（细胞生物学专业论文）鱼类il15及其受体α链基因家族的分子克隆、进化和功能研究.pdf

浙江大学博士学位论文摘要 摘要 本文第一章绪论分三部分，分别介绍了i l 一1 5 基因克隆与结构、表达调控机 制、信号转导途径、i l 1 5 r a 基因克隆、表达调控、选择剪接、运输机制以及免 疫生物学功能等。 第二章至第五章为实验研究，第二章主要研究了河豚白介素1 5 ( i l 1 5 ) 基 因克隆、组织分布及表达规律、原核表达，并利用比较基因组学方法，分析了脊 椎动物i l 1 5 分子的进化规律。第三章研究了河豚i l 2 基因的分子克隆，及另一 个首次发现的鱼类特异的i l 2 样的细胞因子( i l 2 l ) ，鉴定了两者的组织分布 和表达规律，并分析了i l - 2 ，i l 2 l 和i l 一2 1 的进化关系及分子进化规律。第四章 研究了河豚i l 1 5 的特异性受体( i l 1 5 r a ) 的基因克隆，原核表达，抗体制备 与组织分布。发现河豚i l 1 5 r a 存在两种形式的基因，分别含有一个或两个细胞 因子结合结构( s u s h id o m a i n ) ，并命名为s s l l - 15 r a ( s i n g l es u s h ii l 15 r a ，单 s u s h i 结构的i l 1 5 r a ) 和d s l l 1 5 r a ( d o u b l es u s h ii l 1 5 r a ，双s u s h i 结构的 i l 1 5 r a ) ，并证实后者由鱼类特异的全基因组复制和外显子洗牌事件产生，并 发现两种受体都能不同程度的结合i l 1 5 或i l 一2 。之后，我们又克隆并鉴定了虹 鳟鱼的i l 1 5 r a 基因，证实鱼类特异的全基因组复制确实影响了硬骨鱼i l 1 5 r a 基因。 第五章中，我们重点用比较基因组学和生物信息学计算方法，重建了各种脊 椎动物i l 1 5 r a 和i l 2 r a 基因序列的亲缘关系。分析了基因复制和外显子洗牌对 于新基因产生的重要意义，及相关分子的相对进化速率和协同进化趋势。综合以 上结果，提出了i l 1 5 r a 和i l 2 r a 基因的进化模型。 关键词：i l 1 5 ，i l 1 5 r a ，i l 2 ，i l 2 l ，基因复制，外显子洗牌，内含子插入， 选择剪接，硬骨鱼 浙江人学博士学位论文摘要 a b s t r a c t c h a p t e r1o ft h i sd i s s e r t a t i o ni sa ni n t r o d u c t i o no ft h er e c e n tr e s e a r c h e so ni l - 15 a n di t ss p e c i f i cr e c e p t o ri l 一15 r a i tw a sd e s c r i b e di nt h r e ep a r t s i nt h ef i r s tp a r t ，w e m a i n l yi n t r o d u c ei n t e r l e u k i n 一15 ( i l - 15 ) i n c l u d i n gi t sd i s c o v e r y , m o l e c u l a rc l o n i n g , g e n es t r u c t u r e ，r e g u l a t o r ym e c h a n i s m so f i t se x p r e s s i o n ，a sw e l la si t sr e c e p t o r sa n d t h ec o r r e s p o n d i n gs i g n a lp a t h w a y s ；a n dt h es e c o n dp a r ti n t r o d u c e st h em o l e c u l a r c l o n i n ga n dc h a r a c t e r i z a t i o no fi l 一15 r a ( i l 一15r e c e p t o ra l p h ac h a i n ) g e n e ，i n c l u d i n g i t s e x p r e s s i o n a n dv a r i o u st y p e so fa l t e r n a t i v es p l i c i n g i l - 15 r as p e c i f i c a l l y r e c o g n i z e s i l - 15i na nu n u s u a l l yh i 曲a f f i n i t y , w h i c hc o u l da c c o u n tf o ri t s c o s e c r e t i o n 谢mi l - 15 ，t h ev a r i o u se f f e c t so fs o l u b l ei l - 15 r a ，a n dt r a n s p r e s e n t a t i o n o fi l 15s i g n a l i nt h et h i r dp a r t ，w ei n t r o d u c et h eb i o l o g i c a lf u n c t i o n so fi l 一15a n d i l - 15 r ao nd i f f e r e n tt y p e so fi m m u n e r e l a t e dc e l l s ，i n c l u d i n gn a t u r a lk i l l e r , t c r a i b t l y m p h o c y t e sa n ds oo n ，a sw e l la si l 一15 i l - 15 r a e f f e c t si nt h ep a t h o l o g i e so fs o m e i m m u n ed i s e a s e s c h a p t e r s2 - 5a r et h ed e s c r i p t i o no ft h em a i nr e s e a r c h e s i nc h a p t e r2 ，w e p e r f o r m e dt h em o l e c u l a rc l o n i n ga n dc h a r a c t e r i z a t i o no ft h ei l - 1 5 so r t h o l o g u ef r o m t e t r a o d o nn i g r o v i r i d i s ，at e l e o s ts p e c i e s ，a sw e l la si t sp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o ni ne c o l i a n dt h ep u r i f i c a t i o no fs o l u b l er e c o m b i n a n tp r o t e i n b yc o m p a r a t i v eg e n o m i c sa n d b i o i n f o r m a t i c sm e t h o d s ，w ec a r r i e do u tt h es t u d yo nt h ee v o l u t i o no fv e r t e b r a t e si l - 15 g e n e s ，i n c l u d i n gaf i s hs p e c i f i ci l - 15 xg e n e ，w h i c ht h o u g h tt ob eap a r a l o g u eo f i l 一15a r i s e nf r o mg e n ed u p l i c a t i o n i nc h a p t e r3 ，w eg a v eo u ri n v e s t i g a t i o ni n t ot h em o l e c u l a rc l o n i n g , t i s s u e e x p r e s s i o na n dp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o no ft e t r a o d o ni l - 2a n di l 一2 lg e n e s i l - 2 li sa n o v e l4 - ah e l i xc y t o k i n ew h i c hr e p o r t e df o rt h ef i r s tt i m ea n di ts p e c i f i c a l l ye x i s ti n s o m eb o n yf i s h e s a sa n o t h e rc o p yo ft h ec o m m o na n c e s t r a lg e n es h a r i n gw i t hi l - 2 a n di l 一2 l ，w ep e r f o r mt h ea n a l y s i si n t ot h e i re v o l u t i o n a r yr e l a t i o n s h i p sa n dt h e m o l e c u l a re v o l u t i o n s c h a p t e r4d e s c r i b e dt h ei n v e s t i g a t i o no ft e t r a o d o ni l - 15 r a ，i n c l u d i n gi t s m o l e c u l a rc l o n i n g ，p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n ，p r e p a r a t i o no fm u l t i c l o n a la n t i b o d y , a n d i i i 浙江大学博士学位论文摘要 t i s s u ee x p r e s s i o nb yw e s t e r nb l o t t i n g w ef o u n dt w os u b t y p e so ft e t r a o d o ni l - 15 r a ， c o n t a i n i n go n eo rt w os u s h id o m a i n sr e s p e c t i v e l y , w h i c hc o r r e s p o n d i n gt oc y t o k i n e b i n d i n g t h u s ，w en a m e dt h e ma ss s l l 一15 r a ( s i n g l es u s h ii l - 15 r a ) a n dd s l l - 15 r a ( d o u b l es u s h ii l - 15 r a ) ，a n dc o n f i r m e dt h a td s l l 一15 r a w a sa r i s e nf r o mf i s hs p e c i f i c g e n o m ed u p l i c a t i o na n daf o l l o w i n ge x o ns h u f f l i n ge v e n t b yc o m p a r a t i v eg e n o m i c s a n a l y s i s ，i tw a sa p p r o v e dt h a ti l - 2 r ag e n eo fh i g h e rv e r t e b r a t e sw a sac o p yo f i l 一15 r at a n d e md u p l i c a t e d ，a n df i s hi l - 15 r am a yp l a y e da sa l li l 一2r e c e p t o r b y c y t o k i n ea n dr e c e p t o rb i n d i n ga s s a y , b o t hs s l l - 15 r aa n dd s l l 一15 r aw a sf o u n d d i f f e r e n tc a p a b i l i t yi ni l 一2o ri l 一15b i n d i n g ，a n dd s l l 一15 r as h o w e dac o m p a r a t i v e l y h i g h e rc a p a b i l i t y , w h i c hs u g g e s t e dt h a tb o t hs u s h id o m a i nc o u l dc o n t r i b u t e dt o c y t o k i n eb i n d i n g i nt h i sc h a p t e r , w ea l s oc l o n e da n dc h a r a c t e r i z e di l - 15 r ag e n e f r o mo n c o r h y n c h u sm y k i s s ，a n dt e s t i f i e dt h a tt h e r ew e r et w oc o p i e so fi l 一15 r ai n o t h e rt e l e o s ts p e c i e s i nc h a p t e r5 ，w em a i n l yr e c o n s t r u c t e dt h ep h y l o g e n yo fi l - 15 r aa n di l - 2 r a g e n e st h r o u g h o u t v e r t e b r a t e s p e c i e s ，b ym u l t i p l ec o m p a r a t i v eg e n o m i c sa n d b i o i n f o r m a t i c sm e a n s f u r t h e r m o r e ，b o t hg e n ed u p l i c a t i o n sa n de x o ns h u f f l i n gp l a y e d i m p o r t a n tr o l e si nt h ee v o l u t i o no fi l 一15 r aa n di l 一2 r a ，a n dt h er e l a t i v ee v o l u t i o n a r y r a t e sw e r ec h a n g e ds i g n i f i c a n t l ya f t e rt h e s ee v e n t s o nt h eo t h e rh a n d ，t h e r ew a sa v e r yp o s s i b i l i t yo ft h ec o - e v o l u t i o nb e t w e e ni l 一15 r aa n di l - 15 ，鹊w e l la si l 一2 r a a n di l - 2 b a s e do nt h ea b o v er e s e a r c h e s ，w eg a v eo u r h y p o t h e s i so nt h ee v o l u t i o no f v e r t e b r a t e si l 一15 r aa n di l 2 r af a m i l y k e yw o r d s ：i l - 15 ，i l - 15 r a ，i l 一2 ，i l - 2 l ，g e n ed u p l i c a t i o n ，e x o ns h u f f l i n g , i n t r o n i n s e r t i o n ，a l t e r n a t i v es p l i c i n g , t e l e o s t i v 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝姿盘堂或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：吾谚辛 答字r 期7 年“仰 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 逝婆盘堂 有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权迸姿盘堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：专刁乍 导师签名 学位论文作者签名：巧t p 导师签名： 签字日期：沙户7 年易月f 。司 幻、咖 期：矽月【噌 浙江大学博士学位论文 致 谢 致谢 本研究论文是在尊敬的导师邵健忠教授的悉心指导和帮助下完成的。在 5 年的研究生活中，导师严谨的治学态度、渊博的学术知识、求是创新的精神， 务实的工作作风和朴素的生活作风都使我获益良多，引领着我熟悉并热爱上科学 研究，也必将在今后的工作和学习中深深地影响我。在工作和生活中，我也得到 了师母项黎新老师的大力支持和帮助，在此向两位老师谨致以崇高的敬意和衷心 的感谢! 还要感谢实验室的师兄师姐：刘欣梅，金红建，周庆军，孟真，潘雪霞，杨 再峰，黄洪敏，胡若真，董伟仁，林慧芳，洪旭涛，他们不厌其烦地教我实验思 路和技能，给予我无私的帮助；感谢一起工作过的同学：陈烨，温轶，王惠菊， 陈颖，陈小永，巩永凤，胡瑜兰，林爱福，潘若浪，张瑞鹏，刘慧慧，熊燃，顾 一峰，施科云，金阳，潘萍萍，王浩，王渠龙，张晓蕾，李雄峰，孙荷，张卉， 潘新民，卢忆奇，于岱永，张小瑜，赵晶，武小嫒，黄艳丹，郦佳慧，陈书韵， 邢雅兰，黄路，申佳，李嵩杰，孙莉莉，项健行，刘清波，何丁，王萍，朱律韵， 杨超；感谢他们在实验和生活中给我的关心、帮助和支持。 更要感谢的是生我养我的父母，是他们带我来到这个世界，教会我做人，不 管在哪里都永远从心底支持着我，陪伴着我勇敢地向前走。 最后向所有关心、理解和支持我的老师、同学、家人和朋友们表示最衷心的 感谢! 方玮 2 0 0 9 夏于启真湖畔 浙江大学博士学位论文l 绪论 1 绪论 白介素1 5 ( i n t e r l e u k i n 1 5 ，i l 1 5 ) 是白介素家族的重要成员之一，它与i l 2 ， 3 ，4 ，6 ，7 ，g c s f ( 粒细胞集落刺激因子) ，g m c s f ( 粒细胞巨噬细胞集落刺 激因子) 等同属于四螺旋细胞因子家族。自上世纪9 0 年代中期i l 1 5 及其特异 性受体i l - 1 5 r a 被发现以来，有关它们在获得性免疫和天然免疫中的研究进展非 常快速，并发现了许多i l 1 5 i l 1 5 r a 特有的生物学性质。本文对i l 1 5 和i l 1 5 r a 的生物学及分子机制、对免疫细胞的调节及其与相关疾病的关系等研究现状及进 展作一介绍。 1 1 白介素1 5 1 1 1 i l 1 5 基因 i l 1 5 最初由g r a b s t e i n 等从猴肾细胞株c v - 1 e b n a 的条件培养上清液中被 发现，其分子量为1 4 1 5 k d ，具有刺激i l 2 依赖的t 细胞系c t l l 2 增殖的功能 1 】。几乎同时，b 锄o r d 等从人类t 细胞白血病病毒1 ( h u m a n tc e l ll y m p h o t r o p i c v i r u st y p ei ，h t l v - i ) 感染的细胞系h u t - 1 0 2 的上清液中也纯化得到了这种蛋 白质，并命名为i l t 2 。随后发现，i l t 即为i l 1 5 。最初鉴定的人i l 1 5 e d n a 包括至少3 1 6 b p5 u t r ( u n t r a n s l a t e dr e g i o n 非翻译区) ，4 8 6 b po r f ( o p e nr e a d i n g f r a m e ，开放阅读框) 和至少4 0 0 b p 的3 u t r ，所编码蛋白质包含1 6 2 氨基酸( 舱) ， 其中n 末端4 8 个a a 为信号肽序列。成熟蛋白质含有1 1 4 a a ，分子量在1 4 1 5 k d 。 同时，人的i l 1 5 与猴i l 1 5 蛋白序列9 7 同源，与小鼠i l 1 5 蛋白序列7 3 同 源 1 】。i l 1 5 成熟肽含有两个分子内二硫键( c 3 5 c 8 5 ，c 4 2 一c 8 8 ) ，两个乙酰化 位点( n 7 9 ，n 1 1 2 ) 。1 1 5 ，1 8 5 7 ，6 5 7 8 ，9 7 1 1 4 位的氨基酸残基分别形成四 个0 【螺旋 3 】。 人白介素1 5 ( h l l 1 5 ) 基因定位在4 号染色体q 长臂，分布在3 4 k b 的区域 中 4 】。由9 个外显子、8 个内含子组成，其中7 个为编码外显子，包括一个选择 使用的4 a 号外显子【4 ，5 】。后续鉴定到另一种人i l 1 5 的e d n a ，含有这个额外 浙江大学博士学位论文 l 绪论 存在的4 a 外显子，并丢失了1 号和2 号外显子。这种i l 1 5 产生原因，可能因 为选择剪接或是受到某个潜在的启动子所控制。这种c d n a 的翻译产物较正常转 录更短，主要区别于它们的信号肽序列长度，分别为4 8 a a 和2 1 a a ，但编码相同 的成熟肽。因此，分别命名为l s p i l - 1 5 和s s p - i l - 1 5 ( 1 0 n gs i g n a lp e p t i d e i l 一1 5 ， s h o r ts i g n a lp e p t i d e i l 1 5 ) 【6 ，7 】，如图1 1 所示。它们存在着不同的细胞定位： 用绿色荧光蛋白标记的l s p i l 1 5 主要分布在内质网一高尔基体，而s s p i l 一1 5 则定位在细胞质和细胞核内 6 ，8 】。从小鼠中也鉴定到了类似的选择剪接形式， 不同的是，小鼠的s s p i l 1 5 采用的是一个e x o n 5 的选择剪接位点，而非额外的 4 a 外显子【9 】。除上述提到的s s p i l - 1 5 ，i l 1 5 在转录水平上还存在数种可变剪 接。t a n 等在小鼠肠道上皮细胞中发现了两种不同的选择剪接方式：i l 1 5 d e l t a e 6 和i l - 15 d e l t a e 7 。它们分别缺失e x o n 6 全长和e x o n 75 端部分序列，所编码的蛋 白质与l s p i l 1 5 相比，分别少1 5 和1 6 a a 。通过结构预测发现了显著的变化， 暗示这两种产物可能发挥了不同的调控作用 1 0 】。 e x o n l2344 a5678 一ll h 墨一一曩一l l 一_ 一 l 舡一1 5 7 、s f ：r 1 5 明翟圈豳圈 l 乎( 4 6 羽) 1 1 - - 15 ( 11 4 铂) 二= 圈图豳豳豳 3 4 ，5 5 6 ，7 ，8 e x o n 23 44 a5 6 7 8 暖冒函圈_ s 尹( 2 l a a )i l 1 5 ( 11 4 a a ) 】髓魉搦豳 4 a , 5 5 ，6 ，7 ，8 图1 1l s p i l 1 5 与s s p i l 1 5 转录与翻译 1 1 2i l 1 5 表达调控机制 转录水平的i l 1 5 广泛存在于多种组织器官和细胞类型。在人和小鼠的研究 发现，i l 1 5 可以在心脏、肺、肝脏、脾脏、骨骼肌、皮肤、单核细胞和巨噬细 胞中检测至l j 1 ，1 1 ，1 2 】。同时，a p c 类细胞( 抗原递呈细胞) ，包括血液来源的 d c 细胞，高表达的i l 1 5 及其蛋白，暗示它可能会吸引并激活t 细胞 1 3 ，1 4 】。 而i l 1 5 在骨髓基质细胞，胸腺上皮细胞，胎儿肠道上皮细胞中的表达，则暗示 它在造血系统中的作用【1 ，1 5 1 7 】。 2 浙江大学博上学位论文 l 绪论 虽然转录水平的i l 1 5 表达广泛且表达量较高，但蛋白质水平的i l - 1 5 在血 清或培养细胞的上清中却很难被检n n 5 ，8 ，1 8 。原因可能是不同水平的：主要 包括了对i l 1 5 转录，翻译，胞内运输及分泌的调控。首先，从转录调控来说， i l 1 55 端转录调控区有多个调控位点，包括a i f n 2 ，n f i l - 6 ， t - i r e ， m y b ， g c f 和n f 1 d 3 等 1 9 ，2 0 。其中n f r d 3 分布在转录起始位点上游一7 5 6 5 ，并对 小鼠巨噬细胞受h t l v 1 的t a x 蛋白诱导的i l 1 5 转录和受l p s 诱导的i l 1 5 转录密切相关 2 0 1 。除此之外，删除转录起始位点上游2 0 1 - ，1 4 1 对i l 1 5 的转 录水平有较大影响1 1 9 1 。而接近5 帽子区域的一3 4 8 - 一一3 3 6 为0 r v ) e ( 必需干扰素 调节因子) 结合区，直接影响i l 1 5 转录和n k 细胞发育相关 2 0 ，2 1 。其次，在 翻译上，i l 1 5 的5 u t r 中包含了多个翻译起始位点( a u g ) ，例如人i l 1 5 的 5 u t r 就含有1 2 个a u g 。【1 ，2 2 】多a u g 存在已被证明会影响转录子的翻译效 率 2 3 1 。b a m f o r d 等移除了上游的8 1 0 个a u g ，发现其翻译水平可以提高5 1 0 倍 2 2 】。最后，特殊的信号肽l s p 和s s p 可能控制了i l - 1 5 的翻译，胞内运输和 分泌。s s p i l 1 5 可以有效翻译，但不能分泌到胞外；而l s p i l 1 5 翻译效率相 对低，但是却可以经内质网高尔基体经典途径分泌 6 ，1 8 】。研究发现，用c d 3 3 或l g v l l z 的信号肽替换i l 1 5 自身信号肽后，i l 1 5 的分泌水平可以显著提高【7 ， 2 4 ；或用i l 2 的信号肽替换原有的i l 1 5 信号肽，能够有效提高转染的c o s - 7 的i l 1 5 分泌【6 】。另外，在移除多个a u g 、替换l l 2 信号肽后，将f l a g 标签 融合到c 末端后，i l 1 5 的生物合成提高了2 5 0 倍，暗示i l 1 5 蛋白c 末端可 能会有潜在的抑制作用 2 5 】。除上述原因外，最近的研究表明i l 1 5 的特异性受 体i l 1 5 r a 会与i l 1 5 在胞内结合并影响i l 1 5 转运和分泌。这一部分将在下文 作详细阐述。 1 1 3i l 1 5 的受体及信号传导 白介素1 5 受体复合物被认为是由3 个不同的亚单位组成，包括a ，p ，托三 个独立的组成部分，如图1 2 所示。复合物的各个组成部分与i l 1 5 亲和程度不 同。a 链作为特异性识别受体，可以高度亲和i l - 1 5 ( k a = 1 0 1 1 m 。1 ) 2 6 】，将在下 文做详细介绍。1 3 ( c d l 2 2 ，p 7 5 ) 和丫c ( c d l 3 2 ，p 6 4 ) 为i l - 2 和i l 1 5 共用，主要 承担信号传导功能。它们组成的异源二聚体可以中度亲和i l 1 5 ( k a = 1 0 9 m j ) ， 3 浙江大学博十学位论立 浙江大学博士学位论文 l 绪论 s y k 等；以及p 1 3 - k i n a s e 和a k t 通路；诱导产生抗凋亡作用的线粒体蛋白质 b c l 2 3 6 3 9 。此外，i l 15 r a 也会引起可能的胞内信号传导。后文将作详述。 除上述异源三聚体外，在肥大细胞表面还存在另一种分子量为6 0 6 5 k d a 的 i l 1 5 受体，i l - 1 5 r x 。它并不与上述的p 或丫链形成复合体，却能激活不同的 信号通路。包括招募j a k 2 导致s t a t 5 的磷酸化，或通过t y k 2 导致s t a t 6 的 磷酸化 4 0 ，4 1 。 1 2 白介素1 5 受体q 链 1 2 1i l 1 5 r a 基因 人i l - 1 5 r a 定位在1 0 号染色体p 1 5 p 1 4 上，由8 个外显子和9 个内含子组成， 包括一个选择使用的7 号外显子 4 2 ，4 3 。人i l 1 5 r a 属于i 型跨膜受体，由3 2 a a 的信号肽，1 7 3 a a 胞外区，2 1 a a 的跨膜区和3 7 a a 的胞内区组成，并具有多个n 或o 糖基化修饰位点。其胞外区从n 端到c 端依次为s u s h i 结构域，结合区( 1 i n k e r r e g i o n ) 和脯苏氨酸富集区( p r o t h rr i c hr e g i o n ) 【4 4 】。其中，s u s h i 结构域又称 补体控制蛋白分子( c o m p l e m e n tc o n t r o lp r o t e i n ，c c p ) 或短共有序列重复( s h o r t c o n s e n s u sr e p e a t s ，s c r ) ，含有大约6 0 个氨基酸残基，广泛存在于补体分子和 粘附分子。s u s h i 结构域具有共同的d 片层三明治结构：一面由3 条1 3 链组合通 过氢键在分子中心形成三链区域，而另一面则主要包括了2 条独立的b 链【4 5 】。 1 0 2 r a l l 1 5 r a 图1 3i l 2 r a 与i l 1 5 r a 结构比较示意图 人和小鼠的i l 1 5 r a 与i l 2 r a 具有相似的基因结构和蛋白质结构，被认为 是一个新的受体家族的成员。它们的基因座位紧邻，提示两者可能源于相同的祖 先基因 4 4 ，4 6 。虽然i l 1 5 r a 和i l 一2 r a 编码序列不同，但胞外区都含有s u s h i 结构域。不同的是，i l 2 r a 编码了两个s u s h i 结构域，而i l 1 5 r a 仅编码一个 4 4 】。 但两者与相应配体的亲和力大不相同：i l 1 5 r a 高度亲和i l 1 5 ( k a = 1 0 m j ) ， 但i l - 2 r a 与i l 2 亲和度仅为( k a = 1 0 8 m d ) 【2 6 】。后续研究发现，与其他细胞 浙江大学博十学位论文1 绪论 因子与受体相互作用中主要以氢键为主相比【4 7 】，i l - 1 5 i l - 1 5 r a 互作界面还有大 量离子键参与 4 8 ，4 9 。这也许是i l 1 5 i l 1 5 r a 之间的高度亲和的原因。对 i l 1 5 i l 1 5 r a 和i l 2 i l 一2 r a 晶体结构的解析和比较，发现虽然两者序列上存在 较大差异，但拓扑结构类似【5 0 】。i l 2 r a 的两个s u s h i 结构域之间存在p 片层交 换并形成复和的s u s h i 结构，但主要的相互作用界面仍然由第一个s u s h i 结构域提 供。而i l 1 5 i l - 1 5 r e 只存在一个s u s h i 结构域，所以并不存在p 片层交换 4 7 ，5 1 1 。 1 2 2i l 15 r a 表达与选择剪接 和i l 1 5 相似，i l 1 5 r a 也有着广泛的表达谱。在t 细胞、b 细胞、n k 细 胞、巨噬细胞、外周血单个核细胞、胸腺、骨髓、脑组织、肠道和肝脏中都可以 检测到i l - 1 5 r a 的表达 2 6 ，4 4 ，4 6 ，5 2 ，5 3 1 。目前已知，人t 淋巴细胞i 型病毒 ( h t l v i ) 会引起i l 1 5 r a 转录水平上调。m a r i n e r 等的研究鉴定到了i l 1 5 r a 基因上游的n f r b 结合位点，并说明h t l v i 的t a x 蛋白通过激活n f 1 出通路 来调控i l 1 5 r a 基因转录的 5 4 】。 i l 1 5 r a 具有多种选择剪接，目前在人类中发现有8 种。剪接的主要形式包 括：2 号外显子缺失，3 号外显子缺失，选择性使用7 号或7 号外显子 4 2 ，4 4 】。 在小鼠肥大细胞中，还发现了缺失4 号外显子，3 - 4 号外显子，或3 5 号外显子 的选择剪接。与全长i l 1 5 r a 相比，它们引起的信号可能有所不同 3 6 】。这些 受体亚型在不同细胞种类中表达，并定位在细胞膜、内质网和高尔基体。而含有 2 号外显子，即含有s u s h i 结构域的受体亚型还发现定位在细胞核膜 3 6 ，4 2 】，这 暗示了s u s h i 结构域可能含有某种核定位信号 4 2 】。另外，缺失2 号外显子的受 体亚型不能结合i l 1 5 ，暗示了它对i l - 1 5 结合的必要性 4 2 】。 1 2 3i l 1 5 r a 与i l 1 5 共分泌 上文提到，除了在细胞膜表面分布外，在内质网和高尔基体膜系统中也发现 有i l 1 5 r a 分布。这暗示i l - 1 5 r a 也通过经典的蛋白质合成分泌途径，转运到细 胞膜。最近的研究发现，i l 1 5 r a 还可能充当了i l 1 5 分子伴侣，以此作为另一 种方式调节i l 一1 5 分泌，如图1 4 所示。b e r g a m a s c h i 等发现，在同种细胞中共表 达i l 1 5 和i l 1 5 r a ，两者会通过形成稳定的复合体，有效提高两者的分泌水平。 6 浙江大学搏十学位论文 i 绪论 当缺少i l 1 5 r a 时，大部分i l 1 5 在合成后会迅速降解。共注射i l 1 5 和i l 1 5 r a 质粒的小鼠，血清中i l 1 5 水平和活性都得到显著提高。肺部，肝脏和脾脏中的 n k 细胞和t 细胞数量，以及c d 4 4 高表达的记忆型细胞数量显著增加【5 5 】。随 后，d u i t m a n 等的研究说明合成的i l 1 5 可以不依赖与i l 1 5 r a 定位到内质网系 统，但无法有效地运送到高尔基体。但在没有i l - 1 5 r a 存在时，i l 1 5 只能定位 在胞内，而无法有效分泌。在与内质网中的i l 1 5 r a 结合后，i l 1 5 才能有效转 运到高尔基体，并通过转运小体运送到细胞膜外。转染全长i l 1 5 r a 到不分泌 i l 1 5 的细胞系，可以大大提高i l 1 5 分泌水平。此外，d u i t m a n 等还鉴定到胞内 的确存在i l 1 5 r a i l 1 5 复合体【5 6 】。这些研究很好地解释了多种细胞类型共表 达i l 1 5 和i l 1 5 r a 的原因。 1 2 4 可溶性i l 1 5 r a 受体 除了膜型受体外，i l - 1 5 r a 通过依赖t n f a 转化酶( t a c e a d a m l 7 ) 活性 的方式，自发地或在p m a 诱导下从细胞膜表面脱落，成为可溶性受体，如图1 4 所示。该种方式可以被金属蛋白酶的抑制剂g m 6 0 0 1 等所抑制。脱落的受体可能 作为高亲和力的拮抗剂，而影响i l 1 5 与膜受体的结合 5 7 ，5 8 。小鼠s l l 1 5 r a 因n 糖基化修饰，分子量大约为3 0 k d 。n 糖苷酶作用后，分子量减少为2 6 k d 。 而人的s l l 1 5 r a 分子量大约为4 2 k d ，并有可能也发生了n 糖基化修饰。在血清 或细胞条件培养基中都可以分别检n n 5 7 ，5 8 。这种s i l - 1 5 r a 可能也作为参与 调节血清中i l 1 5 浓度的机制之一。但另一方面，s l l 1 5 r a 又会延长i l 1 5 的半 衰期，并起缓释i l 1 5 作用。而重组表达的可溶性s u s h i 结构域可以作为激动剂， 结合i l 1 5 形成配体受体复合物或与i l 1 5 融合表达后，通过i l 2 1 5 r 1 3 7 活化目 的细胞 5 9 】。而另一方面，这种重组产物又有可能拮抗i l 1 5 引起的炎症反应 6 0 】。 而近期在小鼠r e n c a 和l 9 2 9 细胞系中又发现了两种新型的i l 1 5 r a 选择剪接 方式，如图1 4 所示。它们都缺少3 7 号外显子，翻译成为具有i l 1 5 结合能力 的可溶性受体。这种方式产生的可溶性受体可以促进i l 1 5 介导的c t l l 细胞系 增殖和n k 细胞表达i f n - t 6 1 。由此来看，在不同条件下，i l 1 5 r a i l 1 5 可能 会引起复杂的生物学反应。其机制还有待进一步研究。近期研究发现，s l l 1 5 r a 的结抗作用主要由3 号外显子，特别是n 段紧邻2 号外显子编码区的1 3 a a 引起。 7 浙江人学博+ 学位论文l 绪论 这1 3 a a 会影响i l 1 5 i l 1 5 r a 解离率，提高复合体的稳定性，并参与了l o 一2 0 相互作用界面。从空间结构上来看，它限制了s i l 1 5 r i l 1 5 复合体与膜定位 的i l 一15 r 1 3 ) 或i l - 15 r a l 弘复合体结合【6 2 】。 1 2 5i l 15 r a 参与的信号转导 相对于主要信号转导作用的p 链与y 链，i l 1 5 r a 胞内区较短，仅含有3 7 a a ， 但相比i l 一2 r a 胞内区( 1l a a ) 更长。i l 1 5 r a 链胞内区并不具有明显的信号传导 区域，结合位点或磷酸化位点。在最初的研究中，研究者去除了i l 1 5 r a 的胞内 区，所引起的细胞增殖效果与全长i l 1 5 r a 的效果并没有显著区别，所以一度 i l 1 5 r a 被认为不直接参与信号转导 4 4 】。但后续研究表明，虽然i l 1 5 r a 胞内 区比较短，仍可能参与了i l 1 5 引起的胞内信号通路。首先，仅表达i l - 1 5 r a 但 不表达d 链的结肠上皮细胞系t 8 4 ，却能对i l 1 5 作出反应，并转导相关信号 6 3 】。 在人b 细胞系r a j i 表面的i l 1 5 r a 可以招募s y k 激酶到胞内区的2 2 7 位的酪氨 酸位点并激活相关通路，从而减少由c 2 神经酰胺诱导的凋亡细胞 6 4 】。但这种 结合对b 细胞发育和功能调控可能并非必需，因为i l 1 5 r a 叫一小鼠的b 细胞功 能并未表现出异常 6 5 】。在i l - 1 5 诱导下，l 9 2 9 细胞系表面的i l 1 5 r a 可以与 t r a f 2 ( t n f r a s s o c i a t e df a c t o r2 ，t n f r 相关因子2 ) 结合，并激活n f r d 3 通 路，使l 9 2 9 细胞免于t n f 仅诱导的凋亡 6 6 】。在最近的研究中，研究者交换了 i l 1 5 r a 与i l 2 r a 的胞内区，培养出的带有i l 1 5 r a 胞外区i l 2 r a 胞内区杂合 受体的k n o c k i n 小鼠。与正常小鼠相比，这种k n o c k i n 小鼠表现出n k ，n k t ， c d 8 + t 细胞的减少，而这些细胞发育与i l 一1 5 信号密切相关。因此提示i l 1 5 r a 胞内区确实具有一定的信号转导能力，并与这些细胞发育相关【6 7 】。 1 2 6 反式递呈( t r a n s p r e s e n t a t i o n ) 除参与组成i l 1 5 复合受体外，i l 1 5 r a 还参与了一种独特信号传递方式。 膜表面单独表达i l 1 5 r a 的细胞特异性结合i l 1 5 后，通过细胞接触与邻近的仅 表达i l - 2 1 5 r 1 3 7 目的细胞的受体结合，进而将活化目的细胞对i l 1 5 的反应 6 8 1 。 这种信号传递方式被称为反式递呈( t r a n s p r e s e n t a t i o n 或p r e s e n t a t i o ni nt r a n s ) ， 如图1 4 所示。这种新型的信号传递方式，最早由d