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几种观赏植物的组织培养与快速繁殖技术研究 中文摘要 几种观赏植物的组织培养与快速繁殖技术研究 中文摘要 植物组织培养技术在观赏植物快速繁殖中的应用越来越广泛。我们选取了观赏价 值较高、市场潜力较大、尚没有组织培养报道的菊藻( l i m n o p h i l as e s s i l i f l o r ob i ) 、 蜈蚣珊瑚( p e d i l a n t h u st i t h y m a l o i d e s ( l ) p a i rv a t n a n u s ) 、自萼吊钟海棠( f u c h s i a a l b a c o c c i n e ah o r t ) 和组培技术尚不成熟的夏蜡梅( s i n o c a l y c a n t h u sc h i n e n s i sc h e n ge t s y c h a n g ) 等4 种植物，分别作为水生草本、常绿草本、常绿灌木和落叶灌木的代 表，进行组织培养与快速繁殖技术的研究。以菊藻、蜈蚣珊瑚和白萼吊钟海棠的带节 茎段为外植体，研究了茎段不同部位作为外植体的灭菌效果、各外植体灭菌方法和灭 菌时间的确定；优化了愈伤组织的诱导与分化培养基、增殖培养基和生根培养基中植 物生长调节物的浓度和配比；提出了抑制试管苗褐化和玻璃化的培养条件；形成了适 宜于炼苗与移栽等的技术措施；建立了菊藻、自萼吊钟海棠和蜈蚣珊瑚的组织培养与 快速繁殖技术体系。同时，以幼苗子叶节为外植体，对夏蜡梅组织培养技术进行了初 步探索，并获得了再生植株。 关键词：观赏植物；组织培养；快速繁殖；菊藻；夏腊梅：白萼吊钟海棠；蜈蚣珊瑚 作者：顾福根 指导老师：万志刚 u d i e so nt h et i s s u ec u l t u r ea n dr a p i dr e p r o d u c t i o n t e c h n o l o g yo fs e v e r a lo r n a m e n t a lp l a n t s a b s t r a c t p l a n tt i s s u ec u l t u r e ，o n eo ft h eb a s i cc o m p o n e n t so fp l a n tb i o t e c h n o l o g y , h a sf o u n di t s m o r ea n dm o r ea p p l i c a t i o n si nr a p i dc l o n a lp r o p a g a t i o no fo r n a m e n t a lp l a n t s l i m n o p h i l a s e s s i l i f l o r a ，f u c h s i a a l b a c o c c i n e a ，p e d i l a n t h u st i t h y m a l o i d e s ，a n ds i n o c a l y c a n t h u s c h i n e n s i sa r ec o m m e r c i a l l yp o t e n t i a lo r n a m e n t a ls p e c i e sw i t hh j 曲o r n a m e n t a lv a l u e t h e p l a n tt i s s u ec u l t u r et e c h n i q u e sa r en o tc u r r e n t l ya v a i l a b l e i nt h e s ef o u rp l a n ts p e c i e s i nt h i s r e s e a r c h ls e s s i l i f l o r a ，f a l b a c o c c i n e a ，p t i t h y m a l o i d e s ，a n ds c h i n e n s i sw e r ec h o s e n a st h er e p r e s e n t a t i v e so fh e r b a c e o u sh y d r o p h y t e ，e v e r - g r e e ns h r u b ，e v e r - g r e e nh e r b ，a n d d e c i d u o u ss h r u b ，r e s p e c t i v e l y , f o rd e v e l o p i n gt h et i s s u ec u l t u r ea n dr a p i dp r o p a g a t i o n t e c h n i q u e s n o d a ls t e mf r a g m e n t sf r o m s e s s i l i f l o r a ，f a l b a c o c c i n e a ，p t i t h y m a l o i d e s w e r eu s e da se x p l a n t sw i t ht h eo b j e c t i v et oe s t a b l i s hf l e x i b l ep l a n tt i s s u ec u l t u r et e c h n i q u e s t h ee f f e c t so fd i f f e r e n tn o d a ls t e me x p l a n t sa n dt h es t e r i l i z a t i o nm e t h o da n dd u r a t i o no n t h ei n i t i a lc u l t u r ea n dc a l l u si n d u c t i o nw e r ei n v e s t i g a t e d t h em e d i af o rd i f f e r e n t i a t i o n ， m u l t i p l i c a t i o n ，a n dr o o t i n gw e r eo p t i m i z e dw i t hr e s p e c tt ot h ec o n c e n t r a t i o n sa n dr a t i o so f s u p p l e m e n t e dg r o w t hr e g u l a t o r s v a r i o u s c u l t u r a lc o n d i t i o n sf o rm ec o n t r o l l i n go r a l l e v i a t i n ge x p l a n tb r o w n i n ga n dp l a n t l e tv i t r i f i c a t i o nw e r ee v a l u a t e d t e c h n i c a lm e a s u r e s f o rh a r d e n i n ga n dt r a n s p l a n t i n gw e r ea l s oa n a l y z e d t h e r e f o r e ，i ti ss u g g e s t e dt h a tp l a n t t i s s u ec u l t u r ea n dr a p i dp r o p a g a t i o nt e c h n i q u e sf o rl s e s s i l i f l o r a ，f a l b a c o c c i n e a ，p t i t h ) ，m a l o i d e sb es u c c e s s f u l l ye s t a b l i s h e d i na d d i t i o n ，p r i m a r yi n v e s t i g a t i o nw a sp e r f o r m e d t od e v e l o pt h et i s s u ec u l t u r et e c h n i q u ef o rs i n o c a l y c a n t h u sc h i n e n s i sb yu s i n gn o d a l c o t y l e d o no fs e e d l i n g sa se x p l a n t s ，a n dt h er e g e n e r a t e dp l a n t l e t sw e r e o b t a i n e d k e yw o r d s ：o r n a m e n t a lp l a n t s ；t i s s u ec u l t u r e ；r a p i dp r o p a g a t i o n ；l i m n o p h i l as e s s i l i f l o r a b i ；s i n o c a l y c a n t h u s c h i n e n s i sc h e n ge ts y c h a n g ；f u c h s i aa l b a 。c o c c i n e ah o r t ； p e d i l a n t h u st i t h y m a l o i d e s ( l ) p o i t v a r n a n u s w r i t t e nb y ：g uf u g e n s u p e r v i s e db y ：w a nz h i g a n g 几种观赏植物组织培养与快速繁殖技术研究 缩略词表 缩略词表 英文缩写英文全称 6 b a a c g a 3 m a n a a p v p v c 中文全称 6 - b e n z y la m i n o p u r i n e 6 - 苄基腺嘌呤 g i b b e r e l l i ca c i d 活性炭 赤霉素 i n d o l r - 3 - b u t y r i ca c i d e 吲哚一3 一丁酸 a - n a p h a l e n ea c e t i ca c i d e a - 荼乙酸 p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e 聚乙烯吡咯烷酮 v i t a m i n ec 抗坏血酸 苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得 的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过 的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本 文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的 法律责任。 研究生躲弦趣始 期：逻量：至：三号 学位论文使用授权声明 苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论文合作部、中国社科 院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保 密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的全部或部 分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权苏州大学学位办办理。 研究生签名：磁，经蓝纽日研究生签名：缢i 独型隆日 导师签名：丑缉日 期趔g 7 , - 一节 几种观赏植物组织培养与快速繁殖技术研究第一章文献综述 第一章文献综述 1 植物组织培养的发展历程 组织培养科学的发展与细胞的发现和随后提出的细胞学说有着不可分割的历史 渊源【1 1 。植物组织培养技术发展的整个历史可以追溯到1 9 世纪末和2 0 世纪初【2 】，从 那时到现在的一个世纪中，植物组织培养的发展过程大致可以分为三个阶段。 1 1 探索阶段( 2 0 世纪初至2 0 世纪3 0 年代中) 2 0 世纪初，在s c h l e i d e n 和s c h w a n n 所发展起来的细胞学说的推动下，德国植物 生理学家h a b e r l a n d t 提出了高等植物的器官和组织可以不断分割，直至分到单个细胞 的观点，并设想离体细胞具有再生完整植物的潜力。h a b e r l a n d t 选用小野芝麻和风眼 兰的栅栏组织和虎眼万年青属植物的表皮细胞等，培养于加入了蔗糖的k n o p 溶液。 他在栅栏细胞中明显看到了细胞的生长，细胞壁的加厚和淀粉的形成等，但没有一个 细胞在培养中能够发生分裂。自h a b e r l a n d t 的实验之后，直到1 9 3 4 年w h i m 3 】培养番 茄离体根尖的成功，在其间的几十年时间里，植物组织培养技术在总体上处于探索之 中，进展不大。 1 2 奠基阶段( 2 0 世纪3 0 年代中至5 0 年代末) 到2 0 世纪3 0 年代中期，植物组织培养领域里出现了两个重要的发现，意识到b 族维生素和生长素的重要性，由此，g a u t h e r e t t 4 、w h i t e 6 - 7 和n o b e c o u r t & 9 】一起被誉 为植物组织培养的奠基人。我们现在所用的若干培养方法和培养基，原则上都是这三 位作者在1 9 3 9 年所建立的方法和培养基演变的结果。由于当时他们所使用的组织都 包含了分生细胞，而诱导成熟和业已分化的细胞发生分裂，只有发现细胞分裂素之后 才成为可能。 2 0 世纪4 0 年代和5 0 年代中期，s k o o g t l 叼等发现腺嘌呤或腺苷不但可以促进愈 伤组织的生长，而且还能解除培养基中生长素对芽形成的抑制作用，诱导芽的形成， 从而确定了腺嘌呤与生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。这些实验结 果导致了激动素的发现和以后利用激动素和生长素在组织培养中控制器官分化工作 的开展。 几种观赏植物组织培养与快速繁殖技术研究 第一章文献综述 1 9 5 5 年，m i l l e r 1 1 1 等由鲱鱼精子d n a 中分离出一种首次为人所知的细胞分裂素， 并把它定名为激动素( k i n e f i n ) 。现在具有和激动素类似活性的合成的或天然的化合 物已有多种，他们总称为细胞分裂素( c y t o k i n i n ) 。 1 9 5 7 年，s k o o g 和m i l l e r 1 2 】提出了有关植物激素控制器官形成的概念，指出在烟 草髓组织培养中，根和茎的分化是生长素对细胞分裂素比率的函数，通过改变培养基 中这两类生长调节物质的相对浓度可以控制器官的分化：这一比率高时促进生根，低 时促进茎芽的分化，二者浓度相等时，组织则倾向于一种无结构的方式生长。当然， 激素可调控器官发生的概念对于多数物种都可适用，只是由于物种的遗传背景、培养 方式和培养阶段等的不同会导致他们所要求的外源激素的水平也会有所不同。 1 9 5 8 年，s t e w a r d 1 3 1 等以胡萝b 为材料，首次通过实验证实了h a b e f l a n d t 关于细 胞全能性的设想，成为了植物组织培养历史中的一个里程碑。 1 3 迅速发展阶段( 2 0 世纪6 0 年代至现在) 根据罗士韦【1 4 】统计，在2 0 世纪6 0 年代初期，全世界还只有十几个国家的少数实 验室从事组织培养研究，但到了2 0 世纪7 0 年代，组织培养领域仍然空白的国家已经 屈指可数了。 1 9 6 0 年，m o r e l 1 5 】提出了一个离体无性繁殖兰花的方法，即将兰花茎尖分生组织 诱导形成原球茎并分化成植株，导致了兰花栽培的变革，实现了兰花生产的工厂化和 商品化。这也逐渐拉开了植物组织培养的巨大应用价值的序幕。 1 9 6 7 年，b o u r g i n 和n i t s c h 1 6 】通过花药培养终于获得了完整的烟草植株。由于单 倍体在突变选择和加速杂合体纯化的过程中的重要作用，这一领域的研究得到了迅速 发展。 1 9 7 1 年，t a k e b e 1 7 】等在烟草上首次由原生质体获得了再生植株，这不但在理论 上证明了除体细胞和生殖细胞以外，无壁的原生质体同样具有全能性，而且在实践上 可以为外源基因的导入提供理想的受体材料。 现今，植物组织培养取得的成就数不胜数，已经应用于大量植物种类，许多花卉、 林木、果树、蔬菜都可通过组织培养进行大规模离体快繁，试管苗已在国际市场形成 产业化。如兰花的试管繁殖，目前已发展到大约有3 5 个属1 5 0 多种的兰科植物， 新加坡已用组织培养等方法每年外销兰花创汇2 0 0 万美元。草莓、苹果、柑桔、兰 花、石竹、铁线莲、杜鹃、月季、桉树、非洲菊、唐菖蒲、香石竹、火鹤花等的快速 2 几种观赏植物组织培养与快速繁殖技术研究第一章文献综述 繁殖也相继实行商品化。 2 植物组织培养方式及应用 进行植物组织培养通常都要具有下列最基本的配备设施：洗涤和贮存设备；培养 基配制室，灭菌室和贮存室；无菌操作的接种区域；能控制温度、光照和湿度条件， 维持培养物生长的培养室或培养箱。 g a m b o r g 曾根据所培养的植物材料的不同，把组织培养分为5 种类型，即愈伤组 织培养、悬浮细胞培养、器官培养( 胚、花药、子房、根和茎的培养等) 、茎尖分生 组织培养和原生质体培养。而根据植物组织培养应用的侧重点不同，一般可以分为植 物的快速繁殖、植物脱毒苗的生产、植物育种、植物种质资源的保存和交换、次生代 谢产物的生产、有关基础理论研究等。 2 1 植物的快速繁殖 植物的快速繁殖主要依靠离体侧芽或顶芽茎尖分生组织的增殖及其再生植物的 诱导。建立一个良好的繁殖体系、明确各生产阶段分工，是促进植物大规模微繁殖生 产指标和计划完成的先决条件。一般说来，主要包括以下几个阶段：选择和管理母株， 用于起始培养；启动和建立无菌培养( 主要步骤：分离外植体、清洗、表面杀菌和接 种到适当的培养基上) ；利用特定的培养基，快速诱导体细胞胚形成或增殖茎芽；体 细胞胚萌发和离体再生苗生根；移栽生根苗到无菌土壤中；在温室条件下炼苗；地栽 育苗等几个阶段。 可作为植物组织培养外植体建立的材料，主要有茎尖、腋芽、茎段、幼嫩叶片、 花序节段、花梗切段、幼嫩花苞等。在增殖培养中，一般是依靠诱导休眠芽萌发、不 定芽的产生或体细胞胚的发生来启动繁殖体系的。有些植物种类的顶端优势明显，只 有- - + 部分侧生分生组织能在植物体上发育出侧枝，它的增殖方式主要是切取带节茎 段来继代增殖培养。而有些植株的侧枝及早发育，增殖形成二次丛生枝和三次丛生枝， 这些丛生枝甚至可以进一步再生长形成更小的丛生枝，通常我们把这些丛生枝切小， 来继代增殖培养。对于莲座叶丛型植物来说，通常也是通过纵向切割分小叶丛来继代 增殖培养。而对于能形成原球茎或类原球茎的植物来说，通常先增殖原球茎或类原球 茎，然后将这些原球茎通过生根培养再生成完整植株。一般来说草本的植物容易生根， 而木本植物生根难问题仍然是许多重要经济植物和观赏花木工厂化育苗的主要障碍。 几种观赏植物组织培养与快速繁殖技术研究 第一章文献综述 由于利用植物组织培养进行快速繁殖时所耗费的人力和物力较多，所以一直以来 进行着各种形式的改良。比如植物光自养微繁技术1 8 】，植物组织培养育苗微生态环境 控制口9 1 ，或液体间隔浸泡法1 2 0 等。 2 2 植物脱毒苗的生产 有害病原体感染植物后不一定引起植株死亡，但可能导致农作物减产并降低品 质。病原体在植物中几乎都是通过无性繁殖途径传播的，但实际上，病毒病都发生在 种子繁殖以及营养繁殖的作物种类中。病毒在感病植物的茎尖存在分布梯度，其顶端 分生组织一般无病毒或携带极低浓度的病毒。1 9 5 2 年，m o r e l 和m a r t i n 2 1 1 首次证实通 过茎尖分生组织的离体培养，可以由已受病毒浸染的大丽花中获得无病毒植株。 植物脱毒大多采用茎尖分生组织进行培养，或结合温热疗法及化学处理。也可以 通过植物未感病区域如部分叶片、珠心组织、花药和花分生组织的愈伤组织培养无病 毒植株。 植物的病毒指标分析对于植物脱毒苗的生产也非常重要，一般有指示植物汁液传 染法、血清学检测、内含体的鉴定、衣壳蛋白的鉴定、p c r 检测【2 2 。2 3 1 、电子显微镜 观察法等。 通过组织培养实现脱毒试管苗的商业化，在果树、蔬菜、花卉领域已十分普遍， 如马铃薯、甘薯、大蒜、香蕉、柑桔、苹果、葡萄、百合、草莓、矮牵牛、康乃馨、 月季、菊花、牡丹、花叶芋、山茶、甘蔗、草莓等多种经济植物。 2 3 植物育种 植物育种的根本目的是从种质资源中诱导产生大量的遗传变异，广泛地在现有农 作物中选择和获得具有优良性状的新品种。主要用于植物育种的组织培养的技术手段 有：单倍体培育、三倍体培育、离体授粉受精、合子胚培养、体细胞杂交和细胞质杂 交、遗传转化、体细胞无性系和配子体无性系变异的选择等。 未分化细胞、游离原生质体、愈伤组织、再生植物株进行组织培养时常常发生遗 传变异，我们可以通过组织培养j 无选择压力2 5 蜘或施加选择压力【2 7 铘1 来筛选培育 优良品种。尤其对原来诱发突变较为困难、突变率较低的一些性状，通过组织培养提 高其突变率或通过选择压力诱发并筛选突变，从而获得具有某些优秀性状的新品种。 例如耐盐，耐寒，抗除草剂等的突变体植株的获得。 2 4 植物种质资源的保存和交换 4 几种观赏植物组织培养与快速繁殖技术研究 第一章文献综述 种质资源保存技术的原则是尽最大的可能保存特殊植物或品种的遗传多样性，以 备将来之用。植物多样性表现在物种、品种和单株水平上。种质资源保存包括原地保 存和异地保存。异地保存是保存栽培品种和野生遗传资源的主要方式。一般来说就是 把种子或离体培养的植物细胞、组织和器官作为基因库，在适当的条件下长期保存。 离体培养是保存营养繁殖植物，顽拗性种子和遗传工程材料植物最有用的方法。利用 植物组织培养保存种质资源就是降低继代培养频率，根据不同要求可以选择缓慢生长 ( 代谢) 系统【2 9 - 3 0 l 或深低温保藏【3 1 】。缓慢生长( 代谢) 系统通常适用于中期贮藏，弊 病是随着培养时间的延长会使变异细胞累积；而深低温保藏是长期保存最有用的方 法，超低温时细胞不分裂，遗传性稳定。利用植物组织培养技术保存种质也便于种质 资源的交换和转移，防止有害生物的人为传播。 2 5 生产次生代谢产物 次生代谢产物是相对初生代谢产物而言的，初生代谢产物是细胞在进行正常的 生命活动过程中产生的，是维持细胞的生命活动所必需的物质。次生代谢产物是植 物中一大类并不是植物的生长发育所必需的小分子有机化合物，这些化合物的产生 和分布通常具有种属、器官组织和生长发育的特异性。在次生代谢产物生产中，植 物细胞培养比完整植株更具优势。次生代谢产物的经济和医用价值较高，与一些化 学合成的商品或药物相比，天然原料植物的组织培养成本很低，因此利用植物组织 培养技术大规模生产次生代谢产物深受工业生产的青睐。不过，由于传统的一些方 法还具有优势，以及目前商品化的次生代谢产物产量还较低，所以迫切期望利用植 物组织培养技术大规模生产次生代谢产物的种类仍然很少，商品化的主要为紫草宁、 人参皂苷和小檗碱3 2 1 。利用植物组织培养技术大规模生产次生代谢产物主要有2 个 技术瓶颈：建立目的次生代谢产物合成的组织培养体系，筛选该化合物合成水平最 高的变异细胞系；设计合适的生物反应器体系，使该体系能调节植物细胞培养物遗 传稳定性和生物代谢反应，提高生产水平。目前，大约已有2 0 多种植物的培养组织 中有用物质高于原植物，国际上己获得这方面的专利也超过1 0 0 项。例如，靠传统 的提取树皮生产紫杉醇的方法使天然的红豆杉树受到灭绝的威胁，而培养细胞的紫 杉醇含量已经达到了天然树皮的数倍。用细胞培养的方法生产紫杉醇，能够避免对 树木的大量砍伐和对生态环境的破坏，是目前开发这一药物的重要途径。 2 6 进行有关基础理论研究 气 几种观赏植物组织培养与快速繁殖技术研究第一章文献综述 植物组织培养推动了植物遗传、生理、生化和病理学的研究，已成为植物科学研 究中的常规方法。比如单倍体基因组染色体仅存在一个等位基因，基因作用容易表现， 所以离体培育单倍体可以解决遗传学研究的一些难题。合子胚培养技术也可用于探索 胚胎发育需要的营养和物理条件。转基因植物模式也可以提供研究基因结构和功能的 平纠3 3 1 。细胞培养和组织培养为研究植物生理活动提供了一种强有力的手段，在矿物 质营养、有机营养、微量元素和生长调节活性物质等方面开展了很多研究。 3 植物组织培养过程中的三大关键技术 植物组织培养是以植物生理学为基础发展起来的一项植物生产繁殖技术。经过近 一个世纪的发展，这项技术已在科学研究和生产实践上得到广泛应用，并成为生物技 术的重要内容之一。植物组织培养的理论研究已比较深入，但还需进一步研究，而且 它的技术环节还存在不少的问题。尤其是进行快速繁殖，需要进行规模化和商业化生 产时，技术环节就会出现很多瓶颈。其中，污染、褐变、玻璃化是植物组织培养过程 中常遇到的三大难题。 3 1 植物组织培养过程中污染的控制 ， 虽然组织培养的操作相对说来并不难，但对一些技术环节的要求却十分严格。污 染是在组织培养过程中普遍发生又很难控制的问题，污染率高会使组织培养的成本也 相应增加，严重的还容易造成毁灭性损失。因此，控制污染是组织培养研究及工厂化 育苗生产中一个重要环节，也是一套贯穿整个组培过程的技术。能否把污染率降低到 可以接受的范围，也就成为这项工作能否进行下去的关键。所以，控制污染成了组织 培养中的关键技术之一。 在组织培养过程中由于植物材料培养时间长，而微生物的生长周期短、繁殖快， 加之植物组织培养条件下的温度、湿度、营养等正是微生物生长所需的较好条件，所 以组织培养中的任何环节带菌都可能引起培养体系的污染。这些污染出现在材料表 面、材料附近的培养基以及培养基的其他部位，表现为霉变或混浊或云雾状、粘液状、 发酵泡沫状等不同形状、颜色和大小的污染痕迹。植物组织培养中的污染可能是真菌 引起的，也可能是细菌等引起的。污染有可能是外植体带菌引起的，也有可能是接种 或培养过程中染菌引起的，既有在当代培养期间就表现出来的，也有在材料培养到一 定代数才表现出来的。因此造成污染的原因多种多样，女l l j , b 植体的种类、取材的季节、 6 几种观赏植物组织培养与快速繁殖技术研究 第一章文献综述 时间、预处理方法、消毒药剂的种类、浓度、消毒时间、消毒方法、培养基和器皿灭 菌、操作人员、工作环境、超净工作台的工作质量等都与污染密切相关。组织培养的 污染成因复杂，污染原因可归结为主要的3 个方面：外植体、环境、操作。 3 1 1 外植体 在野外生长的环境下，植物茎叶表面容易滋生大量的微生物，一些菌丝体甚至侵 入表皮内的薄壁组织，不能被一般的表面消毒方法所清除，材料被带入组织培养过程 中易引起内生菌的污染。所以一般对于长期生长在户外的植株，可对其进行修剪、套 袋或改为室内栽培，待长出新枝后再采外植体进行接种。对于带菌严重的植株，采集 外植体前对母本喷洒杀虫剂、杀菌剂等，可提高无菌材料的获得率【3 4 。需在户外直接 采集时，也要注意季节和时间性，应避免阴雨天在户外采集外植体，在晴天采时，下 午采取的外植体要比早晨采的污染少，这主要是因为经过日晒后可杀死部分细菌或真 菌。另外在用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对枝条进行预培养，如将枝条 用水冲洗干净后插入无糖的营养液或自来水中，使其抽枝，然后以这种新抽的嫩枝条 作为外植体，或进行黑暗培养，待抽出徒长的黄化枝条时再采取枝条，也可明显减少 污染。另外也可用成熟种子在无菌条件下经严格消毒培育成无菌苗然后采用无菌芽苗 的胚轴、胚根、子叶等为材料，也可减少污染0 5 】。当然，外植体的选择在考虑污染控 制的同时，还应考虑外植体的分化率问题。迄今为止，组织培养获得的成功，几乎包 括了植物体的各个部位，如茎尖、茎段的皮层及维管组织、髓细胞、表皮，块茎的贮 藏薄壁细胞、花瓣、根、叶、子叶、鳞茎、胚珠和花药等。 外植体采回后，需先通过表面处理，再灭菌或其它处理后才能进行接种。先要除 去一些不必要的部分，洗去灰尘，然后用洗洁剂浸泡，冲洗，必要时可用软刷刷洗或 用脱脂棉球擦洗材料表面，然后剪成适宜的大小再灭菌。通过表面处理可减少许多杂 菌。如在马蹄莲根茎的离体培养中，通过清洗根茎外植体的泥土，剥去外面几层包裹 物，流水冲洗1h ，可把杂菌清洗掉6 0 左右。也有延长流水冲洗时间，以冲走嵌 在水仙鳞叶基部的霉菌孢子，污染率可降低p 6 j 。表面处理要结合实际情况，灵活进行 处理，如用刀片刮去枇杷的表皮毛1 3 7 等。 经表面灭菌前的预处理后，茎段、腋芽、叶等依材料的不同用7 5 乙醇浸泡几 秒至几十秒，无菌水冲洗数次，再用0 1 h g c l 2 或其他灭菌剂灭菌3 。1 5m i n ，最 后用无菌水再冲洗数次。一般的灭菌材料在灭菌剂中浸泡时间的长短以及灭菌剂浓度 7 几种观赏植物组织培养与快速繁殖技术研究第一章文献综述 的高低以不同外植体而定。必要时，还要进行二次灭菌或多次灭菌。球茎、块茎、种 子等材料的灭菌可先通过水浴处理，然后再用n a c l 0 或h 2 0 2 等杀菌剂灭菌。水浴 处理要根据外植体的自身条件( 如材料的大小、湿度、材料的生理状态、包裹物的厚 度、生长期的温度条件、材料上的潜伏水平、年龄等) 选择适宜的水浴温度和水浴时 间。如对马蹄莲初代培养过程使用4 8 的热水浴对外植体进行预处理将污染率降 低到了较低水平，且对材料没有副作用【3 8 1 。经过水浴灭菌处理，可杀死一部分微生物， 再经过化学杀菌处理即可达到较彻底的灭菌目的。荚果的灭菌，可将清洗后的荚果转 入9 5 乙醇中，然后取出荚果放入灭菌的培养皿中，点燃灼烧，并不断翻转荚果， 待表面燃尽即可获得无菌荚果，再在无菌条件下取出幼胚或种子用于接种。一般建立 外植体时，每个外植体单独接种于一瓶中，以免交叉污染时无法挽救本来可以无菌的 外植体。 对污染严重的外植体，尤其是由内源细菌弓睫j 的污染，无论用何种表面消毒方法 都不能彻底消除时，可以在培养基中加入杀菌剂。如苯甲酸钠对勿忘我初代培养中的 细菌和霉菌污染的控制效果，优于山梨酸钾、庆大霉素和对照，且外植体的分化率也 较高【3 9 1 。 3 1 2 环境 如接种室环境中存在大量真菌孢子，常规方法很难避免真菌污染，且真菌污染有 着爆发突然，感染面积大等特点，一旦爆发会导致全部材料报废，对一些珍贵的材料 来说尤其是很严重的威胁。平时接种室和培养室要与外界环境注意隔离，保持清洁、 干燥，并定期消毒，可有效控制组培环境中的污染菌。通过降低组培环境中的污染菌 数，可降低组培苗生产中组培苗的污染率1 4 0 。并且，一旦发现培养基生菌，应立即剔 除，并灭菌以后再清洗。还要对接种室和培养室进行紫外线照射或药液熏蒸。此外， 梅雨季节空气湿度大时还应及时对培养室采取抽湿措施。 3 1 3 操作 减少污染，最重要的就是接种人员具有很强的无菌意识，严格按照要求进行无菌 操作。在高压蒸汽灭菌时，要将锅内冷空气排净，否则冷空气就会聚集并滞留在灭菌 锅消毒筒的中下部，造成灭菌不彻底。在超净工作台的操作区内，不要放入过多的待 用材料，避免气流被挡住【4 l 】。在操作前接种室和超净台要开紫外灯3 0m i n 以上，另 外操作人员要对接种工具等进行严格消毒，熟练操作技术，降低污染。在组织培养过 几种观赏植物组织培养与快速繁殖技术研究第一章文献综述 程中，操作人员的消毒问题，对组织培养的成败也很重要。在接种前要剪短指甲、洗 手，接种中操作人员应穿无菌鞋、无菌工作服、带帽和口罩。 另外，由于灭菌成本较高，或获得无菌外植体得率较低，且无菌操作较烦琐，培 养容器大小有限等，使用杀菌剂辅助或代替灭菌2 0 , 4 2 进行组织培养或使用无糖培养技 术【1 8 】等。 3 2 植物组织培养过程中褐化的控制 褐化一般是指在植物组织培养过程中，由培养材料从表面向培养基中释放褐色物 质，以致培养基逐渐变成褐色，培养材料也随之进一步变褐而死亡的现象。褐化可发 生在组织培养的各个阶段，尤其是在外植体建立初期，在植物愈伤组织的继代培养， 悬浮细胞培养，花药培养以及原生质体的分离和培养中也经常发生。由于植物组织中 多酚氧化酶被激活，使细胞中的代谢发生变化，酚类化合物被氧化后产生醌类化合物， 这类物质是棕色的，它们会逐步扩散到培养基中，抑制和干扰外植体组织生理活性， 毒害整个外植体组织，导致组织代谢紊乱，生长受阻，最终逐渐褐化死亡。由于褐化 现象在很多植物组织培养中普遍存在且影响重大，以至在某些植物的组织培养中成为 能否取得成功的决定性作用。 一般认为褐化分为酶促褐化和非酶促褐化。酶促褐化是由于酚类物质的参与而引 起的褐化；非酶促褐化是由于细胞受胁迫或其它不利条件影响所造成的细胞死亡，或 自然发生的细胞死亡而造成的褐化，其中不涉及到酚类物质的产生。目前多数人认为 植物组织培养中的褐化主要是酶促褐化。虽然国内外有许多关于植物组织培养中褐化 现象的报道，也有学者试图通过对植物组织多酚氧化酶等的活性、酚类物质的含量进 行测定，以筛选适宜的外植体，但从目前酶促褐变的研究理论及实验分析上可知，不 同植物其酶促反应体系中的底物亦有很大差别，也并非所有的酚类都是其底物。其实 一般植物组织培养褐化的产生可以分为两步，首先是非酶促褐化的启始，然后导致发 生酶促褐化的爆发。控制褐化的着眼点就在于减少或消除诱因或调节酶促反应的进 程。植物组织培养褐化的产生原因复杂，既有外植体自身的原因，也有培养环境的影 响，而且往往是多种因素同时作用的结果，控制褐化的方法也是需要切合实际变化的。 控制褐化主要从以下两个角度出发：外植体、培养基及培养条件。 3 2 1 外植体 在植物组织培养过程中不同物种之间褐化程度差异很大，就是同种植物的不同品 o 几种观赏植物组织培养与快速繁殖技术研究 第一章文献综述 种间也有存在一定差异，这是由于基因型的不同，易褐化程度也有所不同。在橡胶树 的花药培养中，发现海垦2 号花药的褐变较少，因而比较容易形成愈伤组织【4 3 】。 选择合适的外植体，可以改善一部分植物组织培养褐化的问题。一般来说，用基 部发出的幼芽比用上部高大枝条的壮枝上的芽做外植体褐化轻 4 4 1 ，幼嫩茎尖较木质化 程度高的节段褐化低p 5 1 ，褐变随材料的年龄【4 叼和组织木质化程度增加而增加。不过 对于取材的生长季节来说，有些植物可能合适在旺盛生长时取作外植体，有些可能生 长较弱时更适合旧。而有些通过对母株做一些预培养来减轻褐化。 在对外植体灭菌时，灭菌效果和褐化是一对矛盾体，需要协调好。除了脱毒以外， 外植体一般不要分割得太小，初代物太小，本身的生命力较弱，非常容易褐化。同时， 切割外植体的刀要比较锋利，以免切割时对外植体造成额外的伤害。接种前一般需要 把直接接触灭菌液的外植体的表面切掉薄薄一层，形成新鲜的表面。外植体还可以在 接种前经过一段时间的低温处理或某些抑制褐化的溶液浸泡等【47 1 。同时接种时也要注 意镊子的温度，以免烫伤造成褐化。 3 2 2 培养基及培养条件 培养基的种类、培养基的浓度、激素使用的种类和配伍及浓度、糖的浓度、琼脂 的浓度、培养基的p h 值等都可能会影响到褐化的程度。另外，使用一些添加剂加入 培养基中，来抑制或吸附减低褐化的危害。常用的添加剂有聚乙烯吡咯烷酮( p v p ) 、 活性炭( a c ) 、水解乳蛋白、卵清蛋白、牛血清蛋白、亚硫酸盐、硫脲、二氨基二 硫代甲酸钠、二乙基二硫代氨基甲酸钠、氯化钠、抗坏血酸( v c ) 、半胱氨酸、巯 基乙醇、芸香苷、酪氨酸、柠檬酸、谷胱甘肽等。要得到既能控制褐化又不影响生长 和分化的合适添加剂和适宜浓度，不同外植体之间可能会有一定的差异h 8 。5 0 】。 当培养基上出现褐化时，将外植体及时转移到新鲜的培养基上，在某些情况下是 比较方便和有效缓解褐化的。接种以后的培养条件的改善也可以减少褐化的危害，如 培养温度，光照等。通常容易褐化的植物组织培养初期放置于黑暗或弱光下，一般较 低的温度比较高的温度褐化程度低。 要建立容易分化且褐化程度低的外植体，通常采集植株较合适的部位作为外植 体。时间宽裕时也可以等合适的季节采集材料来建立外植体，一般是对母株或采集的 材料，进行适当的预培养，来减轻植物组织培养时的褐化程度。当褐化较严重时，应 该从简单的方法去着手，用较经济的方式去缓解褐化。同时，因为植物的基因型的不 1 0 几种观赏植物组织培养与快速繁殖技术研究 第一章文献综述 同，导致褐化的原因不同，解决褐化的途径也有所不同，需要灵活使用添加剂。 3 3 植物组织培养过程中玻璃化的控制 在草本和木本植物中，已报道出现玻璃化苗的植物已达7 0 多种【5 1 1 。玻璃苗是植 物组织培养时一些半透明状的畸形组培苗，这种现象称为玻璃化现象，又称过度水化 现象。玻璃苗的组织结构和生理功能异常，已成为组培工作中的一大问题。国内外的 研究者在玻璃化苗的解剖学特点、生理生化变化、形成原因及控制方法上取得了一定 的进展，但是对于玻璃化发生规律和机理及原发机制尚无定论。关于玻璃化发生原因 的研究报告不少，目前比较集中的是水势过高的影响，以细胞分裂素为代表的激素平 衡问题和以n i - h + 为代表的矿质元素平衡供应问题三个方面。 植物组织培养不论试验设计千变万化，但有一些方面是类似的，如光照弱，培养 容器内相对湿度近乎饱和，氧气供应不足，培养基内各成分大多相似，无机盐供应处 于完全速效状态和异养营养等【5 2 】。但是，不同植物生长分化环境的需求差异可能比较 大，因此对于比较相似的培养环境，不同植物所不能满足的环境需求可能不同，所以 对于不同植物来说产生玻璃化的原因就有所不同。玻璃化苗的形成是一个渐进过程， 一般认为玻璃化是一个受环境胁迫的过程，与植株本身、培养基成分和培养条件都有 关。不同品种植物其组培苗玻璃化发生的几率有所不同，也有人认为同一品种的不同 外植体部位对玻璃化发生的几率也可能有所影响【5 引。 一般认为已经玻璃化的组培苗，随着培养环境的变化是有可能逆转的，也可以通 过诱导愈伤组织形成后再生成正常苗。实际中，控制组培苗玻璃化进程，常常是在组 培苗刚开始玻璃化，玻璃化程度较轻微时，就通过改善其组培环境，包括对培养基的 改良等来实现的。 对培养基的改良包括：提高培养基中琼脂的用量；增加培养基中蔗糖的含量；一 般避免使用果糖和葡萄糖；培养基中添加聚乙烯醇、活性炭及青霉素g 钾等；在培 养基中，减少或除去n h 4 n 0 3 ，或采用低n h 4 + 水平的基本培养基；轮流交替使用 较低和较高浓度的细胞分裂素6 - b a ，或换用其它的激素，可以确保一定的增殖率和 减少玻璃化现象的发生。另外，适量减小接种密度；使用通气较好的培养容器；降低 培养室温度，尤其是要避免组培架的日光灯太过接近上层，使上层培养瓶底部温度太 高；增加光照强度或调整光照时间等措施都可以减少试管苗玻璃化的发生率。由于导 致玻璃化的原因不同，不同组培苗解决玻璃化的途径也可能有所不同。 1 1 几种观赏植物组织培养与快速繁殖技术研究 第一章文献综述 4 观赏植物组织培养技术研究现状 观赏植物组织培养研究己涉及到蕨类植物门、裸子植物门和被子植物门。到目前 为止，已对8 8 科，6 1 9 个种或变种的观赏植物进行过组织培养技术的研究。其中11 8 种植物能产生胚状体，6 0 种植物能通过花药诱发花粉愈伤组织获得再生植株5 7 1 。 尤其是在1 9 6 0 年m o r e l 采用兰属( c y m b i d i u m ) 茎尖培养获得成功后，将6 6 属以上 的兰花植物纳入了试管繁殖体系，2 4 种兰花获得了花粉植株，促进了观赏植物组织 培养技术的研究5 4 阅。 4 1 基本培养基的研究与应用 基本培养基目前有几十种，并由广普型逐渐向专用型转化。多数植物和器官采用 m s 基本培养基，部分植物和器官已经研究出专用型培养基。如杜鹃茎段培养的k y t e & b r i g g s 和a t h a n a s i o s & r e a d 培养基、兰属微繁殖的w i m b e r 培养基、卡德兰微繁 殖的k n u d o nc 改良培养基等。不同种类的植物在培养过程中需要的营养不一致， 选用的培养基种类不同【5 4 。5 7 】，不同外植体和不同培养目的的基本培养基也不相同， 如k y t e & b f i g g s 用于杜鹃茎切段培养，在启动与茎增殖阶段的各种无机物及激素含 量均高于生根阶段的含量；用于卡德兰微繁殖的培养基，在启动、增殖和生根阶段， 其培养基的无机物、有机物、激素的种类及用量均不相同。用于植物茎尖培养的培养 基，目前使用频率最高的有m s 、m o r e l 、m o r e l m a r t i n 、n i l s e n 、m o r e l & m u l l e r 、 m o r i 、w a n g & h u a n g 、b a k e r & k i n n a m a n 等：用于花药培养的培养基有m s 、n 6 、 马铃薯2 、w 1 4 、c - 1 7 ；用于大麦胚培养的培养基有b i i 、c 一1 7 、c 一2 1 、c - 4 5 ；以 及适于低密度下培养原生质体的k m 8 p 培养基【5 4 5 q 等。总之，除个别植物或器官对 基本培养基有特殊要求之外，大多数用器官作外植体繁殖的培养基，以m s 使用频率 最高，多数是在无机盐、激素、有机物用量上稍有差异。 4 2 植物生长调节物质在组织培养中的地位与作用 植物生长调节物质能以微小的量影响细胞分化、分裂、发育等生理活动。常用于 组织培养的生长调节物质有生长素类、细胞分裂素类和赤霉素类。 4 2 1 生长素类 生长素类的生理作用主要是促进细胞伸长生长、细胞分裂、诱导愈伤组织形成和 促进生根肼。5 7 1 。常用的生长素有i a a 、i b a 、n a a 、n o a 、p - c p a 、2 , 4 一