（细胞生物学专业论文）栉孔扇贝cfdmrt4like基因的克隆、表达及功能分析.pdf

栉子l 扇贝c f - d m r t 4 一l i k e 基因的克隆、表达及功能分析 学位论文完成日期：2 q ! q 生鱼目 指导教师签字： 答辩委员会成员签字。二巫八八 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 洼! 垫塑查基丝益薹犍型直明笪! 奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：l ，马傲大签字日期：沙j 口年bn 妒日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，并同意以下 事项： 1 、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。 2 、学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学“中 国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社”用于出版和编入c n k i 中国知识资源总库， 授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 吗落天 导师签字： 彩唧 i 签字日期：pl 年6 月中日签字日期：讪f o 年6 月峰日 中国海洋大学博士学位论文 栉孔扇贝c f - d m r t 4 1 i k e 基因的克隆、表达及功能分析 摘要 对动物性别决定和性腺发育相关基因的研究是发育生物学重要的研究内容 之一，也是水产养殖业中性别人工控制的理论基础。d m r t 基因最早是在果蝇和 线虫中发现，随后在从无脊椎动物到哺乳动物的多种物种中均可获得d m r t 基因， 该家族蛋白享有共同的d m 保守结构域，并在一定程度上显示了功能的保守性。 在脊椎动物中它们参与了诸如性别决定、性腺分化和发育以及个体发育、组织功 能维持等生物学过程。 本文采用同源克隆技术，从栉孔扇贝精巢中克隆了d m r t 基因家族中的 c f - d m r t 4 - l i k e 基因的全长c d n a 及其2 个拼接片段c f - d m r t 4 a l i k e 和 c f - d m r t 4 b l i k e ，分析了它们的序列特征；利用半定量r t - p c r 、相对定量q r t - p c r 技术、整体和组织原位杂交方法，分析了该基因在栉孔扇贝胚胎发育、性腺发育 和各组织中的时空表达特征和规律；进一步采用r n a i 技术，通过体外注射 c f - d m r t 4 1 i k ed s r n a 到栉孔扇贝生长期性腺中，定量p c r 检测了目的基因在体 内的表达。 栉孔扇贝c f - d m r t 4 一l i k e 基因的e d n a 全长为2 3 1 2b p ，o r f1 1 1 0b p ，编码 3 6 9 个氨基酸；其氨基酸序列具有d m r t 蛋白特有的d m 保守结构域，且在c 端拥有d m r t 4 和d m r t 5 蛋白共有的d m a 保守结构域，以及d m r t 4 和d m r t 5 蛋白特有的短保守序列( s h o r tm o t i f1 ) 。序列比对和系统进化分析显示， c d m i m l i k e 蛋白与其它物种的d m r t 4 蛋白的相似性最高，且首先与 d m r t 4 蛋白聚类，这一结果也说明了c f - d m r t 4 一l i k e 基因在进化上的保守性。本 实验还克隆获得了c f - d m r t 4 a l i k e 基因e d n a 片段，长1 6 3 8 b p ，编码1 4 3 个氨基 酸以及c f - d m r t 4 b 1 i k e 基因e d n a 片段，长1 6 4 1 b p ，编码1 0 4 个氨基酸，初步分 析其为c f - d m r t 4 1 i k e 基因的拼接产物。 半定量r t - p c r ， c f - d m r t 4 1 i k em r n a 在雌性成体组织的鳃、外套膜、肾、 闭壳肌、性腺及雄性鳃和性腺中表达。荧光定量q r t - p c r 分析结果显示，该基 因在各发育期的雌雄两性性腺中均有表达，且成熟期精巢中的表达量与其余各期 中国海洋大学博士学位论文 精巢中的表达量呈显著性差异，约是其它时期的2 0 倍；然而各期卵巢以及增殖 期与生长期精巢中的表达量未显示显著性差异，表明该基因参与了栉孔扇贝两性 性腺的发育，尤其在成熟期精巢的发育中起重要的作用。原位杂交结果显示， c f - d m r t 4 一l i k em r n a 分布在各期卵巢的卵原细胞、卵母细胞的胞质和核中，其中 成熟期卵巢各期生卵细胞中的阳性信号略强于增殖期和生长期；c f - d m r t 4 1 i k e m r n a 也定位于各期精巢的精原、精母和精细胞中，成熟期各期生精细胞中的 阳性信号更加明显；在性腺的体细胞中未见目的基因的表达。上述结果暗示 c f - d r a f t 4 ，触基因参与了生殖细胞的分化和功能维持。 胚胎和幼虫的半定量r t - p c r 和荧光定量q r t - p c r 结果证实，c f - d m r t 4 一l i k e 基因在未受精卵、受精卵、卵裂期胚胎、各期幼虫中均有表达。未受精卵 c f - d m r t 4 1 i k e 基因的表达量显著高于各期胚胎的表达量，d 形幼虫的表达量显著 高于壳顶幼虫和附着前幼虫的表达量( p 0 0 5 ) 。原位杂交结果显示， c 乒d m r w l i k e 基因的蓝色阳性信号主要集中在未受精卵和早期胚胎的中间部位， 随着发育的进行，信号相继集中在幼虫的外套膜和鳃处，暗示该基因参与栉孔扇 贝鳃和外套膜组织的早期构建，进一步因其在成体的鳃和外套膜组织中也有表 达，推测其在栉孔扇贝鳃和外套膜等组织的构建和功能维持中发挥一定的作用。 c f - d m r t 4 1 i k er n a 干扰及q r t - p c r 结果显示，体外注射d s r n a 可引起栉孔 扇贝精巢中c f - d m r t 4 - l i k e 基因的瞬时沉默，注射后4 8 h 时，目的基因在体内的表 达量较对照组个体无显著性的差异；然而，7 2 h 时实验组表达量显著性的低于注 射生理盐水的对照组。本实验我们初步建立了栉孔扇贝r n a 干扰技术。由于时 间的关系，相关的功能分析( 如两性性腺中各期生殖细胞发育状况以及弘，辔 的表达) 尚在检测中。 关键词：栉孔扇贝，c f - d m r t 4 一l i k e 基因，表达，r n a i ，性腺分化，性腺发育， 早期发育 中国海洋大学博士学位论文 c l o n i n g ，e x p r e s s i o na n df u n c t i o n a la n a l y s i so fc f - d m r t 4 - l k e g e n e si nc h l a m y s f a r r e i a b s t r a c t s t u d yo na n i m a ls e xd e t e r m i n a t i o n - a n dg o n a dd e v e l o p m e n t - r e l a t e dg e n e s ，a n i m p o r t a n tp a r ti nd e v e l o p m e n m lb i o l o g y , i sat h e o r e t i c a lb a s i sf o ra r t i f i c i a ls e xc o n t r o l i na q u a c u l t u r e d m r tg e n e ，o r i g i n a l l yf o u n di nd r o s o p h i l aa n dn e m a t o d e ，w a si s o l a t e d i ns u c c e s s i o ni nm a n yv e r t e b r a t e sa n di n v e r t e b r a t e s t h e s ed m r tg e n e si nd i f f e r e n t a n i m a l ss h a r ead mc o n s e r v e dd o m a i na n ds h o waf u n c t i o n a lc o n s e r v a t i o nt oa c e r t a i n e x t e n t t h e ya r e i n v o l v e di ns o m e b i o l o g i c a lp r o c e s s e ss u c h a ss e x d e t e r m i n a t i o n , g o n a d a ld i f f e r e n t i a t i o na n dd e v e l o p m e n t , o n t o g e n ya n dm a i n t a i n i n g t i s s u ef u n c t i o ni nv e r t e b r a t e 8 i nt h ep r e s e n ts t u d y , f u l l - l e n g t he d n ao fc f - d m r t 4 - l i k eg e n ea n dt w oa l t e r n a t i v e s p l i c ei s o f o r m s ( c f - d m r t 4 a - l i k ea n dc f - d m r t 4 b l i k e ) w e r ei s o l a t e df r o mc h l a m y s ，白r r e r it e s t i su s i n gah o m o l o g o u sc l o n i n gs t r a t e g y ，f o l l o w e db ya n a l y s i so fs e q u e n c e c h a r a c t e r i s t i ca n ds p a t i o t e m p o r a le x p r e s s i o n 、杭t l lm e t h o d so fr t - p c r , q r t - p c r , i n s i t uh y b r i d i z a t i o n ( i s h ) t od e t e c tt h ef u n c t i o no ft h i sg e n e ，r n a i n t e r f e r e n c e ( r n a i ) w a sc o n d u c t e db yi n j e c t i n gd s r n ao fc f - d m r t 4 一l i k eg e n ei n t ot e s t e sa tt h eg r o w i n g s t a g e ，a n dt h e nm r n a l e v e l sw e r ed e t e r m i n e db yq r t - p c r e d n ao fc f - d m r t 4 - l i k eg e n ei s2 312b pl o n gc o n t a i n i n ga l lo p e nr e a d i n gf r a m e ( o r f ) o f1110b pt h a te n c o d e st h ep r o t e i no f3 6 9a m i n oa c i d s t h ea m i n oa c i d s e q u e n c es h a r e st h ed md o m a i nc o n s e r v e di nd m r tp r o t e i n s ，a n dc o n t a i n sb o t ht h e d m ac o n s e r v e dd o m a i na n dt h ec h a r a c t e r i s t i cs h o r tc o n s e r v e dd o m a i n ( s h o r tm o t i f1 ) ， s h a r i n gw i t hd m r t 4a n dd m r t 5p r o t e i n sa tce n d s e q u e n c ec o m p a r a t i o na n d p h y l o g e n e t i ca n a l y s i ss h o w e dt h a tc f - d m r t 4 一l i k ep r o t e i nw a sm o s ts i m i l a rt o o t h e rd m r t 4a n da p p e a r e dm o r ec l o s e l yr e l a t e dt od m r t 4 p r o t e i n ，i n d i c a t i n gt h a t c f - d m r t 4 一l i k eg e n e i s h i g h l yc o n s e r v e dt h r o u g he v o l u t i o n t h ec f - d m r t 4 a 1 i k e i s o f o r mi n c l u d e s16 38 b pe n c o d i n g14 3a m i n oa c i d s ，a n dc f - d m r t 4 b l i k ei s o f o r m 中国海洋大学博士学位论文 i n c l u d e s16 41b pe n c o d i n g10 4a m i n oa c i d s ，w h i c hw e r ep r e l i m i n a r ys p e c u l a t e da st h e a l t e r n a t i v es p l i c ei s o f o r m s c f - d m r t 4 一l i k eg e n ew a se x p r e s s e di nt h eg i l l ，m a n t l e ，k i d n e y , a d d u c t o rm u s c l e ， a n dg o n a do fa d u l tf e m a l e ，a n dt h eg i l la n dg o n a do fa d u l tm a l ed e t e c t e db yr t - p c r t h er e a lt i m eq r t - p c ra l s os h o w e da w i d e l ye x p r e s s i o no fc f - d m r t 4 一l i k eg e n ed u r i n g t h eg o n a d a ld e v e l o p m e n tc y c l eb o t hi nm a l ea n df e m a l e t h ee x p r e s s i o nl e v e li n m a t u r et e s t i sw a s2 0 - t i m eh i g h e rs i g n i f i c a n t l yt h a nt h o s ei no t h e rs t a g e s ，b u tn o s i g n i f i c a n td i f f e r e n c ew a so b s e r v e db e t w e e nt e s t e sa to t h e rd e v e l o p m e n ts t a g e s ，w h i c h s h o w e ds i m i l a re x p r e s sl e v e lw i t ha l lo v a r ys t a g e s t h e s er e s u l t sr e v e a lt h a tt h i sg e n e i si n v o l v e di nt h eg o n a d a ld e v e l o p m e n tb o t ho f m a l ea n df e m a l ea n de s p e c i a l l yp l a y a ni m p o r t a n tr o l ei nt h em a t u r eo ft e s t i s t h ei s ha s s a ys h o w e dt h a tc f - d m r t 4 - l i k e m r n aw a sd i s t r i b u t e di nt h ec y t o p l a s ma n dn u c l e u so fo o g o n i aa n do o c y t e sd u r i n g o v a r yd e v e l o p m e n t ，a n dt h ep o s i t i v es i g n a la p p e a r e ds t r o n g e ri nm a t u r eo v a r yt h a ni n p r o l i f e r a t i v ea n dg r o w i n gs t a g e s d u r i n gt e s t i sd e v e l o p m e n t ，c f - d m r t 4 一l i k em r n a w a sl o c a t e di ns p e r m a t o g o n i a ，s p e r m a t o c y t e sa n ds p e r m a t i d s ，a n dt h es i g n a lw a s s t r o n g e ri ng e r mc e l l sa tt h em a t u r es t a g e n os i g n a lw a s f o u n di ns o m a t i cc e l l so ft h e g o n a d a b o v er e s u l t si m p l y t h a tc f - d m r t 4 - l i k eg e n ei si n v o l v e di nd i f f e r e n t i a t i o na n d f u n c t i o n a lm a i n t e n a n c eo fg e r mc e l l s t h es e m i - q u a n t i t a t i v er t - p c ra s s a ys h o w e dt h a tc f l d m r t 4 - l i k em r n aw a s d i s t r i b u t e di nu n f e r t i l i z e de g g s ，f e r t i l i z e de g g s ，c l e a v a g ee m b r y o sa n da l ll a r v as t a g e s t h ee x p r e s s i o nl e v e li nu n f e r t i l i z e de g g sw a sh i g h e rt h a nt h o s ei no t h e re m b r y os t a g e s ， a n dt h el e v e li nd s h a p e dl a r v ah i g h e rt h a nt h o s ei nu m b ol a r v aa n dc r e e p i n gl a r v a 如 如0 5 ) r e s u l t so fl s hs h o w e dt h a tt h eb l u ep o s i t i v es i g n a lo fc f - d m r t 4 一l i k er n r n a m a i n l ya p p e a r e di nt h ec e n t e ro fu n f e r t i l i z e de g g sa n de a r l ye m b r y o s ，a n dm i g r a t e dt o t h eg i l la n dm a n t l eo fl a r v a e 、i t l lt h ee m b r y o g e n e s i s ，w h i c hs u g g e s t st h i sg e n ei s i n v o l v e di ne a r l ye s t a b l i s h m e n to fg i l la n dm a n t l e i ti ss u p p o s e dt h a tt h i sg e n ea l s o p l a yar o l ei nt h ef u n c t i o n a lm a i n t e n a n c eo fs o m et i s s u e si n c l u d i n gg i l la n dm a n t l e d u et ot h ee x p r e s s i o ni na d u l tt i s s u e s t h er n a ia n dq r t - p c rs h o w e dt h a ti n j e c t i o no fd s r n ac a ni n s t a n t l ys i l e n c e t h ee x p r e s s i o no fc f - d m r t 4 - l i k eg e n e t h ee x p r e s s i o nl e v e lo ft a r g e tg e n ei nd s r n a i v 中国海洋大学博士学位论文 t r e a t m e n tw a ss a m ea st h ec o n t r o la t4 8hp o s ti n j e c t i o n ，b u tw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e r t h a nt h ec o n t r o la t7 2hp o s ti n j e c t i o n i nt h i ss t u d y , ar n a im e t h o df o rs c a l l o pw a s p r e l i m i n a r y e s t a b l i s h e d f u r t h e rf u n c t i o n a l a n a l y s i si n c l u d i n gm o r p h o l o g i c a l o b s e r v a t i o no fg e r mc e l ld e v e l o p m e n ti ng o n a d sa n dt h ee x p r e s s i o nv a r i e t yo f 够心 a re b e i n gp e r f o r m e d k e yw o r d s ：c h l a m y s 力，阳，f ，c f - d r a f t 4 一l i k eg e n e ，e x p r e s s i o n ，r n a i ，g o n a d d i f f e r e n t i a t i o n ，g o n a dd e v e l o p m e n t ，e a r l yd e v e l o p m e n t v 中国海洋大学博士学位论文 目录 第一章性别决定机制和性腺发育相关基因的研究进展 1 性别决定与性别分化2 1 1 性别决定机制3 1 2 环境与性别决定6 1 2 1 温度7 1 2 2 食物丰度8 1 2 3 密度及光照8 1 2 4 p h 值9 1 3 性别决定和性腺发育相关基因9 1 3 1h o x 基因家族1 0 1 3 2s o x 基因家族10 1 3 3 其它基因13 2d m r t 基因研究进展16 2 1d m r t 基因序列特征及聚类分析17 2 1 1d m 结构域序列特征分析17 2 1 2 氨基酸序列特征分析19 2 1 3d m r t 基因的连锁关系分析2 3 2 2d m r t 基因的功能2 3 2 2 1d m r t l 2 3 2 2 2d m r t 2 2 6 2 2 3d m r t 3 2 7 ：! 2 4d m r t 4 ：1 8 2 2 5d m r t 5 2 8 ：! ：! 6d m r t 6 2 9 2 2 7d m r t 7 和d m r t 8 2 9 2 3 无脊椎动物d m r t 基因的研究进展34 3 基因功能研究现状35 中国海洋大学博士学位论文 3 1r n a 干扰策略3 7 3 2r n a 干扰技术在水生生物中的应用3 8 4 本研究的立项依据和研究意义4 1 第二章栉孔扇贝( c h l a m y s f a r r e r i ) d m r t 家族基因的c d n a 克隆 和序列特征析 l 材料与方法4 2 1 1 材料4 2 1 2 方法4 3 1 2 1d h s a 感受态细胞的制备4 3 1 2 2 总r n a 的提取和第一链e d n a 的合成4 3 1 2 3c d n a 第一链的合成4 5 1 2 4 目的片段的p c r 扩增4 5 1 2 5 目的片段的克隆4 5 1 2 6 基因全长e d n a 序列的获得4 6 1 2 7 目的基因的核酸序列特征及氨基酸序列相似性分析4 8 2 结果4 8 2 1 目的基因e d n a 序列特征4 8 2 2 选择性剪接( a l t e r n a t i v es p l i c i n g ) 5 3 2 3 序列比对及系统进化分析5 5 2 4 栉孔扇贝c f d m r t - l i k e 蛋白三维结构5 8 3 讨论5 8 3 1d m r t 基因的命名原则5 8 3 2 选择性剪接5 9 3 3 核定位信号序列6 l 第三章栉孔扇贝( c h l a m y sf a r r e r i ) d m r t 基因的时空表达及 c f - d m r t 4 - 1 i k e 基因的发育表达图式 1 材料与方法6 4 中国海洋大学博士学位论文 1 1 材料6 4 1 1 1 成体组织6 4 1 1 2 胚胎、幼虫、稚贝和幼贝6 4 1 1 3 工具酶、试剂盒6 5 1 2 方：法6 5 1 2 1 性腺组织学观察6 5 1 2 2d m r t 家族基因的时空表达分析6 5 1 2 2 1r t - p c r 分析6 6 1 2 2 2 相对定量q r t - p c r 分析6 6 1 2 2 3 原位杂交探针合成6 7 1 2 2 4 组织原位杂交6 9 1 2 2 5 整体原位杂交71 1 2 2 6 稚贝整体原位杂交和组织学观察7 l 2 结果7 2 2 1 c f - d m ，r 4 z i k e 基因的组织表达特征7 2 2 1 1 c f - d m r t 4 一l i k e 基因在胚胎和幼虫中的表达。7 3 2 1 2 原位杂交检测c f - d r a f t 4 1 i k e 基因在栉孔扇贝非性腺组织中的细胞学定位7 3 2 2c f - d m r t 4 1 i k e 基因在不同发育周期性腺中的表达7 3 2 2 1 c f - d m r t 4 1 i k em r n a 在发育周期性腺中的定量分析 7 5 2 2 2 c f - d m r t 4 一l i k e 基因在栉孔扇贝性腺发育周期中的表达图式7 5 2 2 2 1 性腺发育周期的组织学观察7 5 2 2 2 2 c f - d m r t 4 1 i k em r n a 在性腺中的原位杂交分析7 7 2 3 c f - d m r t 4 1 i k e 基因的发育表达图式 7 9 2 3 1 c f - d m r t 4 1 i k 基因在发育过程中的定量表达分析7 9 2 3 2 c f - d m r t 4 1 i k em r n a 在栉孔扇贝发育中的原位杂交分析8 0 3 讨论83 3 1 c f - d m r t 4 1 i k em r n a 的母源合成和在发育中的作用8 3 3 2 c f - d m r t 4 1 i k em r n a 在性腺中的表达8 4 3 3 c f - d m r t 4 一l i k e 基因广泛参与非性腺组织的发育8 5 总结9 5 参考文献9 6 发表论文1 0 8 致谢1 0 9 栉孔扇贝c f - d m r t 4 一l i k e 基因的克隆、表达及功能分析 第一章性别决定机制和性腺发育相关基因的研究进展 有性繁殖是大多数动物的一个基本特征，需经历两性生殖细胞的特化，生 殖细胞发育、受精、胚胎发育等一系列的过程。绝大多数多细胞动物均有两个独 立的性别，性别决定受性染色体、常染色体和环境因素共同调控，无论其遗传 性别如何，影响性腺发育的任何一个基因的突变或异常，将会导致性腺发育方向 发生改变( j u l i a n o ，2 0 0 6 ) 。对于有性染色体的生物而言，动物性腺的发育受多 种基因调控通路的指导，其内因是生物体的性别遗传物质一一性染色体( s e x c h r o m o s o m e ) 或性别决定基因。性染色体或性别决定基因在决定性别向何种 方向发育中仅提供了物质基础，但是一个受精卵无论其遗传性别如何，均 存在向任意性别发育的可能性，因为物种的性别决定需经过复杂的内、外 环境条件的相互作用来完成。所以，外因就是性腺性别尚未分化前那些影 响分化的环境因素( y a m a g u e h 等，2 0 0 6 ) ，如激素、温度、光照强度等。一 般情况下，动物性别由三个连续的步骤共同决定。第一个决定步骤发生在 受精的时候，称为染色体性别决定( c h r o m o s o m es e xd e t e r m i n a t i o n ) ，即受精 时形成的遗传性别。受精一旦完成，就决定了个体的性染色体的组成，性 染色体的差异是决定遗传性别的根本因素。当环境条件符合性腺分化要求 时，将按照性染色体所决定的方向发育成雌性或雄性个体，即具有y 染色 体的发育为雄性，y 染色体缺失的个体为雌性( b e r t a 等，1 9 9 0 ) 。第二个决 定性别的步骤发生在胚胎早期发育阶段，称为遗传性别决定生理性别( 也 称为性腺性别决定，g o n a d a ls e xd e t e r m i n a t i o n ) ，这一阶段决定了生殖原基 分化成为精巢还是卵巢，这一时期主要还是由性染色体的组成信息所控制。 第三个步骤是生理性别转化为表型性别，主要由性腺分泌的激素情况来决 定个体表现是雄性还是雌性的外部特征( k i y o s h i ，2 0 0 2 ；楼允东等，2 0 0 4 ) 。 研究动物的性别决定机制及性别调控基因的目的是为养殖业提供性别控制 的理论依据。畜牧业需要母禽、母畜，养蚕业需要大量的雄蚕，水产养殖中需要 生长快、经济效益高的雌性个体或雄性个体，以及鱼类养殖中为了解决某些鱼类 的过度繁殖和控制过早性成熟从而提高鱼类养殖中的生长速度，以及鱼类养殖中 充分利用全雌( 全雄) 的单性养殖，增加养殖效益等方面均具有实践指导意义。 研究发现脊椎动物决定性别的关键在于y 染色体，y 染色体的有无决定是 向雄性还是向雌性发育。也预示着y 染色体指导未分化的性腺向睾丸分化，缺 少y 染色体则未分化性腺向卵巢发育，可以说性别决定问题就是雄性决定问题 ( b e r t a 等，1 9 9 0 ) 。哺乳动物的性别决定基因为s r y ，是位于y 染色体短臂上的 决定雄性的d n a 片段，在胚胎发育中决定着睾丸的形成，继而促进雄性动物第 二性征的形成。决定哺乳动物性别的基因除了s o , 基因外，s o x 9 ，m i s 、 w t l 、 s f l 、d a x l 和d m r t l 基因也参与性别决定的调控过程( y a m a g u c h i 等，2 0 0 6 ； 2 栉孔扇贝c f - d m r t 4 1 i k e 基因的克隆、表达及功能分析 v i n c e n t 等，2 0 0 3 ；) 。性别决定是多基因有序协调的复杂过程，并非s r y 基因“孤 军奋战 ，在这个复杂的性别级联调控中，s r y 基因就像一个总开关一样，作为转 录因子启动和调节其下游基因的表达，对性别决定方向起总的控制作用，然而在 这个多基因互作中尚有许多调控过程不甚清楚，相关的未知基因有待发现和研 究。在非哺乳类脊椎动物中，目前尚未发现s t y 基因，而是由s o x 9 和d m r t l 等 基因共同决定性别的分化发育( 黄敏毅等，2 0 0 4 ) 。 对于无脊椎动物来说，原始性腺经一系列的性腺发育相关基因的调控，发 育成精巢或卵巢，并出现第二性征。线虫( c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s ) 和果蝇 ( d r o s o p h i l a m e l a n o g a s t e r ) 的性别决定机制已较为清楚，即通过x 染色体与常 染色体的比值决定性别决定基因勋厶z ( 线虫) 和& ，( 果蝇) 是否被激活，从而 启动一个级联调控过程，决定未分化性腺的发育方向( b l a c k ，2 0 0 3 ) 。这一性别决 定机制与哺育动物y 染色体上s r y 基因的性别决定机制有很大的不同。研究还发 现脊椎动物性别决定( 相关) 基因在无脊椎动物中并不是保守的，如无脊椎动物 j 没有s t y 和s o x 9 基因，而是由许多其它基因参与性腺发育方向的决定，例如果 蝇的d s x 、线虫m a b 3 和t a f - 基因以及贝类和虾类的d m r t 、m a r - m r r 等基因参与 性别决定和性别分化过程( h u b e r t 等，2 0 0 9 ；c a o ，2 0 0 6 ) 。 岩 1 1性别决定机制 脊椎动物的性别决定机制大致分为染色体决定、遗传性别决定( g e n e t i cs e x d e t e r m i n a t i o n ，g s d ) 和环境依赖性性别决定( e n v i r o n m e n t a ls e xd e t e r m i n a t i o n ， e s d ) 。多基因性别决定基因位于性染色体和常染色体上，胚胎的性别是染色体 上雄性和雌性因子相互作用的结果。 哺乳类的性别决定主要为染色体决定，性染色体上拥有绝大多数与性别有 关的基因，在y 染色体上形成性别决定区( s i w ) ，它是决定精巢发育的核心， 直接决定精巢的发生；即胚胎发育成雌性或雄性取决于其性染色体的组成，一般 不受外界环境的影响。在胎盘哺乳动物和有袋动物中，享有x x x y 性别决定 机制，雄性由一个大x 染色体和一个小的y 性染色体组成，y 染色体上的跏 基因启动了雄性性别决定通路，可能是通过抑制生殖嵴中w n t 4 基因的表达和促 栉子l 扇贝c f - d m r t 4 一l i k e 基因的克隆、表达及功能分析 进s j 7 基因的表达，使具有双向潜能的胚胎向雄性方向发育；在x x 胚胎中，w n t 4 基因激活d a x l 基因从而抑铝l j s o x 9 基因的表达，使胚胎向雌性方向发育( t e v o s i a n 等，2 0 0 2 ；图1 1 ) 。 卅7 i _ h x 9 u m l e t c 图l l 哺乳动物s t y 调控通路中各基因的可能作用机制( 参考t e v o s i a n 等，2 0 0 2 ) f i g 1 一lm e c h a n i s mo fr e l a t e dg e n e si ns t yr e g u l a t i o n a lp a t h w a yo fm a m m a l ( m o d i f i e df r o m t e v o s i a ne ta 1 ，2 0 0 2 ) 禽类z z z w 的性别决定机制是雌性由z w 组成，雄性由z z 组成，在进 化中，w 染色体处于渐渐退化状态，主要表现在功能基因数量的减少，染色体 和端粒长度缩小( w rbu 醚，簿坩k望暴姆删窖踩柱群求籁鳝*文艘不篮栏辫图怔越半删冥r取，婢斛掣，诬陲禳删g掣畎净)(艘鬲水塔镫锹球磐长葛