（遗传学专业论文）丙酮酸高产菌株的选育及其发酵条件研究.pdf

关子学位论文独立完成和内容创新的声明 本一向河南大学提出硕士学位串请。本人郑重声明：所呈交酌学t 主论夏置 蠢人在导师鹋指导下独立完盛的，对所研究酌浑题有新的见解。褥裁所知睁 支中特别加以说明、标注乖致谢的地方外，论文中不包括其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包括其他人为获得任何教育、科研机构鲋学位或证韦而 段保存、汇编孝住论文( 纸质支车争宅亍文本) 。 ( 涉及保密内晷的学垃论文在解霍后适用不授权丰) 学位获得者( 学位论交作者) 鍪名： 强鹑埠 2 d 。7 上6 月。p 臼 学住论文摧导教师茎名：拓各互置 2 。7 卑6 月枷臼 河南大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 中文接要 丙酮酸是一种用途十分广泛的有机酸，用传统的化学合成法进行生产，成本高、工艺复 杂、污染严重，而发酵法生产则成本低、工艺简单，基本没有污染，更加有利于工业生产。 该文对丙酮酸发酵菌种进行筛选并对其摇瓶发酵工艺进行了研究。 作者以t o r u l t ”p s i s g l a b r a t a t k l 0 1 为出发菌株，采用诱变育种、代谢工程育种等方法，筛 选到的突变株r g l a b r a t a t k 4 1 8 ，是盐酸硫胺素、烟酸、盐酸吡多醇，生物素等四种维生素的 渗漏缺陷型，具有卢氟代丙酮酸，口脱氧葡萄糖抗性，具有较低的乙醇脱氢酶活性。 采用t t c - c a c 0 3 复合平板法筛选出产酸多、a d h 酶活力弱、发酵副产物少的目的菌株； 用正交实验法确定了摇瓶发酵条件，即以葡萄塘为碳源，浓度1 0 6 9 l ；硫酸铵为唯一氮源， 浓度s g l ；碳氮比2 5 ：1 、发酵时间4 0 h r 、残耱浓度o 8 0 9 ，l 、丙酮酸产量为5 8 2 0 9 ，l 较出发 菌株提高了3 5 6 0 ，生产强度1 4 6 9 ( l h ) ，转化率5 5 4 3 。 采用b o x - b e h n k e n 中心组合设计和响应面分析法，并结合s a s 统计软件，确定了最优的 维生素浓度组合：盐酸硫胺素0 0 1 2 5 m g l 、烟酸9 7 m e , 几、生物素0 0 2 2 m g l 、盐酸砒哆酵 0 5 4 m g l r 并确证盐酸硫胺素是最重要的影响因素， 实验还设计出一种快速筛选丙酮酸离产菌株的筛选方法，在短期内完成大量菌株的筛选 工作，大大减轻了工作量，同时也节约了大量的物科，降低了发酵成本。 关键词：丙酮酸、菌种选育、发酵条件 丙酮酸高产菌株的选育与发酵条件研究 a b s t a c t p y r u v i ca c i di sa ni m p o r t a n to r g a n i ca c i de x t e n s i v e l yu s e di ni n d u s t r y c o m p a r e dw i t hc o n v e n t i o n a lm e t h o d s ，b i o l o g i c a lf e r m e n t a t i o np r o c e s si sf o u n dt ob el e s se n e r g yi n t e n s i v ea n dm o r e e n v i r o n m e n t a lf r i e n d l y , a n dn o w a d a y sm o r ea n dm o r ea t t e n t i o n sa r eb e i n gp a i do ni t sf e r m e n t a t i v e w a y a c c o r d i n gt ot h et h e o r yo f m e t a b o l i cc o n t r o lf e r m e n t a t i o n ，t h ed i s s e r t a t i o nm a i n l yf o c u s e so n t h eb r e e d i n go f h i g h p y r u v a t e - p r o d u c i n gm u t a n ta n di t sf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s o n eh i g h - p y r u v a t e - p r o d u c i n gs t r a i nt o r u l o p s i sg l a b r a t at k 4 1 8w a ss e l e c t e df r o mo r i g i n a l s t r a i nz g l a b r a t a t k l 0 1b y m e a n so f m u t a g e n i c t r e a t m e n t w i t h u v a n d m e t a b o l i cc o n t r 0 1 i t s g e n e t i cl a b e l sa r et h ea u x o t r o p ho f n i c o t i n i ca c i d ，t h i a m i m h c i ，b i o t i n ，a n dp y f i d o x i n e h c la n d 口f pa n dd g r e s i s t a n tm u t a n t i tw a sa l s oal o wa d he l l z y m ea c t i v i t y t h eb a t c hf e r m e n t a t i o nm e d i u m sa n dc o n d i t i o n so fzg l a b r a t at k 4 18i ns h a k ef l a s kw e r e s t u d i e d t h ef a c t o r s , s u c ha ss e e dm e d i u m ，f e r m e n t a t i o nm e d i u ma n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r e d e t e r m i n e d t h ei n i t i a lg l u c o s ec o n c e n t r a t i o nw a s1 0 6 9 l ，( n h 4 ) 2 s 0 4 ，8 9 儿t h ec a r b o na n d n i t r o g e nr a t i ow a s2 5 ：1 ，p y r u v a t el m x l a c t i o n5 8 2 0 9 ，la n d c o n v e r s i o n r a t e5 5 4 3 w e r ea c h i e v e d a f t e r 4 0 h r b a t c h f e r m e n t a t i o n i ns h a k e f l a s k o n t h es u p e r c o n d i t i o n s a n d p r o d u c t i v i t y o f l 4 6 9 ( l h 1 b yu s i n gb o x - b e h n k a nc e n t e r - u n i t e dd e s i g na n dt h em e t h o do f r e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i s t o g e t h e rw i t hs a ss y s t e m , t h eo p t i m u mc o n c e n t r a t i o nc o n d i t i o n so f t h i a m i n e ，n i c o t i n i ca c i d ，b i o - t i n ，p y r i d o x i n ew h i c hw e r es e l e c t e da r e0 0 1 2 5 m g l ，9 7 m g r t ，o 0 2 2 m g la n d0 5 4 m g l a n d t h i a m i n ew a sc o n f i r m e dt ob et h em o s ti m p o r t a n tf a c t o ra f f e c t i n gt h ep r o d u c t i o no f p y r u v i ca c i d i td e s i g n e daw a yt h a tc a ne a s i l ys c r 啪h i g h - p y r u v a t e - p r o d u c i n gs t r a i n i ti sai n t e l l i g e n t l y s e l e c t e dm e t h o dw h i c hc a l lh i g i l l yi m p r o v et h ee f f i c i e n c yo f s t r a i ns c r e e n i n g t h ep r i n c i p l ec a nb e d e s c r i b e da st h ef o l l o w i n g ：o nt h ec a c 0 3m e d i u m ，at r a n s p a r e n tr i n gc a nb ee x h i b i t e db a s e do n t h er e a c t i o no f p y rp r o d u c e db yt h es t r a i na n dc a c 0 3i nt h em e d i u mf o rp y r u v a t e c a l c i u mi sa k i n do f s o l u b l es u b s t a n c e ，i ti so b v i o u s l yt h a tt h eh i g h - p y r u v a t e p r o d u c i n gs t r a i nh a sab i g g e r d i m e n s i o no f t h et r a n s p a r e n tr i n g o nt h eo t h e rh a n d c o l o rr e a c t i o nb e t w e e nt t ca n d a d hi n d i c a t et h ee n z y m ea c t i v i t i e sw h i c hh a v eap r o p o r t i o n a lr e l a t i o nw i t hc o l o r , o u ro b j e c ts t r a i ni sa w e a k - a d h - e n z y m e - a c t i v i t i e st y p ew i t haw e a km e t a b o l i cf l u xf r o mp y r t oa l c o h 0 1 s ot h ew h i t e c o l o rs t r a i nm a yb et h er i g h tc h o i c e k e yw o r d s ：p y m v i ca c i d ，s t r a i nb r e e d i n g , f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n 2 河南大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 l 前言 1 1 概述 丙酮酸【1 】( p y n l v i ca c i d ) ，又称2 - 氧代丙酸( 2 - o x o p r o p a n o i ca c i d ) 、a - 酮基丙酸 ( a - k e t o p r o p i o n i ca c i d ) 或乙酰基甲酸( a 嘣 y l f o r m i ca c i d ) ，为无色至淡黄色液体，呈醋酸香 气和愉快酸味，是最重要的a 氧代羧酸之一。 丙酮酸不仅在生物能量代谢中具有十分重要的作用，而且是多种有用化台物的前体，用 途极为广泛伫l ，如：( 1 ) 制药工业：用于酶法合成l - 色氨酸、l 酪氨酸、l 多巴；合成l 半 胱氨酸、l 甍氨酸、维生素b 6 和b 1 2 等；与乳酸、锂构成人工胰脏，作为体外传感器测定葡 萄糖的含量。( 2 ) 生化研究：用于伯醇及仲醇的检定；转氨酶的测定；是脂肪族胺的显色剂 等。( 3 ) 农用化学品1 3 1 ：合成乙烯系聚合物、氢化阿托酸、谷物保护剂等多种农药的起始原料。 ( 4 ) 细胞培养：与乳酸组成抗氧化剩，降低对细胞的伤害；是动物细胞培养的重要底物。( 5 ) 食品s e ! l k t 4 ：g b 2 7 6 0 1 9 9 6 规定为酸味添加剂。近年来由于在减肥上有特效而受到西方消费者 青昧。 丙酮酸作为一种化工产品，早已实现了工业化生产，主要生产方法如下所示： ( 1 ) 酒石酸脱水脱羧法 h o w a r da n df r a s e r t 5 于1 9 3 2 年开发，沿用至今；此法优点1 6 1 是工艺简单易行：将酒石酸与 硫酸氢钾混合物在2 2 0 ( 7 下蒸馏，馏出物再经真空精馏即可得到丙酮酸。其主要缺点是：丙酮 酸产率较低( 对酒石酸质量产率为0 2 9 - 0 3 0 9 g ) ；得到1 9 丙酮酸需要消耗5 9 硫酸氢钾。以 目前酒石酸( 1 5 万元吨) 和硫酸氢钾( 0 6 万刃吨) 的市场价格计算，仅原料成本就至少需 要8 万元，吨，为此，在很长一段时间内，丙酮酸的价格居高不下，应用也受到限制。以丙酮 酸在食品工业中的应用为例，尽管它是一种很有潜力的酸味剂，但由于其在价格上与其它有 机酸相比过于昂贵。因此，几乎没有厂家愿意在饮料或食品中添加丙酮酸来改善风味。 ( 2 ) 乳酸转化法 用乳酸作原辩氧化脱氢步法生产丙酮酸门。其反应式为： c h 3 c h o h c o o h + 1 20 2c h 3 c o c o o h + h 2 0 但是从乳酸直接制取丙酮酸非常困难，这是因为在一般情况下，乳酸中cc 键断裂形成乙醛 3 丙酮睃高产菌株的选育与发酵条件研究 和二氧化碳比氧化脱氢形成丙酮酸要容易得多，其反应式为： c h 3 c h o h c o o h + 1 20 2c h 3 c h o + c 0 2 + h 2 0 为了提高产品的收率和选择性，必须采用合适的催化剂来改善此反应。可以选择工业催化剂 如：p b p d 、磷酸铁盐、银、钒等；也有用生物酶的，如复旦大学开发的乳酸氧化酶转化法等， 其成本也较高约为5 万元，吨。 ( 3 ) 发酵法 发酵法【8 j 生产丙酮酸研究已有5 0 年历史。然而，由于丙酮酸高产菌株选育十分困难，尽 管有些微生物能够积累丙酮酸，但其产量( 质量浓度) 无法达到工业化的要求。发酵法生 产丙酮酸真正取得突破，是在1 9 8 8 年。当时，日本东丽工业株式会社( f o r a yi n d u s t r i e sl n c ) 的研究人员宫田令子( m i y a t a r e i k o ) 和米原辙f 9 1 ( y o n e h a r a t e t s u ) 选育出一系列丙酮酸产量 超过s o e c l 的球拟酵母( t o r u l o p s i s ) 菌株，使得发酵法生产丙酮酸的工业化成为可能。1 9 9 2 年，日本开始采用发酵法生产丙酮酸，产量为4 0 0 吨，年，成本约为2 - 3 万元吨。 1 。2 丙酮酸发酵生产研究进展 1 2 1 产丙酮酸的菌种介绍 能直接产生丙酮酸的菌种主要有以下各属f 1 0 】i n ： ( 1 ) 细菌及放线菌：a c i n e t o b a c t e r ( 不动杆菌属) ，s c h i z o p h y l l u m ( 裂褶菌属) ，e n t e r o b a c t e r ( 肠杆菌属) e n t e r o c o c u s ( 肠球菌属) ，e s c h e r i c h i a ( 埃希氏菌属) ，p s e u d o m o n a s ( 假单孢菌 属) 。 ( 2 ) 酵母菌：d e b a r y o m y c e s ( 德巴利酵母属) ，c a n d i d a ( 假丝酵母属) s a c c h a r o m y c e s ( 酵 母属 ，t o r u l o p s i s ( 球拟酵母属) 等。 1 9 9 4 年，y o n e h a r a l l 等筛选出1 株丙酮酸高产菌株t o r u l o p s i sg l a b r a t ai f 0 0 0 0 5 ，发酵5 9 h r 丙酮酸积累量达5 7 o g t , ，随后进行分批补料实验经6 h 流加发酵丙酮酸产量达6 7 8 9 ，l ，转化 率0 4 9 9 g ：同年v o k o t a t l 3 1 报道了1 株f 1 2 a t p 酶活力缺乏的e c o l i 突变株，经2 4 h 发酵，丙 酮酸产量达3 0 9 l ，转化率0 6 9 g ：李寅也选育到丙酮酸高产菌株t o r u l o p s i sg l a b r a t a w s h 2 i p 3 0 3 ，据研究该菌株与t g l a b r a t ai f 0 0 0 0 5 相比，其独特之处在于能够很好地利用无机 氮源，如氯化铵和尿素。 4 河南大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 1 2 2 丙酮酸的诱变育种与代谢控制育种 诱变育种f l ”，是以诱变剂诱发微生物基因突变，通过筛选突变体，寻找正向突变菌株的 种诱变方法。天津科技大学以z g l a b r a t a t p l 9 ”l 为出发菌株经甲基磺酸乙酯及紫外诱变得到 t g l a b r a t at p 2 0 4 ，发酵产酸3 8 7 9 l ，该菌株是硫胺索、生物素、毗哚醇、烟酸四种维生素 的缺陷型。 代谢控制育种6 1 ，是以诱变育种为基础，获得各种解除或绕过微生物正常代谢途径的突 变株，从而人为地使有用产物选择性地大量生成积累，打破了微生物调节这一障碍。代谢控 制育种的崛起标志着育种发展到理性阶段，目前高产丙酮酸菌株选育在代谢控制育种方面的 主要研究有： 1 0 4 可以直接准确滴定 ( c h 2 ) 6 n 4 h + + 3 h + + 4 0 h ；( c h 2 ) 6 n 4 + 4 h 2 0 指示剂：化学计量点产物( c h 2 ) 刹4 决定溶液的p h ， o h 一】= 旅 = o 0 5 1 4 1 0 = 1 0 。1p 日= g 9 计算公式：。= ( c v ) , v a o h 。w nm 试样量 研 1 4 枷| 募 = m t ： j j 帖 o 。o 河南大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 2 3 实验方法 2 3 1 出发菌株的发酵实验 以光滑球拟酵母t o r u l o p s i sg l a b r a t at k l 0 1 为出发菌株，摇瓶发酵，测定丙酮酸质量浓度， 残余葡萄糖浓度，酒精浓度。 2 3 2 出发菌株的紫外诱变 以光滑球拟酵母rg l a b r a t at k l 0 1 为出发菌株，首先确定最佳的紫外诱变剂量，再用 c a c 0 3 培养基平板检出产量较大的突变株。 2 3 2 1 紫外致死率曲线绘制 ( 1 ) 取新鲜斜面菌种环接入种子培养基中，3 0 。c 、2 2 0 r p m 培养1 6 h r ，用0 1 mp h 7 0 磷酸 钠缓冲液离心洗涤三次，制成菌悬液； ( 2 ) 调整菌悬液浓度至l x l 0 6 1 0 7 个触l ，活菌计数，备用； ( 3 ) 开启1 5 瓦紫外灯，使光波稳定3 0 r a i n ，备用； ( 4 ) 吸取5 m l 待测菌悬液，倾入直径9 e m 培养皿中，菌液厚度不超过2 m ； ( 5 ) 照射时打开皿盖，并采用电磁搅拌器缓慢震荡，照射距离为紫外灯管1 ，3 长度垂直照射 1 5 s 、3 0 s 、4 5 s 、6 0 s 、7 5 s 、9 0 s 、1 0 5 s ，1 2 0 s ； ( 6 ) 关闭紫外灯，开启红光灯，将处理后的菌液取o 2 m l 涂布于c a c 0 3 培养基平板上； ( 7 ) 将涂布好的平板用黑纸包好，放入3 0 。c 恒温培养箱，培养4 8 h r 。 ( 8 ) 处理后活菌计数并与对照之数据比较计算，得出致死率，并绘制曲线。 2 3 2 2 紫外诱交帮量的确定 对c a c o ，培养基上产生透明圈的菌进行发酵实验，与未经照射的对照组产量相比较，得 出该剂量下的突变株产量正变率，选择芷变率最高时对应的剂量为最佳诱变剂量。 2 3 2 , 3 紫外诱变 制备菌悬液，调整浓度至lx 1 0 7 个，m l 最佳剂量下垂直照射，将处理后的菌液取0 2 m l 涂布于c a c 0 3 培养基平扳上，黑纸包好，放入3 0 ( 2 恒温培养箱。培养4 $ h r ，检出透明圈最大 的菌，进行发酵实验，检测丙酮酸浓度。 1 5 丙酮酸高产菌株的选育与发酵条件研究 2 3 3 突变株菌营养缺陷型鉴定 盐酸硫胺素，盐酸毗哆醇，烟酸，生物素分别是zg l a b r a t a 代谢途径中丙酮酸脱氢酶系， 丙酮酸脱羧酶，乳酸脱氢酶，转氨酶的辅酶。选择维生素适量与缺乏以上四种维生素中的一 种的情况下，对比菌体生长的态势。由此可验证菌株是否为营养缺陷型，具体方法为： ( 1 ) 配制基本培养基，无氮基本培养基。 ( 2 ) 维生素的编号及其在不同滤纸片上的对应情况 四种维生素的编号：】盐酸硫胺素，2 烟酸，3 生物素，4 盐酸吡哆醇。 不同滤纸条上的维生素选择：i 缺少l ，缺少2m 缺少3i v 缺少4v 均不缺少 ( 3 ) 取新鲜斜面菌种一环接入种子培养基中，3 0 c 、2 2 0 r p m 培养1 6 h r ；生理盐水离心洗涤3 次，然后转入无氢基本培养基中，震荡饥饿培养8 - 1 0 h r ；离心收集菌体并重悬于生理盐水中制 成菌悬液，取0 i m l 菌液涂布于基本培养基平板，3 0 c 培养2 h i ：然后取直径o 5 c m 的圆形滤 纸片分别蘸上不同组合的维生素液，将其贴在同一平板上，其中v 作为对照点在中间，i 作为验证点在四角。 ( 4 ) 3 0 c 下培养4 8 7 2 h r 后观察蕴的长势。 2 3 4 突变株产酒精能力快速检测 1 1 ( 2 ，3 s 一三苯基氯化四氦唑) 是一种显色剂，它能与乙醇脱氢酶( 简写为a d h ) 作用 并使其失活，同时产生红色物质。在丙酮酸通向乙醇的代谢过程中，乙醇产量受此酶活性影 响。产酒精能力强的酵母a d h 活性强与t 1 作用呈深红色，次之显粉红色，微红色或不显 色。用于发酵生产的菌种在理论上应该是产酒精能力较弱的，因此白色或粉红色菌株可能是 我们的目的菌株，具体实验方法为： ( 1 ) 将菌液稀释至l 矿，lo - 7 浓度，涂布在1 1 下层培养基上，3 0 。c 培养4 8 h r ； ( 2 ) 倾注n 培养基于已长出菌的r r c 下层培养基上，避光培养2 - 3 h r 后观察颜色； ( 3 ) 选择菌种的原则；白色最好，其次为粉红色。 ( 4 ) 测定发酵液中乙醇的含量，验证菌落颜色与酒精浓度的关系。 2 3 5 筛选肛氟代丙酮酸抗性突变株 加入卢氟代丙酮酸于固体种子培养基中卢氟代丙酮酸梯度选择为0 、o 1 m g l 、1m g 几， 1 6 河南大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 1 0m g l 、1 0 0m g l 。取培养1 6 h r 的活化种子，无菌生理盐水离心洗涤2 次，稀释至1 0 5 ，取 o 1 m l 涂布肛氟代丙酮酸梯度乎板，3 0 c 培养4 8 h r ，记录生长情况。 2 , 3 6 筛选m 脱氧葡萄糖抗性突变株 加入口脱氧葡萄糖于固体种子培养基中，n 脱氧葡萄糖梯度选择为0 、o 5 9 ，l 、1 0g ，l 、 1 , 5g l 、2 0g l ，2 5g r l 、3 0 9 l 。取培养1 6 h r 的活化种子，无菌生理盐水离心洗涤2 次， 稀释至1 矿，取0 i m l 涂布m 脱氧葡萄耱梯度平板，3 0 c 培养4 8 h r ，记录生长情况。 2 3 7 突变株发酵产酸情况及其遗传稳定性实验 筛选出的菌种用斜面传代，每代均摇瓶发酵，测定发酵液的丙酮酸质量浓度，以鉴定其 遗传稳定性。 2 3 8 培养基及发酵条件的优化 ( 1 ) 碳氮源的单因素试验与碳氦比的初步确定 选择葡萄糖，硫酸铵为考察因素，做单因素试验以p y r 最终浓度，g l c 终浓度以及o d 6 _ 6 0 三个指标为参考进行分析，进而确定合适的用量以及初步确定其碳氩比。 ( 2 ) c ，n ，m g ，p 元素正交实验 选择葡萄糖，硫酸铵，m g s 0 4 ，k h 2 p 0 4 四因素，各选3 个水平，并作三个平行样- 进行 发酵试验，以丙酮酸浓度为指标，最终确定其浓度水平。 ( 3 ) 金属离子正交实验 选择c a c l 2 ，f e s 0 4 ，z n c l 2 ，m n c l 2 ，c i i = s 0 4 五因素，各选3 个水平，并作三个平行样， 进行发酵试验，以p y r 最终浓度为指标进行分析，进而确定合适的金属离子浓度水平。 ( 4 ) 维生素水平单因素实验 选择盐酸硫胺索，盐酸吡哆酵，生物素，烟酸四因素，各选六个水平，各三个平行样，进 行发酵试验，以p y r 摄终浓度为指标参考进行分析，进而确定合适的盐酸硫胺索，盐酸吡哆 醇，生物素，烟酸水平。 ( 5 ) 响应面分析应用于丙酮酸发酵培养基的优化9 2 l 为了对维生素的影响进行深入分析，我们利用统计学软件s a s 中的b o x - b e h n k e n 中心组合 设计和响应面分析法考察不同维生素浓度组合对z 鲫曲刺量合成丙酮酸的影响，得较优的 1 7 丙酮酸高产菌株的选育与发百 条件研究 维生素浓度组合，并考察其中最重要的影响因素。根据b o x - b e h n k e n 的中心组合设计原理，以 盐酸硫胺素、烟酸、生物素和盐酸吡哆醇四个因素为自变量，以丙酮酸产量为响应值设计了 四因素三水平共2 7 个实验点的响应面分析实验，以随机次序进行，重复三次，记录数据，分 析试验结果，设计如表2 1 ，2 - 2 所示。 ( 6 ) 菌龄对发酵的影响 接种种子摇瓶3 0 6 c 培养，每隔2 h r 测定菌浓度，绘制生长曲线，选择1 8 、2 0 、2 2 和2 4 h r 的种子接入发酵摇瓶中发酵，测定丙酮酸浓度，确定合适的接种种龄。 ( 7 ) 接种量对发酵的影响 对于固定体积的摇瓶发酵，采取不同的接种量进行比较，选择4 、8 、1 0 、1 2 、1 6 体积比，最佳接入菌龄，进行发酵实验，确定最佳的接种量。 2 3 9 优化条件下的发酵实验 以优化的培养基条件与优化后的发酵条件进行发酵实验，每4 h r 测定丙酮酸浓度，残糖浓 度，绘制出丙酮酸发酵产酸趋势曲线，糖降曲线，综合分析，确定发酵结束的时间。 2 3 1 0 丙酮酸高产菌株的快速筛选方法 选择t 1 反应为白色的菌，制备单细胞悬液，稀释后在碳酸钙平板上分离单菌落，每平 板上的菌落1 0 个以下为宜；3 0 ( 2 培养4 8 h 后发酵产酸会使单菌落周围出现透明圈，比较透明 圈直径并结合透明圈与菌的直径比可以直观的选择产酸较多生长快的菌：随后进行摇瓶发酵 试验，测定丙酮酸产量、残糖量和生物量以验证并确定筛选原则。 塞2 ：! 述壁丝丝笙塞堕蕉丛塑塑查! 编码水平 101 壅! ：!墅尘! 堕翌蔓塑壅墼堕盐 壅堕皇 翌 兰 兰2 l 一 10 01 。1 2 0 0 l1 3i 1 0 0 40 o- 1 1 50 0 i。i 6 l - l0 0 7 0 0 00 8i 1 0 0 9 i 一10 0 1 00 一i 10 1 1 l 00i 1 2 1 0 01 1 30 1- 10 1 4 0 1 l0 1 51 0 01 1 60 1- 10 t 7，0 0- i 1 80 0 00 1 9 10 10 2 01 0 - 1 0 210 10 1 2 20 一1 0i 2 3 0 10 1 2 4 0 - 1 0- i 2 51 0 - 1 0 2 6 00 00 2 7 1 0 10 丙酮酸高产菌株的选育与发酵条件研究 3 结果与讨论 3 1 出发菌株的发酵实验 以光滑球拟酵母t o r u l o p s i s g l a b r a m t k l 0 i 为出发菌株测定丙酮酸质量浓度，残余葡萄 糖浓度，酒精浓度，摇瓶发酵结果如下： 表3 - 1 出发菌株的发酵结果 3 2 出发菌株的紫外诱变 以光滑球拟酵母t g l a b r a t a t k l 0 1 为出发菌株，首先绘制紫外致死率曲线，对不同剂量紫 外处理后c a c 0 3 培养基上产生透明圈的菌进行发酵实验，比较未经照射的对照组产量相比较， 得出该剂量下的突变株产量正变率，选择正变率最高时对应的剂量为最佳诱变剂量，进行紫 外诱变。 3 2 1 紫外致死率曲线 照射时打开皿盖，并采用电磁搅拌器缓慢震荡，照射距离为紫外灯管l 3 长度垂直照射 1 5 s 、3 0 s 、4 5 s 、6 0 s 、7 5 s 、9 0 s 、1 0 s s ，1 2 0 s ；致死率结果如表3 - 2 所示，并以致死率为纵坐 标，紫外照射时间为横坐标，并绘制曲线如图3 - 1 所示： 未经紫外处理的活菌计数：1 6 1 07 个m l 表3 - 2 出发菌株经紫外处理后致死率结果( 计数1 0 7 个m l ) 注：1 0 5 s 。1 2 0 s 址活菌数采用菌悬液浓度1 6 x 1 0 7 个加l 稀释1 0 0 0 倍涂布得到，其他稀释1 0 0 0 0 0 倍。 2 0 河南大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 扎一一 。 _ 二忑i 1 - i w m 1 ) 图3 1 紫外致死率曲线圈3 - 2 紫外处理后正变率曲线 3 2 2 突变株产量正变率与紫外照射时闻的关系 对不同剂量紫外处理后c a c 0 3 培养基上产生透明圈的菌进行发酵实验，记录发酵产酸大 于未经紫外处理的产酸平均数据的菌数，除以该剂量下的活菌数，记为正变率，结果如表3 3 所示：以正变率为纵坐标，紫外照射时间为横坐标。并绘制曲线如图3 - 2 所示。 3 2 3 紫外诱变剂量的确定 由图3 1 可见，紫外照射时间_ 9 0 s 时，致死率已达9 8 ，致死效应明显，但是这并不是 合适的诱变剂量，即合适的剂量不一定是致死率最高剂量；紫外诱变引起微生物突变效应包 括产物的正负突变效应以及形态突变，对于光滑球拟酵母紫外未引发其形态突变，故应选用 产物正变率较高，负变较低时的剂量为最佳紫外诱变剂量；结合图3 - 2 可见，紫外处理6 0 s 时 正变率6 8 7 5 最高。紫外照射时间 9 0 s 时，随致死率提高，产物正变效应也大幅降低，故最 佳紫外处理剂量应为6 0 s 。 3 2 4 紫外诱变结果 制备菌悬液，调整浓度至1 1 0 6 - 1 0 7 个加l ，晟佳剂量下垂直照射，梅处理后的菌液取0 2 m l 涂布于c a c 0 3 培养基平板上，黑纸包好，放入3 0 c 恒温培养箱，培养4 8 h r ，检出透明圈最大 的5 株苗，进行发酵实验，检测丙酮酸浓度，所得数据如表3 4 所示： 2 1 2薯ee营t，l 丙酮酸高产菌株的选育与发酵条件研究 表3 4 出发菌株经最佳紫外处理j 舌的发酵结果 实验结果表明，紫外诱变取得了较好的结果，其中5 # 菌株丙酮酸产量4 8 5 9 m ，较诱变前 提高1 3 ，故将其编号为t g l a b r a t at k 2 0 5 进行后续实验。 3 3 突变株菌营养缺陷型鉴定 据报道产丙酮酸的光滑球拟酵母一般为盐酸硫胺素、烟酸、生物素和盐酸吡哆醇等四种 维生素的营养缺陷型，为了鉴定z g l a b r a t at k 2 0 5 的营养特性，我们对其进行了营养缺陷型鉴 定实验，结果如表3 - 5 所示，具体情况说明如下： 四种维生素的编号：1 盐酸硫胺素，2 - 烟酸，3 ，生物素，4 - 盐酸吡哆醇。 滤纸条上的维生素选择：i 缺少1 缺少2 缺少3 缺少4v 均不缺少； 在缺少四种维生素之一的情况下，对应平板滤纸片周围没有菌落长出，而对照周围出现菌落， 说明该菌株是盐酸硫胺素，烟酸，生物索，盐酸吡哆醇的缺陷型。 表3 - 5 四种维生素对t o r u l o p s i s g l a b r a t at k l 0 1 的影响 - 一壤示滤纸片周围没有出现葫落，“+ 嘬示游纸片周围出现菖落 3 4 突变株产酒精能力快速检测 t 1 ( 2 ，3 5 三苯基氯化四氮唑) 是一种显色剂，它能与乙醇脱氢酶( 简写为a d h ) 作用 并使其失活，同时产生红色物质。在丙酮酸通向乙醇的代谢过程中，乙醇产量受此酶活性影 响，产酒精能力强的酵母a d h 活性强与t 1 作用里深红色，次之显粉红色，微红色或不显 色；故据其颜色反应可作为产酒精能力快速检测的依据。 制备菌悬液并稀释至1 1o 7 浓度，涂布”陀下层培养基，3 0 c 培养4 8 1 1 1 ；待长出菌后， 倾注t 1 上层培养基，避光培养2 - 3 h r 后观察颜色，其颜色反应如图3 - 3 ，3 - 4 所示： 河南大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 图3 31 1 下层平板上的光滑球拟酵母 图3 _ 4 倒过丌c 上层培养基的平板 由图3 - 3 ，3 4 对比可见，未倾注1 1 的下层培养基平板上的光滑球拟酵母呈白色，倒过 t 1 上层培养基后由于产酒精能力不同，而显示不同颜色，颜色有白色至粉红色，红色程度 不等。从原理上考虑，白色最好，产酒精最少，其次为粉红色，红色菌落产酒精最多。为验 证该理论的可靠性，我们对不同颜色菌落发酵液中乙醇的含量进行了测定，以明确菌落颜色 与酒精浓度的关系，同时也测定产酸情况和残糖，观察菌落颜色与产酸，葡萄糖利用的关系， 结果如表3 - 6 所示： 表3 - 6 不同颜色菌落对发酵的影响( g ，l ) 由表3 - 6 可以看出，实验结果验证了我们的预期，粉红色苗落，红色菌落产酒精较白色多， 白色菌落的酒精产量最低，且产酸最多，残糖也最低，证明了1 1 培养基显色法可以达到产 酒精能力快速检测的目的；同时也可得出结论：白色菌落对原料利用率最高，节约原料，提 高了转化率，降低了副产物的积累，对发酵生产最为有利。 3 。5 筛选肛氟代丙酮酸抗性突变株 采用菌株z g l a b r a t a t k 2 0 5 ，进行卢氟代丙酮酸( 卢f p ) 抗性实验，其梯度选择为0 , 0 i m g l ， lm g l 、1 0m g l 、1 0 0m g l 。取培养1 6 h r 的活化种子，无菌生理盐水离心洗涤2 次，稀释至 丙酮酸高产菌株的选育与发酵条件研究 l f f 5 浓度取o 1 m l 涂布梯度平板，3 0 0 0 培养4 $ h r ，记录生长情况如表3 - 7 所示；争f p 平板上 共长出3 8 个菌落，说明这些菌具有卢f p 抗性，能耐受卢f p 浓度在l m g l 左右。对具有卢f p 抗性的3 8 株突变株进行摇瓶发酵实验，测定丙酮酸质量浓度如表3 - 8 所示： 表3 - 7 乒氟代丙酮酸平板抗性突变株生长情况 墨垡生型竺堡壁! ：! 里生! 里g 生! ! 竺g 生! ! ! 里照 平扳捡出菌落数1 2 82 61 200 河南大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 由上表可知，口f p 抗性菌株的产酸量均比出发菌株t g l a b r a t a t k l 0 1 有所提高，且提高幅 度随能耐受房f p 的浓度提高而增加，其中t g l a b r a t at k 3 3 2 产酸4 9 6 2 9 l 。增幅1 5 6 1 ，故 选取t g l a b r a t at k 3 3 2 进行m 脱氧葡萄糖抗性实验。 3 6 筛选m 脱氧葡萄糖抗性突变株 采用经紫外处理后的正变株，且经t 1 平板筛选颜色为白色，具有卢氟代丙酮酸抗性的 z g l a b r a t at k 3 3 2 进行m 脱氧葡萄糖抗性实验。加入n 脱氧葡萄糖于固体种子培养基中，e - 脱氧葡萄糖梯度选择为0 、0 5 9 l 、1 0 玑、1 5g l 、2 0g 儿、2 5g l 、3 0 9 l 。取培养1 6 h r 的活化种子，无菌生理盐水离心洗涤2 次，稀释至1 0 5 ，取0 i m l 涂布m 脱氧葡萄糖梯度平 板，3 0 c 培养4 8 h r ，记录生长情况如表3 - 9 所示： 表3 - 9d 脱氧葡萄糖平板抗性突变株生长情况 由表3 - 9 可知：d 脱氧葡萄糖平板上共长出2 0 个菌落，说明这些菌具有一定的n 脱氧葡 萄糖抗性，能耐受的d 脱氧葡萄糖浓度在1 5 9 l 左右。对具有胁脱氧葡萄糖抗性的2 0 株突 变株进行摇瓶发酵实验，测定最终的丙酮酸质量浓度和残糖浓度如表3 1 0 所示： 表3 ，i o 膛氧葡萄藏抗性突变檬发酵堵况 丙酮酸高产菌株的选育与发酵条件研究 由上表可知，d - 脱氧葡萄糖抗性菌株的产酸量均比出发菌株t g l a b r a t at k l 0 1 有所提高， 残糖大幅下降，且幅度随能耐受d 脱氧葡萄糖的浓度提高而增加，其中t g l a b r a t at k 4 1 8 产 酸4 9 s s g l ，残糖o 8 5 9 l ，优异于其他菌株，作为目标菌株，考察其遗传稳定性。 3 7 突变株发酵产酸情况及其遗传稳定性实验 筛选出的菌种z g l a b r a t at k 4 1 8 用斜面传代5 代，摇瓶发酵，测定每代发酵液中的丙酮酸 质量浓度，比较如表3 - 9 所示： 表3 - 1 1 遗传稳定性实验比较( g l ) 3 8 培养基及发酵条件的优化 3 8 1 初始葡萄糖浓度的确定 以葡萄糖为碳源，( n i - h ) 2 s 0 4 为氮源，选择不同的碳氮比，固定n 含量8 9 ，测定各相关 参数如表3 1 2 所示。 表3 - 1 2 不同葡萄糖浓度下的发酵情况 因豢 序 g i c 含量o d ( 6 6 0 ) 丙酮酸量残糖量c ；n l6 2 3 1 4 0 83 5 ，2 60 ，3 41 5 ：l 2 8 1 2i 5 6 24 5 1 50 ，4 82 0 ji 3 1 0 61 6 7 84 8 6 410 22 5 ：l 4 1 2 7 3 9 1 5 2 14 8 ，7 55 8 s3 0 ：1 51 4 8 5i 1 3 3 4 4 8 43 2 5 13 5 ：1 6 1 6 9 7 9 0 9 8 5 3 9 9 34 5 1 64 0 ：l 结果表明：初始糖浓度在6 0 q 3 0 9 l 时，菌体浓度、丙酮酸产量及残糖浓度随糖浓度增加 而增加，糖利用率逐渐降低；初始耱浓度达到1 3 0 1 6 9 7g l 时，菌体浓度、丙酮酸产量及残 糖浓度随糖浓度增加而降低，残糖大量增加；结合图3 - 5 可见，初始糖浓度过高时，最终菌浓 度偏低，菌体量增加减慢，菌体生长明显受到抑制，不仅延迟期增长，且对数末期的到来也 河南大学2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 较初始糖浓度 0 6 9 l 时大约馒了2 h r ：这些情况表明糖浓度不仅可以影响酸的产量，也影响菌 体利用塘的能力；过高的糖浓度对菌体生长产生抑制，导致残糖浓度增加，浪费了原料，提 高了生产成本；而糖浓度过低又会导致发酵过早结束，微生物利用完葡萄糖后又转而利用丙 酮酸，导致丙酮酸产量降低。 2 0 1 鼻 1 2 l 0 4 o o d4 8 1 21 6 2 0 2 4 t i m e ( h 嘲 图3 巧不同葡萄糖初始浓度下的生长曲线 综合考虑产酸，降糖以及糖利用等因素，我们选择初始的糖浓度1 0 6 9 l ，此时苗体生长 最好。酸产量较高，残糖较低。同时也提示合适的c n 应该为2 5 ：1 左右，为此我们固定糖 浓度1 0 6 9 l ，改变( n l 山) 2 s q 氮源的量，以确定合适的氮源用量以及最佳的碳氮比。 3 8 2 初始氮源浓度及碳氮比的确定 固定葡萄糖浓度1 0 6g i ，( n i - h ) 2 s 0 4 氮源梯度选择6 0 叽，7 0g l ，8 0g l ，9 0g r t ， 1 0g l ，以确定合适的氮源用量以及最佳的碳氨比，测定各相关参数如表3 1 2 所示： 表3 - 1 3 不周( n 地) ：s 0 4 浓度下的发酵待况 丙酮酸高产菌株的选育与发酵条件研究 结果表明；( n h 4 ) 2 s 0 4 浓度6 0 - 8 0 叽时，菌体量变化情况随( n 也) 2 s 0 4 浓度增加面 更易于促进菌体生长，过高的( n h ) 2 s 0 4 浓度，如