（微生物学专业论文）两株丝状真菌n3、n9的分类鉴定.pdf

摘要 摘要 本实验室从一酸奶样品中分离到两株丝状真菌n 3 、n 9 。通过形态 学观察、r a p d 分析及5 8 s r d n a 及i t s 区序列测定并结合出菇试验， 初步确定了n 3 、n 9 菌株的分类地位以及它们与其近缘种的生物系统学 关系。 1 分别观察了n 3 、n 9 菌株在p d a 培养基上的菌落特征和菌丝体形 态特征。结果表明：n 3 、n 9 菌株在p d a 培养基上2 5 培养7 d 后菌落 生长旺盛，呈丝状辐射生长，表面呈绒絮状，圆形，平坦。菌丝浓密， 粗壮，多气生菌丝，菌丝体上具有明显的锁状联合结构，故初步判定 n 3 、n 9 菌株为担子菌。 2 比较了c t a b 、s d s c t a b 和氯化苄这3 种d n a 提取方法提取8 株担子菌d n a 的效果。结果表明：c t a b 法和s d s c t a b 法只适合于 部分菌株的d n a 提取，对另外一些菌株则提取不出谱带清晰的d n a ； 而氯化苄法适合于所有供试菌株的d n a 提取，所有菌株的d n a 凝胶 电泳图谱带清晰，效果很好。同时研究比较了液氮研磨和提取液的p h 值对氯化苄法提取d n a 效果的影响。 3 运用r a p d 技术对n 3 、n 9 菌株和6 株担子菌标准菌株进行了比 较。首先从4 0 个1 0 b p 引物中筛选出1 8 个有效引物，用于所有供试材 料基因组d n a 样品的扩增。这1 8 个引物对8 株供试菌株均能扩增出清 晰的谱带。对r a p d 结果进行聚类分析，构建了供试菌株基因型的亲缘 关系图。从聚类图上可以看出，菌株n 3 、n 9 与糙皮侧耳( p l e u r o t u s o s t r e a t u s ) 白平菇、糙皮侧耳澳黑平菇、姬菇( p 1 i m p i d u s ) 河北3 3 、 毛头鬼伞( c o p r i n u sc o m a t u s ) 聚为一类，而香菇( l e n t i n u se d o d e s ) 、 金针菇( f l a m m u l i n av e l u t i p e s ) 聚为另一类。其中菌株n 3 、n 9 与白平 菇的亲缘关系最近，与澳黑平菇、河北3 3 的亲缘关系稍近一些，故可 初步确定n 3 、n 9 菌株应属于侧耳属。 4 再次运用r a p d 技术对n 3 、n 9 菌株和侧耳属7 株菌株进行了聚 类分析。以扩增条带清晰、多态性丰富和重现性好为原则，从4 0 个 1 0 b p 引物中筛选出了2 1 个有效引物，用于所有供试材料基因组d n a 样品的扩增。聚类结果表明：菌株n 3 、n 9 与白平菇相似程度最高，三 两株丝状真茁n 3 、n 9 的分类箍定 者最先合并，之后与澳黑平菇、河北3 3 、姬菇黑平1 号归为一类，而 鲍鱼菇( p a b a l o n u s ) 、金顶侧耳( p c i t r i n o p i l e a t u s ) 、阿魏侧耳( 尸 尼r 甜l a p ) 归为另一类。故可在第一次聚类的基础上进一步确定n 3 、n 9 应属于侧耳属，且与白平菇的亲缘关系较近。 5 对n 3 、n 9 菌株的5 8 s r d n a 及i t s 序列进行p c r 扩增和序列测 定，并将这两株菌株与g e n b a n k 中登录的糙皮侧耳、哥伦比亚侧耳( j d c o l u m b i 玎“s ) 、灰白侧耳( 尸s p o d o l e u c u s ) 等共1 8 株菌株的5 8 s r d n a 及 i t s 序列进行聚类分析。系统聚类树结果表明：菌株n 3 、n 9 在聚类树 上被聚在以糙皮侧耳为代表的分支中，其中n 3 与灰白侧耳的i t s l 5 8 s i t s 2 基因序列同源性最高，其b o o t s t r a p 支持率为1 0 0 ，二者很 可能是同一个种；n 9 与佛罗里达侧耳( p f l o r i d a n u s ) 的i t s l - 5 8 s i t s 2 基因序列同源性最高，其b o o t s t r a p 支持率为9 9 ，也显示出十分密切 的遗传亲缘关系，提示n 9 可能属于佛罗里达侧耳。 6 对n 3 、n 9 菌株进行了出菇试验。出菇试验表明：n 3 、n 9 菌株 均具有结实能力，其桑椹期的形状和子实体的形态结构与侧耳属的子实 体相同。 关键词：丝状真菌；d n a 提取；r a p d ；序列测定；出菇试验 l i 摘要 a b s t r a c t t w os t r a i n so ff i l a m e n t o u sf u n g in 3a n dn 9w e r ei s o l a t e df r o mo n e y o g h u r ts a m p l e b ym o r p h o l o g i c a lo b s e r v a t i o n ，r a p dt y p i n g ，n u c l e o t i d e s e q u e n c ea n a l y s i so ft h e i ri n t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e rr e g i o n sa n d5 8 s r d n a a sw e l la sc u l t i v a t i n ge x p e r i m e n t ，t h et a x o n o m yp o s i t i o no fs t r a i n sn 3 ，n 9 a n db i o s y s t e m a t i c so f t h e ma n dt h e i rc l o s er e l a t i v es p e c i e sw e r ei d e n t i f i e d t h ec o l o n ya n dm y c e l i a lm i c r o s c o p i cc h a r a c t e r so fn 3 n 9o np o t a t o d e x t r o s ea g a r ( p d a ) m e d i u mw e r eo b s e r v e dr e s p e c t i v e l y c o l o n i a lg r o w t h f o r7 da t2 5 w a sc h a r a c t e r i z e db yt h er a d i a le x t e n s i o no fm y c e l i ao nt h e s u r f a c eo fm e d i u m ，c r e a t i n gac i r c u l a ra n ds m o o t hf u n g a lc o l o n y t h e i r h y p h a ew e r ed e n s e ，t h i c ka n da e r i a l ，a n dh a dd i s t i n c tc l a m pc o n n e c t i o n s s t r u c t u r e ，w h i c hw a su n i q u et ob a s i d i o m y c e t e s b a s e do nt h ec h a r a c t e r s a b o v e ，s t r a i n sn 3a n dn 9w e r ep r i m a r i l yi d e n t i f i e da sb a s i d i o m y c e t e s t h r e ek i n d s o fm e t h o d s ( i e b e n z y lc h o e i d e ，c t a ba n ds d s c t a b m e t h o d ) w e r eu s e d t oe x t r a c td n af r o me i g h ts t r a i n so fb a s i d i o m y c e t e s t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h eb e n z y lc h o e i d em e t h o dw a sa b l et ob eu s e dt oe x t r a c t t h ed n ao ft h e s e b a s i d i o m y c e t e s ，a n d b a n d s r e s u l t i n g f r o m g e l e l e c t r o p h o r e t i cs e p a r a t i o n sw e r ev e r yc l e a r h o w e v e r ，b o t ht h ec t a ba n d s d s c t a bm e t h o d sw e r eo n l ya d e q u a t et ob eu s e dt oe x t r a c td n af r o m s o m es t r a i n so fb a s i d i o m y c e t e sa n dt h ed n ab a n d so fs o m es t r a i n sw e r e c l e a r ，b u to t h e r sw e r en o to b v i o u s t h ee f f e c t so fb o t ht h ep hv a l u e so f e x t r a c t sa n dt h eg r i n d i n gt om y c e l i ai n l i q u i dn i t r o g e n o nt h er e s u l to f e x t r a c t i n gd n a w e r ea l s od i s c u s s e d e i g h ts t r a i n so fb a s i d i o m y c e t e s ，i e n 3 ，n 9a n d6s t a n d a r ds t r a i n s ，h a d b e e na n a l y z e df o rt h e i rr a p dg e n o t y p e a m o n g4 0a r b i t r a r yp r i m e r s ，18 p r i m e r sc o u l dg e te n o u g ha m p l i f i e db a n d sf o r a l ls t r a i n s 1 m e g e n e t i c r e l a t i o n s h i ph a db e e ne v a l u a t e db ys i m i l a r i t yc o f f i c i e n to b t a i n e df r o mt h e s e p r o f i l e s t h ec l u s t e rs h o w e dt h a ta l ls t r a i n sc o u l db ed i v i d e di n t ot w op a r t s t h ef i r s tp a r tc o n s i s t e do fs t r a i n sn 3a n dn 9 ，a 1 1s t r a i n so fp l e u r o t u sa n d c o p r i n u sc o m a t u s t h es e c o n dp a r tw a sl e n t i n u se d o d e sa n df l a m m u l i n a l i i 两株丝状真菌n 3 、n 9 的分类鉴定 v e l u t i p e s n 3 ，n 9a n dp o s t r e a t u sw e r ec l o s e l yr e l a t e d a c c o r d i n gt h er e s u l t ， s t r a i n sn 3a n dn 9w e r ei d e n t i f i e dt ot h eg e n u sp l e u r o t u s r a p dw a sa g a i ne m p l o y e dt os t u d yt h eg e n e t i cv a r i a t i o no fs t r a i n sn 3 ，n 9 a n d7s t a n d a r ds t r a i n so fp l e u r o t u s t w e n t y o n er a n d o mp r i m e r ss e l e c t e d f r o m4 0o n e sw e r eu s e df o rd n aa m p l i f i c a t i o n s p e c i f i cc h a r a c t e r i s t i cb a n d s w e r ep r o d u c e db ym o s to ft h e21 p r i m e r s t h ed e n d r o g r a mr e s u l a t e df r o m h i e r a r c h i c a lc l u s t e ra n a l y s i sb a s e do na l lb a n d sa m p l i f i e db yt h e21 p r i m e r s s h o w e dt h a tt h ei s o l a t e sw e r ed i s t i n c t l yc l a s s i f i e di n t ot w ol a r g ec a t e g o r i e s t h ef i r s t g r o u pw a sc o m p o s e do ft h e s t r a i n sn 3 ，n 9a n d4i s o l a t e so f p l e u r o t u s ( i e b a i ，a o h e i ，h e b e i3 3 ，h e i p i n 9 1 ) f u r t h e r m o r e ，t h es t r a i n sn 3 ， n 9a n dpo s t r e a t u sh a dac l o s er e l a t i o n s h i p t h es e c o n dg r o u pw a sc o n s i s t e d o fp a b a l o n e s ，p c i t r i n o p i l e a t u sa n dp f e r u l a e t h ei n t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e rr e g i o n sa n d5 8 so ft h er i b o s o m a lr n a g e n ef r o ms t r a i n sn 3 ，n 9w e r ea m p l i f i e du s i n gt h ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n a n ds e q u e n c e d s e q u e n c e sf r o mt h ea b o v ei s o l a t e sw e r ec o m p a r e dw i t h p u b l i s h e ds e q u e n c e so f p o s t r e a t u s ，p c o l u m b i n u s ，p s p o d o l e u c u sa n ds oo n i ng e n b a n kd a t a b a s ea n dp h y l o g e n e t i ct r e e sw e r ep r o d u c e db a s e do ni t s s e q u e n c ed a t ab y “n e i 曲b o u r _ j o i n i n 岔m e t h o d so ft h es o f t w a r eb i o e d i t t h e s e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h es t r a i nn 3a n dps p o d o l e u c u sh a dt h em o s t c l o s er e l a t i o n s h i pw i t hab o o t s t r a pv a l u eo f10 0 t h i ss u g g e s t e dt h a tt h e y w e r ep r o b a b l yc o n s p e c i f i c t h es t r a i nn 9a n dp f l o r i d a n u sw e r ec l o s e l y r e l a t e dw i t h9 9 b o o t s t r a pv a l u e ，i ti n d i c a t e dt h a tn 9m i g h tb e l o n gt o 尸 f l o r i d a n u s t h es t r a i n sn 3 ，n 9w e r ec u l t i v a t e df o rt h ef o r m a t i o no ff r u i t b o d i e s t h e r e s u l ts h o w e dt h a ts t r a i n sn 3 ，n 9h a dt h ec a p a b i l i t yf o r m i n gf r u i t b o d ya n d t h e yw e r ei d e n t i f i e dt ot h eg e n u sp l e u r o t u sb yt h em o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r o b s e r v a t i o nt ot h e i rf r u i t b o d i e s k e yw o r d s ：f i l a m e n t o u s f u n g i ；d n ae x t r a c t i o n ；r a p d ；s e q u e n c e a n a l y s i s ；f r u i t i n gt e s t 第一章文献综述 1 项目研究的意义 第一章文献综述 本实验室从一酸奶样品中分离到两株丝状真菌n 3 、n 9 ，其分类地位还不明 确。众所周知，真菌菌株的鉴定是比较困难的，仅仅使用传统的形态学观察的方法 往往很难将一个真菌菌株准确鉴定到种，也很难弄清楚一个真菌菌株与它的近缘种 之间的生物系统学关系。随着分子生物学的发展，分子生物学方法越来越多地被应 用于真菌系统学研究和分类鉴定 i 。 。目前国内外广泛应用随机扩增多态性d n a ( r a p d ) 技术对微生物进行多态性分析，根据相似性系数来评价菌株之间的遗传 亲缘关系，同时核糖体基因( r d n a ) 序列分析已被应用于真菌各个等级水平的系 统学研究。尤其是5 8 s r d n a 和其两侧的转录间区( i t s ) 序列以其易于扩增、进化 速度快、可准确排序、且在其不长的序列内可提供足够多的变异而适合于类群间的 比较，所以应用5 8 s r d n a 及i t s 区序列探讨真菌在较低分类阶元上( 一般在科级 分类阶元以下) 的系统发育问题是当前一大热点。本实验运用形态学观察、随机扩 增多态性d n a ( r a p d ) 技术和5 8 s r d n a 及i t s 区序列分析相结合的方法试图研 究清楚n 3 、n 9 两株未知菌株的准确分类地位以及它们和几种近缘种之间的遗传差 异和亲缘关系。在担子菌研究领域，基本上是利用有性特征对未知菌株进行鉴定 的，本实验的创新之处在于利用其无性特征和r a p d 技术、5 8 s r d n a 及i t s 区序 列分析相结合进行分类鉴定。 其次本试验还对这两株丝状真菌进行了出菇试验，阻期通过对其子实体结构的 观察来鉴定其分类地位。 2 真菌的分类历史和分类方法【4 】 分类学是人类认识自然、探索事物本质及其规律的最基本方法，从根本上说， 生物学研究也是从分类学开始的。对生物物种的客观认识、分类并命名，有助于进 一步的生物学研究。传统的生物分类方法是以外部形态特征为主要的分类依据，为 生物分类学做出了巨大的贡献，并且至今仍然为大多数分类学家所采用，是分类学 的基本方法。 真菌分类学( t a x o n o m y ) 主要研究和描述真菌的变异并探讨这种变异的因果关 系，结果建立某个分类系统。真菌分类学家的最高理想是建立自然的真菌分类系 统，摒弃人为的因素。可以说，真菌分类学的历史是人为分类系统日趋接近于自然 1 两株丝状真菌n 3 、n 9 的分类鉴定 的过程。为了追求这一目标，真菌学家先后依据真菌的形态学、解剖学、细胞学、 化学等特征，力求获得符合进化关系的分类，反映真菌的系统发育( p h y l o g e n y ) 关 系。 2 1 真菌的分类历史 真菌是指具有真正的细胞核，产生孢子和不含叶绿素，以寄生或腐生等方式吸 取养料，仅少数类群为单细胞，其他都有分支或不分支的丝状体，能进行有性和 ( 或) 无性繁殖，具有纤维索( 或其他葡聚糖) 或几丁质的微纤维或两者兼有的细 胞壁的有机体。 真菌在地球上分布广泛并与人类的生活密切相关，因此长期以来，真菌学家都 在为探寻它在自然界中的分类地位及阐明它的系统进化关系、谱系发生历史而努 力，使人类能最大限度地利用其为自身服务。但由于真菌形态构造和繁殖方式较原 核生物复杂、多样，与高等植物相比形态结构则又简单，因此其分类既不同于原核 生物也不与高等植物相似。早在几干年前真菌就已被人类认识和利用，但对真菌的 系统研究则只有两百多年的历史。在这期间，主要依据形态的描述鉴定了一些种 属，并且以比较形态学的观点建立了一些分类系统。到目前为止，已被描述的真菌 约有1 万多属、1 2 万多种，而且有不少新种在陆续发现。因此有些真菌学家估计， 地球上的真菌远远超过此数，包括寄生在植物上和其他生物上的真菌，以及众多的 腐生真菌。我国的真菌资源异常丰富，但经描述的还不到8 0 0 0 种，有待于大力挖 掘。在数量如此众多的真菌中，如何建立符合客观规律的自然分类系统是一个重大 的问题。 传统的真菌分类学主要是根据真菌的微观形态特征及其生理生化特点建立起来 的，它是基于真菌物种的表型特征的比较分析来判断它所处的分类地位以及真菌中 不同种之间的相互亲缘关系。真菌的表型特征较为复杂，有许多真菌属于复型真 菌，如虫草属真菌，在它们的生活史中具有无性型( a n a m o r p h ) 的分生孢子阶段和有 性型( t e l e m o r p h ) 的子囊孢子阶段；而有的真菌，有性型和无性型个体会出现分离现 象，生活史的复杂性利形态上的多样性使得对这些真菌的鉴定和分类非常困难。并 且任何物种的表型特征都是基因型与环境相互作用的产物。基因型相同的个体在不 同的环境下发育，可能会出现显著的表型差异，这给真菌的分类和谱系分析带来很 多困难和不确定性。随着生物技术的进步以及一些相关学科的发展，人们需要对真 菌进行更为合理的分类和鉴定，以加深人类对真菌的了解及对于真菌资源的利用和 第一章文献综述 开发。分子生物学技术的兴起，使得传统的真菌分类学建立近乎于自然的分类系统 的最终目的被进一步拓展，它将真菌的基因型特征用于分类和系统学研究，从遗传 本质上揭示真菌的亲缘关系并对其进行分类鉴定，极大地促进了真菌分类学及相关 学科的发展。 2 _ 2 真菌的分类方法【5 传统的真菌分类方法主要依据于真菌的形态特征( 尤其是有性生殖阶段的形态 特征) 、解剖结构( 诸如超微结构的电镜观察等) 、生理生化特征( 从生物合成途 径、比较酶学、胞壁组分到d n a 的碱基组分等) 1 6 o 真菌的分类性状从大到小， 从粗到细，由表及里，逐渐向稳定性状发展。分类方法也由传统的注重少数性状的 分类方式发展到遵从“等重要原则”的以大量表型性状分析为基础的数值分类。 真菌的分类也和其他生物一样繁乱复杂。曾应用过的真菌分类系统就有d e b a r y 系统( 1 8 8 4 ) 、g a u m a n n 系统( 1 9 6 21 9 6 4 ) 、m a r t i n 系统( 1 9 5 0 ) 、w h i t t a k e r 系 统( 1 9 6 9 ) 、a i n s w o r t h 系统( 1 9 7 3 ) 、a l e x o p o u l o s 系统( 1 9 7 4 ) 等多个，各系统 设置的基本出发点和依据各有特色，不同的人采用不同的性状不同的方法，分歧很 大，难以统一。尽管都试图接近真菌的系统发育关系或者进化路线，但由于没有触 及真菌的客观本质特征而缺乏共同比较的基础。如何建立一个符合客观实际的自然 分类系统，关系到人们对真菌的正确认识、归类定秩、鉴定、命名以及指导开发利 用、控制感染等一系列问题。 近年来多门新兴学科和技术的发展，尤其是分子生物学技术的兴起给真菌的分 类学及系统学的发展以巨大的推动力，一些已经或即将用于真菌分类研究的分子生 物学技术指标日渐显示出重要的分类学意义。在对真菌的分子系统学研究中，以核 酸和蛋白质等分子生物学性状用来探索真菌的种、属、科、目、纲、门等各级分类 阶元的进化和亲缘关系应用日趋广泛，弥补了传统分类的不足，使人们对真菌的分 类及系统发育的认识更接近于客观实际，为真菌的分子分类的研究开辟了前景。真 菌分类学的最大进展是从分子水平研究探讨真菌的系统发育关系，重新界定分类群 并建立分类系统，开拓和发展了真菌学的理论和方法【7 】。现对有希望成为真菌分类 学依据的分子生物学指标及有关技术分别阐述如下博j ： 2 2 1d n a ( o + c ) m 0 1 含量测定 这是最早用于真菌分类学研究的分子生物学技术。目前在酵母菌的应用方面较 为成功。即利用真菌d n a 中核酸序列的同源性及基因大小相似性的遗传特征，测 两株丝状真菌n 3 、n 9 的分类鉴定 定d n a 中的( g + c ) m 0 1 含量作为真菌分类鉴定的重要遗传指标之一。d n a 含有 四种碱基，即腺嘌呤( a ) 、鸟嘌呤( g ) 、胸腺嘧啶( t ) 和胞嘧啶( c ) ，双链 d n a 碱基配对规律是a = t 和g ；c ，然而不同有机体( g + c ) ：( a + t ) 的摩尔百 分比各不相同，在不同的d n a 制品中这两类碱基比在很大的范围内变动，但每个 有机体的( g + c ) m 0 1 均有较稳定的值。该值的含义为：f ( g + c ) ( g + c + a + t ) 。d n a 中( g + c ) m 0 1 的测定方法有多种，其原理各不相同， 其中最常用的方法是热变性法。通过在2 6 0 n m 处的紫外吸收值的变化来确定其t m 值，再通过经验公式而得。因为每种真菌都有固定的( g + c ) m 0 1 范围且较为稳 定，不同生物种( g + c ) t 0 0 1 含量是不同的，生物种之间的亲缘关系越远，其 ( g + c ) m 0 1 含量差别就越大，反之亦然，因而可作为真菌的分类学指标。 b e l o z e r s k y 首先对真菌的碱基组成进行研究。随后s t o r c k 等系统研究了真菌的 ( g + c ) m 0 1 ，并以此为指标对真菌的分类鉴定作了实质性评价。通过对大量的真 菌菌群间的d n a ( g + c ) m 0 1 值的比较，发现该数值随着真菌由低等向高等菌属 进化而递增。原核生物的d n a ( g + c ) m 0 1 为2 5 7 5 ，真菌为2 7 7 0 ， 其中子囊酵母2 7 5 0 、担子酵母3 4 6 7 、无孢子酵母2 7 6 9 。一般认 为， ( g + c ) t 0 0 1 差别大于2 0 是不同属的菌：差别在1 0 1 5 之间是同属不同 种，差别在5 以内则可能是种内1 i 同菌株。需要指出的是( g + c ) m 0 1 值在分类 中主要用于否定，即若2 株菌的( g + c ) m 0 1 差异显著，则肯定它们不是同一类 群，因而是个判异指标。 2 2 2 核酸杂交技术 根据g + c 碱基l l f , u 定能得知生物体d n a 中各种核苷酸的百分比，但却无法得 知d n a 的核昔酸序列。由于具有许多相似或相同基因的两个生物在其d n a s 中拥 有很多相同的核苷酸序列，因此d n a 的核苷酸序列显得非常重要。按照这两种 d n a 的序列相似性，它们可以进行杂交。这是一。种非常有效的真菌分类方法，尤其 对于解决种及种以下的进化关系。具体操作为：从真菌菌株中提取基因组d n a 并 用3 2 p 或3 h 进行放射性标记，剪切成小片段，并与分离自第二种生物并以同样方法 处理的未标记d n a 混合在一起。然后将d n a 混合物降温退火，并将双链d n a 与 未杂交的单链d n a 分离。随后检测杂交d n a 的放射性，并与对照进行比较，对照 是1 0 0 的杂交度。至于将两个生物归入相同的分类登记需要多大的基因组同源 性，这并无一定的标准。但同源性大于6 0 的两个菌株被认为是同一个种，同源性 大于2 0 的两个菌株被认为是同一个属。来自不同属的d n a 通常只显示本底杂 交，约1 5 ，因此，基因组杂交是极相关真菌分类学研究的有效工具，但对于 第一章文献综述 高分类等级的进化关系则无效。另外，d n a ：d n a 杂交并不能显示高分类等级的系 统发育史。在对属或属以上水平的分类则采用d n a ：r r n a 杂交，这是因为r r n a 在 进化过程中更为保守。将用示踪物标记的r r n a 分别与d n a 杂交，根据t m 值或 r n a 结合数可获得被测分子亲缘关系的资料。 近年来该技术又与聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 技术结 合，成为对真菌不同属种及种以下单元进行鉴定诊断的一项有力工具。该方法的缺 陷是结果不易分析，研究中需要两两比较，相关物种的不同研究的结果不易比较。 2 2 3 分子标记h 分子标t r ( m o l e c u l a rm a r k e r ) 是以个体问遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗 传标记，是d n a 水平遗传变异的直接反映。与其它几种遗传标记形态标记、 同工酶标记、细胞标记相比较，分子标记具有很多优越性：大多数分子标记共显性 遗传，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎 是无限的：在生物发育的不同阶段，不同组织的d n a 都可用于标记分析；分子标 记直接揭示来自d n a 的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状 无必然的连锁。随着分子生物学技术的发展，目前已经开发了几十种基于d n a 多 态性的分子标记，并且分子标记已大量的应用于真菌的遗传进化、菌株鉴别及遗传 育种等研究领域中。在真菌的研究中用途最广泛的d n a 分子标记技术有限制性片 段长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) ，扩增片段长度 多态性( a m p l y f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，a f l p ) ，随机扩增多态性 d n a ( r a n d o m l ya m p l i f i e dp o l y m o r p h i s md n a ，r a p d ) 等标记技术，此外r d n a 序列分析技术也有大量的报道【l 。 2 2 3 1 限制性片段长度多态。| ! f ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) r f l p 是8 0 年代中期发展起来的一种d n a 多态性分析技术。多态性研究是在 种、种内以及种群水平上进行分类研究的有效手段l 。其基本原理是不同种、种内 以及种群的d n a 序列在进化过程中发生突变，造成限制性位点的插人、缺失、重 排或点突变。因此，当将目标真菌的d n a 序列经一定数目和种类的限制性内切酶 f r e ) 进行酶切时，由于不同的目标真菌d n a 序列结构有差异，内切酶在其上的识 别位点的数目和距离就发生了改变，因而产生相当多的大小不等的d n a 片段，在 进行凝胶电泳时，它们由于迁移率不同形成不同的带，通过与克隆的d n a 探针进 行s o u t h e r n 杂交和放射自显影后，即产生和获得反映生物个体特异性的r f l p 图 谱。 两株丝状真菌n 3 、n 9 的分类鉴定 这项技术的应用在真菌研究中较为普及，如f o r s t e r 等f 【2 l 利用r f l p 技术对疫霉 属( p h y t o p h t h o r a ) 真菌的6 个种的线粒体d n a 进行了多态性分析，发现这项技术不 仅可以区别种，甚至可以区别来自不同地理环境和寄主的种以下的分类单元亚 群。通过对线粒体d n a 限制性片段多态性分析，c r o f t 1 3 1 对曲霉属的两个种日本曲 霉s p e r g i l l u sj a p o n i c u s ) 与棘孢曲霉( a s p e r g i l l u sa c u l e a t u s ) 的分子特征与表型特征之 间的关系作了分析，经过研究，他们将日本曲霉与棘孢曲霉的菌株分成7 个不同的 线粒体d n a 的酶切片段群，并由此汪明线粒体d n a 的r f l p 的分析在对黑曲霉的 野生型分离株的特征界定上是一个非常有用的分析工具。 由于r f l p 分析数据多态信息量大，结果稳定可靠，重复性好，不受环境及菌 株发育阶段影响；只要有探针就可检测不同菌种或菌株的同源d n a 分子的r f l p ， 对于真菌种间亲缘关系的研究特别有用；同时限制性内切酶的种类很多，可选择各 种不同的限制性内切酶使r f l p 充分表现出来，这些特点使r f l p 成为一种十分重 要的遗传标记。用随机克隆的d n a 探针还可以检测到一定水平的r f l p 变异，这 对于检测真菌种内及种间的变异是十分有用的| l 。 传统的d n a 限制性片段长度多态性研究方法对样品纯度要求较高，而且d n a 杂交膜和探针的准备以及杂交过程都较为繁杂，加之，它不能检测靶序列中的重复 序列区，其多态性检测水平过分依赖于所选用的限制性内切酶的种类和数目，由于 不同的限制性内切酶识别位点的进化速率不同，因此，对于不同的进化靶序列，如 果选样不当就会导致分析结果出现偏差。近年来，将r f l p 技术与其它分析技术如 p c r 技术结合起来使用，部分克服了上述缺点，实现了不需要杂交和放射性标记的 r f l p 分析，同时由于p c r 技术的使用，使人们可以随意对真菌菌株的d n a 的不 同区段进行研究，这就使得对真菌的多态性分析变得快捷简便。但实际上，r f l p 还存在着分析困难( 片段太多) ，准确性不够( 在对菌株进行研磨提取d n a 时，d n a 会发生剪切) 等不足之处，因此在应用r f l p 进行研究时，应再结合其它方法，力求 作到结果准确。 2 2 3 - 2 扩增片段长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，a f l p ) a f l p 技术是于1 9 9 3 年发明的一种选择性扩增限制性片段的分析方法，它的出 现是对现有分子指纹技术的重大突破，它不仅是r f l p 和p c r 相结合的一种技术， 而且兼具了r f l p 和r a p d 两种技术的优点。其特点是多态性丰富，共显性表达， 不受环境影响，无复等位效应，而且还具有带纹丰富，用样量少，灵敏度高，快速 高效等特点。目前，这项技术正逐渐在真菌的分类及系统学研究中得到重视。 第章文献综述 a f l p 技术的基本原理是对真菌基因组d n a 限制性酶切片段进行选择性扩增， 目的d n a 经可产生粘性末端的r e ( 限制性内切酶) 酶切，产生的片段被连接上通用 接头，连接产物作为p c r 扩增的模板，引物是在接头互补顺序和r e 识别位点的基 础上增加1 3 个选择性核苷酸设计而成的，这样只有那些与引物的选择性碱基严 格配对的酶切片段才被扩增出来，通过调整引物3 端选择碱基的数目可获得丰富 的多态性。该技术的独到之处在于人工设计合成了限制性内切酶的通用接头以及可 与接头序列配对的专用引物，因此在不需要事先知道d n a 序列信息的前提下，就 可对酶切片段进行传统的p c r 扩增。扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶( p a g e ) 电泳 显示。在实验过程中，为了使酶切片段大小分布均匀，大都采取两个限制性内切 酶，一个酶为多切点，另一个酶的切点数较少，因此a f l p 反应过程中产生的主要 是两个酶共同酶切的片段。此外，设计的引物除了核心碱基序列和限制性内切酶识 别序列以外，引物的37 端还延伸出l l o 个数量不等的随机核苷酸碱基，通过选 用不同数量的这种碱基可以调节a f l p 产物的条带特异性和数量，从而提供较多的 基因组多态性信息。如选用不同的引物组合能够检出亲缘关系很近的品种的d n a 样品间极细微的差别，同时它还可以比较不同个体之间总基因组水平上的差异。运 用这项技术，1 9 9 8 年p a t c h a r a 【l “分析了黑胫茎点霉( l e p t o p h a e r i am a c u l a n s ) ，获得了 基因对基因假说的进一步证据。该技术也被用于禾谷镰孢( f u s a r i u mg r a m i n e a r u m ) 不 同来源分离株的鉴定和区别，也得到了极好的结果i l “。 但是，目前a f l p 技术是一项专利技术，且分析试剂盒价格昂贵，引物同位素 标记涉及到放射性安全等问题，此外，基因组的不完全酶切会影响实验结果，因此 对内切酶的质量要求较高，加之该项技术需要一套完整的设备与之匹配，这些都影 响到该项技术的应用与推广。 2 2 3 3 随机扩增多态性d n a ( r a n d o m l ya m p l i f i e dp o l y m o r p h i s md n a ，r a p d ) 随机扩增多态性d n a 技术( r a p d ) 是由杜邦公司的w i l l i a m s 【l ”和加利福尼亚生 物研究院的w e l s h 1 8 1 于1 9 9 0 年创立的一种分子标记技术，已成为近年来发展最快、 应用最广的一种标记技术。提出后短短几年中已应用于连锁标记检测主基因、建立 遗传图谱、确定染色体的同源发生、基因的染色体定位、图谱分析以及分类、杂种 和品种的鉴定方面1 9 1 ，这种技术也很快应用到微生物分类鉴定上【2 0 】。 r a p d 是建立在p c r 技术之上，是以一条碱基顺序随机排列的单链寡核苷酸 ( 一般为1 0 个碱基长度) 为引物，对所研究的生物的基因组d n a 进行p c r 扩增。扩 增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或琼脂糖凝胶电泳分离，经e b 染色来检测扩增产 _ 曲株丝状真苗n 3 、n 9 的分类鉴定 物d n a 片段的多态性。对于任一条特定的引物，它同基因组d n a 序列有其特定的 结合位点，这些特定的结合位点在基因组d n a 的某些区域内的分布如果符合p c r 扩增的条件，即引物在模板的两条链上有互补的位置，且引物的37 端相距在一定 的长度范围内( 一般小于2 k b ) ，就可以扩增出d n a 片段。如果基因组在这些区域发 生d n a 片段的插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定的结合位点分布发生相 应的变化，而使得r c r 产物增加、缺少或发生分子量的变化。通过对p c r 产物的 分析检测即可得到基因组d n a 在这些区域的多态性。 r a p d 能够进行多态性检测的原理是：r a p d 所用的一系列引物的d n a 序列各 不相同，但对于任一特定的引物，它基因组d n a 序列有其结合位点。由于进行 r a p d 分析可用引物数目很多，虽然对每一个引物而言检测d n a 多态性的区域是 有限的，但是利用同一系列引物就可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。因此， r a p d 技术从理论上将可以对整个基因组进行多态性检测。利用r a p d 对不同菌株 的p c r 扩增，再对获得的多态性资料进行聚类分析，可以了解它们彼此之间的同缘 程度，从而确定它们的亲缘关系和进化地位。作为一种p c r 技术的延伸应用， r a p d 反应具有其自身的特点，区别于常规的p c r 反应叫： ( 1 ) 无须专门设计r a p d 扩增反应的引物，一般使用( g + c ) m 0 1 高于4 0 的 1 0 个碱基长度的随机合成的寡核苷酸作为引物。 ( 2 ) 在r a p d 反应中，只加入一个引物而不