孢子母细胞 的信号，在没有信号时，花药孢子体的发育就不能进行。 从拟南芥中分离的参与绒毡层发育的两个基因e m s l 芹1 1 t p d l 也为这种信号转导作用 的存在提供了证据。这两个基因的突变均引起绒毡层细胞的前体发育成小孢子母细胞而 不是绒毡层。基于e m s l 平h t p d l 基因在绒毡层发育的遗传功能上的相似性和突变引起的表 型上的类似性，e m s i * ! t p d l 基因被认为可能参与了同一条发育路径。 与减数分裂相关的基因 9 圭查塑蔓盔兰堡主望些堡三 型堕茎堡丝至堕窒壅堡塑堡垒墨塑茎兰里竺塞竺 小孢子母细胞的形成只是完成了多细胞体向单细胞状态的转变，小孢子的形成还必 须经过减数分裂。这个过程包括d n a 复制、染色体配对和联会复合体( s c ) 形成等事件， 其复杂性表明这个多步骤的过程包含许多严格受调控的基因。 拟南芥a s k l $ 口a s k 2 株系表现出同源染色体分离的失败。a s k l 和a s k 2 基因在编码的 氨基酸顺序和表达模式上都非常相似，但爿s k 2 只有在过表达的情况下才部分代替a s k l 的作用。a s k l 与酵母s k p l 基因同源，s k p l 基因在调控有丝分裂细胞周期中发挥重要作 用。直到现在，还不知道s k p l 是否也是减数分裂所必需的，但它可能通过降解或去除细 胞分裂前期同源染色体联合必需的一种蛋白质而调控同源染色体分离。 m s 5 雄性不育突变体在四分体阶段产生的小孢予多于4 个，m s 5 d 、孢子母细胞开始表 现正常，但很快就降解。进一步的细胞学研究发现m s 5 d , 孢子母细胞进行了两次正常减 数分裂，但在减数分裂的末尾细胞进行了第三次分裂却没有进一步的d n a 复制。用 r t p c r 方法检测到m s 5 在减数分裂和非减数分裂组织中都有表达，但原位杂交表明m s 5 转录仅在减数分裂的细胞中出现，它在小孢子母细胞开始分裂时富集，但在四分体形成 前就降解。 与绒毡层发育相关的基因 t a z l 显示出一个两阶段的发育模式，在减数分裂的前期阶段，其转录本在绒毡层和配 予体组织及花药的所有细胞类型中都积累，而在花药发育的后减数分裂阶段专一在绒毡 层中表达。通过共抑制沉默，t a z l 导致绒毡层不正常发育和绒毡层的过早降解。大量 的小孢子从四分体释放不久就败育，几个幸存下来的花粉粒黄酮醇积累减少，不能形成 花粉壁，萌发率低表明t a z l 在绒毡层发育的后减数分裂阶段具有重要作用。同样，拟 南芥m s l 也引起绒毡层的提前解体，导致完全的雄性不育。虽然t a z l 与m s l 缺乏明显的 结构相似性，但两者的表达模式很类似。m s l 与t a z l 一样，转录的积累是在小孢子母 细胞减数分裂完成。单个小孢子从四分体分离时开始的。显示出一个两阶段的发育模式。 在减数分裂的前期阶段，其转录本在绒毡层和配子体组织及花药的所有细胞类型中都积 累，而在花药发育的后减数分裂阶段专一在绒毡层中表达。 1 2 3 拟南芥花粉壁的形成与结构 在四分体的后期已开始壁的发育。首先是在包围它们的胼胝质壁与小孢子的质膜之 间出现纤维素的原外壁( p r i m e x i n e ) ，这是其后沉积孢粉素外壁的模板。最初沉积的孢 粉素是由小孢子合成，主要是高尔基体和内质网的活动，它们在壁物质的合成和壁前体 1 0 圭塑塑蔓查堂婴主望些堡苎型堕堑堡丝! ：宣窒壅笪竺堕垄墨塑茎茎里塑星焦 转移中起决定的作( m a s c a r e n h a s ，1 9 9 0 ) ( b e d i n g e r ，1 9 9 2 ) 。当小孢子从胼胝质壁释放 后，由绒毡层产生的孢粉素参与构成外壁。 组成花粉外壁的主要成分是孢粉素，它是类胡萝h 素及类胡萝h 素酯的氧化多聚化 的衍生物，性质坚固，抗酸和抗生物分解( h e s l o p h a r r i s o n ，1 9 7 1 ) 。外壁在基柱( p i l u m ) 之间的空隙通向外部，通常在表面的腔或间隙中充满花粉覆盖物。这些粘性的物质可使 花粉相互粘结成块，有助于传粉媒介携带至柱头的表面。花粉覆盖物也称花粉鞘 ( p o l l e n k i t t ) 和含油层( t r y p h i n e ) ，含脂类、胡萝h 素或花青素等物质，是绒毡层细胞 分泌的物质( m a s c a r e n h a s ，1 9 9 3 ) 。细胞化学和x 一射线微区分析研究表明，花粉外壁 还含有一些角质、木质素及1 左右的硅质。花粉内壁位于花粉外壁的里面，较薄，其 主要成分是果胶纤维素，通常在外壁建成后发育。它与体细胞的初生壁相似。在内壁中 有花粉细胞质通过的胞质小管。 此外，无论是外壁和内壁都存在着大量有活性的蛋白质( m oe ta 1 ，1 9 9 2 ) 。外壁 蛋白质由孢子体的绒毡层细胞合成，沉积于花粉外壁的腔中；内壁蛋白质由花粉本身的 细胞合成，是配子体基因表达的产物，伴随花粉内壁的发育，小孢子质膜形成小管状结 构，进入内壁中，内壁蛋白分布在这些小管状结构内，特别是在萌发孔附近。花粉壁蛋 白分为两类，一类是“识别蛋白”，在授粉和受精作用中与柱头间进行识别反应，这种 识别反应在不亲和性方面起着决定的作用。另一类是酶，特别是水解酶。但外壁和内壁 上酶的分布有明显不同。如核糖核酸酶、酸性磷酸酶仅存在于内壁；而琥珀酸及n a d h 脱氢酶、蛋白酶仅存于外壁。 图1 2 2 花粉壁的结构 1 2 3 植物蜡质基因的研究进展 蜡质是长链脂肪酸代谢途径产物的混合物，重要功能是降低通过植物表面的水分 散失，此外，蜡质还在防止紫外线辐射伤害、抵抗病虫害的侵入方面起重要作用，也有 l l 圭查堕垄查兰堕圭兰些堡茎垫塑茎竺丝至蔓壅壅竺塑堕垄墨塑茎薹里堕塞堡 研究报道蜡质含量与花粉育性有关( a a r t s1 9 9 5 ，h a n n o u f a1 9 9 3 ，p r e u s s ，n e g r u k ，x i a1 9 9 6 ) 。 拟南芥被作为研究遗传学和分子生物学的一种模式植物，而且拟南芥具有典型的蜡质层 结构及组分。因此，在研究植物表皮蜡质产物的遗传性和分子生物学特性上也无疑是个 模式系统。 d e l a e r t 等于1 9 7 9 年报道了第1 个拟南芥角质层蜡质突变体，并取名为 e c e r i f e r u m ( c e r ) ，它的拉丁文意思就是没有蜡质。k o o m e e f 等于1 9 8 9 年研究发现了第l 对等位基因，并报道了化学诱变产生2 1 个新的隐性位点。近年来的借助于插入突变方法 和拟南芥基因组测序的完成加快了新突变体筛选和基因克隆的步伐。蜡质层缺陷或发生 改变的突变体可以通过它们的无白粉状或者是否有光泽的外表鉴定出来。目前根据拟南 芥茎杆表面粉状白色蜡质层缺失突变已筛选出1 2 0 多个上表皮层突变体，代表3 2 个隐性 突变位点。这些突变体除表现出蜡质组分变化外，有些还有其他性状变异。女l c e r l 、c e r 2 、 c e r 3 、c e r 6 等表现出低湿度条件花粉不育，因为花粉粒含油层中的蜡质在植物受精过程 中的花粉柱头相互作用中必不可少，但其育性在高湿度条件下可部分恢复；w a x 、d e d 、 c e r l o s d c e r 突变体表现出器官融合等。 花粉成熟后，它的新陈代谢停止，并呈干粉状，一般含水量为1 5 一3 5 当它落在湿 润的柱头上，花粉周围立即被水包围，花粉的含水量增加并萌发：但是当花粉落在干燥 的柱头上，花粉必须依靠花粉壁的含油层所形成的界面利用水势的梯度从柱头吸收水分 及营养物质。拟南芥属于干燥型柱头，一旦长链脂肪酸的代谢途径受阻，就会影响到花 粉表面含油层的形成，进而大大降低花粉在柱头上的水合作用，从而导致植物雄性不育。 在已被克隆的影响角质层的基因中，根据序列分析和功能预测可分为调控基因、编 码代谢酶的基因、蜡质运输相关基因等类型。 参考文献 x u eyb ，x uzh 2 0 0 2 a ni n t r o d u c t i o nt ot h ec h i n ar i c ef u n c t i o n a lg e n o m i c sp r n g r a m c o m pf u n c t g e n o m e ，5 0 ：3 7 9 3 9 1 c h a n g y i n w u ，x i a n g i l l l l l i ，w e n y a y u a n 2 0 0 3 d e v e l o p m e n to f e n h a n c e r l i n e s f o r f u n c t i o n a la n a l y s i s t h ep l a n tj o u r n a l ，3 5 ：4 18 4 2 7 sa ，r i c kd ，l a nth 2 0 0 2ad r a f ts e q u e n c eo f t h er i c eg e n o m e ( o r y z as a t i v a ) s c i e n c e ，2 9 6 ：9 2 1 0 0 1 2 上海师范大学硕士毕业论文拟南芥雄性不育突变体的筛选及相关基因的定位 w e l l e rj l ，r e i djb 1 9 9 3 p h o t o p e r i o d i s ma n dp h o t o c o n t m 】o f 吼e me l o n g a t i o ni nt w op h o t o m o p h o g e n i c m u t a n t s p l a n t a ，1 8 9 ：1 顺佳清1 9 8 6 植物生物化学技术和方法( 稻米淀粉含量测定) m 北京：中国农业出版社，2 5 3 2 5 6 朱旭东，罗达，张建军2 0 0 3 水稻中花u 辐射突变体的分离与鉴定 j 中国水稻科学，( 3 ) ：2 0 5 2 1 0 史桂荣，曲章义1 9 9 0 e m s 与玉米诱变育种国外农学，1 ：1 5 祝丽英，池书敏，刘志增2 0 0 2 e m s 对玉米花粉诱变效应的研究河北农业大学学报，2 5 ：1 7 2 8 游睛如，黄庭旭，张水金2 0 0 3 植物诱变新技术及其在水稻育种上的应用江西农业学报，l5 ( 2 ) ： 4 3 4 7 k o n c zc ，c h u anh ，s c h e l lj 1 9 9 2 m e t h o d si na r a b i d o p s i sr e s e a r c h w o r l ds c i e n t i f i cp u b l i s h i n gc o p t e l t d m e y e r o w i t z e m 1 9 8 7 a r a b i d o p s i s t h a l i a n a a n n u r e v g e n e t 2 1 ：9 3 1 1 1 g o l d b e r grb ，b e a l stp s a n d e r spm 1 9 9 3 a n t h e rd e v e l o p m e n t ：b a s i cp r i n c i p l e sa n dp r a c t i c a l a p p l i c a t i o n s p l a n t c e l l ，5 ：1 2 1 7 - 1 2 2 9 s a n d e r spm ，l e epy b e a l stp ，g o l d b e r grb 2 0 0 0 t h ea r a b i d o p s i sd e l a y e dd e h i s c e n c e l g e n ee n c o d e sa ne n z y m ei nt h e j a s m o n i ca c i ds y n t h e s i sp a t h w a y p l a n tc e l l ，1 2 ：1 0 4 1 1 0 6 1 m a s e a r e n h a sjp 1 9 9 0 g e n ea c t i v i t yd u r i n gp o l l e nd e v e l o p m e n t a n n u r e v ，pl a n tp h y s i 0 1 p l a n tm 0 1 b i 0 1 ，4 1 ：3 1 7 3 3 8 b e d i n g e rp ，1 9 9 2 t h er e m a r k a b l eb i o l o g yo f p o l l e n p l a n tc e l l ，4 ：8 7 9 8 8 9 h e s l o p - h a r r i s o nj 1 9 6 8 t a p e t a lo d g i no f p o l l e n c o a ts u b s t a n c e si nl i l i u m n e wp h y t o l 。6 7 ：7 7 9 - 7 8 6 m a s e a r e n h a sj p 1 9 9 3 m o l e c u l a rm e c h a n i s m so fp o l l e nt u b eg r o w t ha n dd i f f e r e n t i a t i o n p l a n tc e l l 5 ： 1 3 0 3 一1 3 1 4 m oy ；n a g e lc ，a n dt a y l o rl p ，i9 9 2 b i o c h e m i c a lc o m p l e m e n t a t i o no fc h a l c o n es y n t h a s em u t a n t s d e f i n e sar o l ef o rf l a v o n o l si nf u n c t i o n a lp o l l e n p r o c n a t l a c a d s c i u s a 8 9 ：7 213 - 7 217 a a r t s ，m g m 。，k e i j z e r , c js t i e k e m a ，w j 8 n dp e r e i r a ，a ( 1 9 9 5 ) m o l e c u l a rc h a r a c t e r i z a t i o no f t h e c e r ig e n eo f 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7 一】4 5 x i a ，y ，n i k o l a u ，b j ，a n ds c h n a b l e , e s ( 1 9 9 6 ) 。c l o n i n ga n dc h a r a c t e r i z a t i o no f c e r 2 ，a na r a b i d o p s i s g e n et h a ta f f e c t sc u t i c u l a r w a xa c c u m u l a t i o n p l a n tc e l l8 ，1 2 9 1 1 3 0 4 4 上海师范大学硕士毕业论文 拟南芥雄性不育突变体的筛选及相关基因的定位 2 材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 植物材料 野生型拟南芥r a b i d o p s i st h a l i a n a ) ，生态型c o l u m b i a ( c 0 1 ) ，生态型l a n s b e r g e r e c t a ( l e o ，突变体e c - 1 5 0 2 , e c - 2 1 4 ( 中科院上海植物生理生态研究所黄海研究员惠赠) 2 1 2 主要仪器 s t s 2 型脱色摇床 微量可调移液器p 1 0 、p 1 0 0 、p 2 0 0 、p 1 0 0 0 凝胶成像 水浴锅 灭菌锅 恒温培养箱h z 一9 2 11 k 隔水式恒温培养箱 超低温冰箱 超净工作台 电泳槽 电泳仪 p t c 1 0 0p c r 仪 台式低温高速离心机z 3 8 3 k 样品分析仪 1 6 1 2 1 型高速离心机 电击仪 光学显微镜e 8 0 0 上海天能 g i l s o n 上海天能 上海恒科 上海博迅 上海恒科 上海博迅 日本s a n y o 上海博迅 华美、天能 天能 美国 德国h e r m l e 德国 上海金钟 德国 日本 上海师范大学硕士毕业论文拟南芥雄性不育突变体的筛选及相关基因的定位 2 2 实验方法 2 2 1 拟南芥的种植 拟南芥在4 中春化2 4 天后培养在黑土；蛭石：珍珠岩( 1 ：6 ：o 2 5 ) 的混合土中。 培养时在其上层罩一层塑料膜以保持湿度，当拟南芥长出第一片叶子后去掉塑料层。植 物生长环境为相对湿度8 0 ，恒温2 2 2 4 ，光照周期为1 6 小时光照，8 小时黑暗，光 照强度8 0 2 0 0p m o l m 2 s 的人工气候室。 p n s 营养液配方： 5m mk n 0 3 0 0 1m mc o c l 2 2 0m mc a ( n 0 3 ) 2 2 0m mm g s o 。 5 0m mf e e d t a 2 5m mk h 2 p o 。( a d j u s t e dt op h6 5 ) 7 0m mh j b 0 30 5m mc u s 0 4 0 2m mn a 2 m o o 1 0m n a c l 1m mz n s 0 41 4m mm n c l ， 2 2 2e m s 化学诱变 利用甲基磺酸乙( e m s ) 处理拟南芥种子时，先用蒸馏水浸泡种子4 8 小时，换i o m m 及1 5 m me m s 溶液浸泡于脱色摇床上缓慢震荡( 约1 5 小时) ，清水冲洗5 6 遍，然后于 0 1 的a g r o s e 中春化3 天。种于大盆中，1 6 h 光照2 2 度培养。 步骤： 1 每2 0 0 0 粒l e r 种子于1 3 m l 离心管中，加5 m ld d i _ 2 0 ，浸泡4 8 h 。 2 浸泡后，每管加e m s7 9 6 ul ，混匀后于脱色摇床上缓慢震荡处理1 5 h 。 3 小心倒去处理液，清水冲洗5 6 遍。 4 于0 1 的a g r o s e 中春化3 天。 5 。用l m l 枪头将种子种于大盆中，每盆约5 0 0 粒。t 6 h 光照2 2 度培养。 2 2 3 拟南芥雄性不