（神经生物学专业论文）肾上腺素能受体对前额叶皮层兴奋性突触传递的调控.pdf

中文摘要 中文摘要 前额叶皮层( p r e 丘0 n t a lc o r t e x ，p f c ) 在思维、推理、行为的计划和组织等许 多脑的高级功能中起着关键作用。去甲肾上腺素( n o r 印i n e p l l r i n e ，n e ) 是一种广 泛分布于外周和中枢神经系统的神经递质，以往的行为学和生理学研究表明， n e 系统在调控p f c 认知功能中起重要作用。 前额叶皮层的n e 能受体分为0 l ，仅2 ，和d 三种亚型。以往的工作多采用行 为学手段，着重研究仅l 和0 c 2 受体对前额叶皮层认知功能的调控，在细胞水平研 究这些受体在前额叶突触传递中的作用的工作尚不多。我们的工作采用离体脑片 膜片钳记录、在体场电位记录等电生理手段，并结合免疫组化技术，首次研究了 p 和仪2 受体在前额叶皮层兴奋性突触传递中的调控作用。 第一部分：内侧前额叶皮层p 受体参与对兴奋性突触传递的调控 本部分实验采用脑片膜片钳全细胞记录手段，研究肾上腺素能6 受体在大鼠 内侧前额叶第v i 层锥体细胞兴奋性突触传递中的调控作用。实验显示，给予p 受体激动剂，异丙肾上腺素( i s o p r o t e r e n o l ，i s o ) ，引起自发兴奋性突触后电流 ( s e p s c s ) 的频率增加，幅度增大，引起微小兴奋性突触后电流( m e p s c s ) 的 频率增大，但不影响其幅度。当c d 2 + 存在时，i s o 对m e p s c s 的易化效应被阻断。 给予i s 0 令非n m d a 受体和n m d a 受体介导的诱发兴奋性突触后电流( e e p s c ) 的幅度增大，并使其双脉冲易化( p p f ) 值变小。在对压力给药或灌流给药方式 引起的n m d a 诱发的内向电流上，i s 0 令其幅度显著增大。当电极内液中加入 p k a 的抑制剂后，i s o 对n m d a 受体介导的e e p s c 和n m d a 诱发的内向电流 的易化效应被抑制。免疫组化的结果显示，p l 受体在内侧前额叶皮层的突触前末 梢和神经元上均存在。本工作首次提供了直接的电生理证据，表明d 受体通过突 触前和突触后的双重机制，易化内侧前额叶皮层的兴奋性突触传递。 关键词： i s o p r o t e r e n 0 1 ；d 受体；兴奋性突触后电流；内侧前额叶皮层；大鼠 中文摘要 4 第二部分：内侧前额叶皮层0 【2 受体参与对兴奋性突触传递的调控 前人的研究表明，内侧前额叶皮层的0 【2 受体，特别是0 c 2 a 受体激活后，对工 作记忆、注意力调节和行为抑制等前额叶的认知功能有改善作用。0 c ：受体激动剂 在临床上被用于治疗注意力缺损多动症、创伤后应激综合症和精神分裂症等疾 病。但是，0 c 2 受体调控前额叶皮层功能的生理机制尚不清楚。 我们将仅2 受体激动剂c l o n i d i n e 或2 a 受体激动剂g u a i l 蠡l c i n e 用全身给药或内 侧前额叶局部给药的方式注射入实验大鼠，在麻醉大鼠和清醒大鼠上记录兴奋性 突触后场电位( m p s p ) ，观察药物对这一指标的影响。我们亦应用全细胞膜片钳 记录手段，在离体大鼠脑片上，观察激动剂对内侧前额叶皮层第v i 层锥体细 胞的诱发兴奋性突触后电流( e e p s c ) 的影响。实验结果显示，0 c 2 受体和0 c 2 a 受 体的激动剂均能显著抑制m p s p 和e e p s c ，并且对双脉冲易化没有影响；这种 抑制效应被仪2 受体拮抗剂y o h i m b i n e 和g i 抑制剂n f 0 2 3 阻断。本部分工作表明， 大鼠内侧前额叶皮层0 c 2 受体激活后，抑制兴奋性突触传递，并且这一效应可能是 通过突触后q 2 a 受体实现的。 关键词： g u a l l f a c i n e ：0 c 2 受体；兴奋性突触传递；内侧前额叶皮层；大鼠 英文摘要 6 c u r r e n tw 弱p a r t l yo rc o m p l e t e l yb l o c k e di i lt h ep r e s e n c eo fr p c a m p s ，ap r o t e i nk i n a s ea i i l l l i b i t o r i m m u n o h i s t o c h e m i s t 巧s t a i n i n gs h o w e dt h a td l - a re x i s t si nb o t hn e e lt e 咖i n a l s 柚dn e u r o n si nt h em p f c t h ep r e s e n ts t u d yp r o v i d e sa s 仃o n gd e m o n s t r a t i o nt h a t 陆a r a c t i v a t i o nf a c i l i t a t e se x c i t a t o 叫s y n a p t i ct r a n s m i s s i o ni nt h em p f ct h r o u 曲b o t hp r e a n d p o s t s y n a p t i cm e c h a n i s m s k e yw o r d s ：i s o p r o t e r e n o l ，p - a d r e n o c e p t o r ，e p s c ，m e d i a lp r e f r o n t a lc o n e x ，r a t p a r t2 ：a 2 。a d r e n e r g i ca c t i v a t i o ni n h i b i t se x c i t a t o r ys y n a p t i ct r a n s m i s s i o n i nt h em e d i a lp r e f r o n t a lc o r t e xi nr a t s 加p f 阳a n d 觑v 扔切 s t i m u l a t i o no fo 眨，e s p e c i a l l yo 【2 a - a d r e n o c e p t o r ( a r ) ，i nt h ep r e f r o n t a l c o r c e x ( p f c ) p r o d u c e sab e n e f i c i a le 日e c to nc o g n i t i v ef u n c t i o n ss u c ha sw o r k i n gm e m o 秽。毗a d r e n e 唱i c a g o n i s t sl i k ec l o n i d i n ea n dg u a n f a c i n eh a v eb e e nu s e d x 第一部分内侧前额叶皮层b 受体参与对兴奋性突触传递的调控 一、前言 前额叶皮层( p r e 盘o n t a lc o i r t e x ，p f c ) 是系统发生上出现最晚、个体发育中最 迟成熟的大脑新皮层，有着丰富的皮层间及皮层下交互联系( g o l d m a n i h k i ca n d p o r r i n o ， 19 8 5 ；p r e u s sa n dg o l d m a n r a k i c ， 19 9 1 ；h o fa n dn i m c h i n s k y ， 19 9 2 ； m o r e c r a re ta 1 ，1 9 9 2 ；c 锄i c h a e la i l dp r i c e ，1 9 9 4 ；f u s t e r ，1 9 9 7 ) 。p f c 在思维、推 理、行为的计划和组织等脑的许多高级功能中起着关键作用( g o l d m a ne ta 1 ， 1 9 9 5 ；m i l l e ra 1 1 dc o h e n ，2 0 0 1 ) 。p f c 还是工作记忆的关键脑区( f u n a l l a s h ie ta 1 ， 1 9 8 9 ；f u l l a l l a s h ie ta 1 ，1 9 9 3 ；b a d d e l e y ，2 0 0 3 ；f u s t e r ，2 0 0 3 ；b o d n e re ta 1 ，2 0 0 5 ) ，并参 与长时程记忆的储存( r d s s ie ta 1 ，2 0 0 1 ；s i m o n sa n ds p i e r s ，2 0 0 3 ) 。p f c 受损的动 物和人均表现出不同程度的行为紊乱，例如工作记忆、注意力和行为抑制等功能 受损( l u r i a ，19 6 6 ；f u s t e r ，19 9 7 ) 。 去甲肾上腺素( n o r e p i n e p h e r i n e ，n e ) 是一种广泛分布于外周和中枢神经系 统的神经递质( l i n d v a l le ta 1 ，1 9 8 4 ) 。前额叶皮层接受来自蓝斑( 1 0 c u sc e n l l e u s ， l c ) 的肾上腺素能纤维投射，它亦向l c 提供其来自皮层的唯一输入( a m s t e na n d g o l d m a n r a k i c ，1 9 8 4 ) 。这种交互式的紧密联系提示，在前额叶皮层和l c 之间， 存在重要的功能联系( f u x ee ta 1 ，1 9 6 8 ) ，表明n e 对p f c 功能有着重要的调节作 用。行为学和电生理的研究表明，n e 能系统在调控p f c 认知功能中起重要作用。 例如，最近的一项研究显示，大鼠在执行延迟选择任务时，p f c 的n e 水平升高， 这一结果提示，n e 递质的传递在前额叶执行工作记忆任务中起作用( r o s s e t t i a i l dc a r b o n i ，2 0 0 5 ) 。 n e 通过伐l ，0 c 2 ，和p 受体行使其生理功能。内源性释放的中低浓度水平的 n e 能改善前额叶皮层的认知功能，如工作记忆的表现等( b r o z o s he ta 1 ，1 9 7 9 ； a m s t e na n dg 0 1 d m a n - r a k i c ，1 9 8 5 ；a m s t e na n dl i ，2 0 0 5 ；r o s s e t t ia i l dc a r b o n i ， 2 0 0 5 ) 。研究表明，这种改善作用，是通过0 c 2 受体，特别是0 【2 a 受体实现的( a m s t e n a 1 1 dg 0 1 d m a i l - r a k i c ，1 9 8 5 ；a m s t e ne ta 1 ，1 9 8 8 ；l ia n dm e i ，1 9 9 4 ；f r a l l o w i c za 1 1 d a m s t e n ，1 9 9 8 ；l ie ta 1 ，1 9 9 9 ；m a oe ta 1 ，1 9 9 9 ；a m s t e na n dl i ，2 0 0 5 ) ，0 c 2 受体也是 第部分内侧前额叶皮层p 受体参与对兴奋性突触传递的调控 9 三种亚型中被研究最为广泛的受体。另有些证据表明，当n e 高浓度释放时， 会激活伐l 受体，从而损害前额叶的认知功能( a m s t e ne ta 1 ，1 9 9 9 ；m a oe ta 1 ， 1 9 9 9 、。 但是，关于肾上腺素受体的另一种亚型，p 受体在前额叶的功能，我们尚所 知甚少。p 受体是一种g 蛋白耦联受体( g p c 黜) ，它通过g s 蛋白，调节腺苷酸 环化酶( a c ) 的活性( d a l ye ta 1 ，1 9 8 1 ) 。在它的几种亚型中，p l 和p 2 在全脑都 有分布( n i c h 0 1 a se ta 1 ，1 9 9 6 ) 。当p 受体被激活后，a c 促使a t p 转变成c a m p ， 增加胞内c a m p 水平，而后者进一步激活蛋白激酶a ( p k a ) ，p k a 能磷酸化多 种突触前和突触后的蛋白底物，从而调节突触强度。因此，p 受体一c a m p p k a 通路有可能在调节突触传递和突触可塑性中起着重要作用。 事实上，p 受体在其它脑区的生理功能，已有许多研究。在海马，刺激p 受体 能降低诱导早期相l t p ( t h o m a se ta 1 ，1 9 9 6 ；k a t s u k ie ta 1 ，1 9 9 7 ) 和长时程l t p ( g e l i n a sa n dn g u y e n ，2 0 0 5 ) 的阈值。我们实验室先前的研究也表明，海马c a l 区的p 受体参与调控场景恐惧记忆的巩固和空间记忆( j ie ta 1 ，2 0 0 3 b ；j ie ta 1 ， 2 0 0 3 a ) 。在杏仁核，也有研究表明，p 受体的激活能增强兴奋性突触传递( h u a n g e ta 1 ，1 9 9 8 a ；h u a i l ge ta 1 ，1 9 9 8 b ) ；而阻断基底杏仁核的p 受体则会损害恐惧记忆 ( d e b i e ca n dl e d o u ) 【，2 0 0 4 ；h u r l e m a n ne ta 1 ，2 0 0 5 ) 和味觉记忆( m i r a n d ae ta 1 ， 2 0 0 3 1 。 然而，在前额叶皮层，p 受体的激活是否有助于调控突触传递和认知功能呢? 这方面的研究尚很少。t r o n e l 等曾报道，训练后2 小时，阻断前额叶的d 受体， 导致大鼠的记忆受损，而训练后5 分钟给药则记忆不受影响，这表明b 受体参与 记忆巩固的晚期相( t r o n e le ta 1 ，2 0 0 4 ) 。r a m o s 曾报道，阻断p l 受体有助于改善 大鼠和猴的工作记忆( r 锄o se ta 1 ，2 0 0 5 ) 。在本实验中，我们利用膜片钳全细胞 记录手段，研究了p 受体在内侧前额叶皮层兴奋性突触传递中的作用。 第，1 部分内侧前额叶皮层p 受体参与对兴奋性突触传递的调控 1 0 鬻复薹霎掌毒争姜蘩主妻耋l 雾舜：个羹i 錾土l 力f 冀一萋萎瞿；萎藕梆鳓! 剃国裂譬孽纠型蓍蓍辩 胡酗羹蒺雾眨，媚蟛赫船瓣静舀羹舯影蝴i 主攀垂羲麟茹羹蓁霜怛蔼型羹i 奏窆鍪| 臻 指型喜巢丽掣青羲型磊制谢箱葫羹5 冀匿鼠鲕秆。隔巍囊；鞋器绺型零编薹型坚 摧强，姓锰仨娶薹墓嚣。 堡，霞霪羹蓁垂 有的数值均以均数标准误表示，组间数据比较采用单尾a n o v a 分析。 尸 0 0 5 时，认为有显著性差异。 ii 免疫组织化学实验 a 溶液配制 1 生理盐水 9g n a c l 溶于1 0 0 0 “双蒸水。 2 0 2 mp b n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 06 1 6 9 和n a h 2 p 0 4 2 h 2 05 6 9 ，溶于适量双蒸水，定容至 10 0 0 1 i l l ，p h 值7 4 ，室温储存。 3 多聚甲醛固定液 多聚甲醛4 0 9 加热( 6 0 ) 搅拌，溶解于适量0 1 mp b ，必要时加入少量 na o h 助溶。滤纸过滤，用0 1 mp b 定容至1 0 0 0 m l ( p h = 7 4 ) ，4 备用。 4 2 0 蔗糖 蔗糖2 0 9 溶于适量0 1 mp b 并定容至1 0 0 0 “配成2 0 蔗糖。 5 o 1 mp b s 和o 0 1 mp b s n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 03 0 8 9 ，n a h 2 p 0 4 2 h 2 02 8 9 ，n a c l 8 5 9 溶于适量双蒸水，定 容至1 0 0 0 m l ( p h = 7 4 ) ，室温储存。0 0 1 mp b s 由0 1 mp b s 稀释而成。 6 荧光封片剂 第一部分内侧前额叶皮层d 受体参与对兴奋性突触传递的调控 c 全细胞记录 1 膜片钳记录使用的电极由长度为1 0c m ，外径1 5i m 、内径为o 8 6 衄的硬 质玻璃毛坯管( s 似e ri n s t m m e n t s ，u s a ) 在微电极拉制仪( p 9 7 ，s 毗e ri n s t r u m e n t s ， u s a ) 经过多步拉制而成。拉制成的电极尖端约为2u m ，灌注电极内液后的电极 阻抗为4 8m q 。电极内液的配方如下所示： 1 5 0k g l u c o n a t e ，0 4e g t a ，8n a c l ，2a t p m g ，o 1g t p n a 3 和1 0h e p e s ( 删) 。用k o h 调p h 值至7 3 7 4 ，渗透压为2 9 0 3 2 0m o s m 。在部分实验中， 在电极内液中额外加入p k a 的抑制剂，1 0 0 m 的r p c 蝴p s 。电极内液用巾0 2 m m 一次性滤器过滤后，分装于o 51 1 1 l 离心管中，一2 0o c 保存备用。 电极充灌时，根据虹吸原理，首先将电极尖端浸入电极内液，使尖端部分充 满液体，然后用连有聚乙烯塑料细管的注射器，从电极尾部灌充内液。如果有气 泡，手持电极，使尖端朝下，轻弹电极管壁，即可排除气泡。电极内液不要充灌 地太多，否则电极内液溢出，濡湿电极夹持器，造成各种故障。将已充灌的电极 装在夹持器上。 2 本研究中采用的是全细胞记录模式。 封接形成前( 低阻抗时) ，极微小的电压变化都可能带来巨大的电流变化， 所以在电压钳( v o l t a g ec l a n l p ，v c ) 制模式下，扫描线可能从示波器窗口上突然 消失，为了防止这种现象，将放大器的增益设置在较低的档次：5 m v p v 档。 用注射器给电极适量正压，以防止电极尖端吸附异物颗粒。将电极放入标本 浴槽，此时可以测出电极的阻抗，本实验的电极阻抗为4 。8 m q 。 通过放大器给予外加振幅5 i n v ，5 m s 的矩形脉冲波，监视其电流应答开始的 电极阻抗值和其后的由于操作而产生的变化，当矩形波脉冲在o n 和o f x 第一部分内侧前额叶皮层p 受体参与对兴奋性突触传递的调控 细胞。此时，可明显看到电极内的正压，在细胞膜表面吹开一凹陷，同时应变电 流变小，此时，放开正压，再施加小的负压秒钟，如果观察到应变电流为零，电 极尖端与细胞表面形成的封接阻抗为1 g q 以上，表明封接已成功，形成吸附模式， 释放负压。 3 在细胞吸附模式下，给予短促的吸力，或用大电流( 2 0 l n 给予高电压电 击( z a p p i n g ) ，断离膜片形成全细胞记录模式。此时细胞膜电容增加，出现新的 冲击电流( s u 唱ec u r r e m ) 即缓慢电容电流( s l o wt r 趾s i e n t ) ，一般用旋钮进行补 偿。 将膜片钳放大器由电压钳状态转换成电流钳状态，以记录膜电位和动作电 位。选取静息电位在6 0m v 左右的神经元，用一定时程的、连续的、步长合适的 递增内向电流，刺激细胞，诱发产生动作电位，动作电位幅值大于8 0m v ，并出 现串发放，表明细胞状态良好。 4 在正式实验中，将记录模式切换到电压钳模式，记录如下电生理指标：自 发兴奋性突触后电流( s p o n t a n e o u se x c i t a t o 巧p o s t s y n a p t i cc u r r e n t s ，s e p s c s ) 。微小 兴奋性突触后电流( m i n i a t u r ee x c i t a t o 巧p o s t s y n a p t i cc u 盯e n t s ，m e p s c s ) ，诱发兴 奋性突触后电流( e v o k e de x c i t a t o r yp o s t s y n 印t i cc u r r e n t s ，e e p s c ) ，和n m d a 诱导 的内向电流。凡串联阻抗变动范围超过1 5 的细胞不记入统计结果。在每次实验 中，待记录稳定后，再作进一步的药物处理。 5 在记录诱发e p s c 中，将双极刺激电极放置在所记录神经细胞的1 5 0 2 0 0 p m 附近，给予强度为5 0 一1 5 0 “a ，持续时间为1 0 0 “s 的电流刺激，刺激频率为 0 0 3 3 h z ，即每3 0 秒给予一个电流刺激。以下图表中所示的突触反应电流均为1 0 个连续反应电流的叠加。 d 试剂和给药 ( - ) 一i s o p r o t e r e n 0 1h y d r o c m o r i d e ( i s o ) ，d l - p r o p r 肌0 1 0 lh y d r o c h l o r i d e ( p r o ) ， b i c u c u l l i n em e t l l i o d i d e ( b m i ) ，6 一c y a i l o 一7 - n i t r o q u i n o x a l i n e - 2 ， 3 一d i o n e( c n q x ) ， 第。喑b 分内侧前额叶皮层p 受体参与对兴奋性突触传递的调控 1 6 相继灌入生理盐水( 3 7 ) 3 0 0 m 1 及4 多聚甲醛固定液( 4 ) 2 5 0 r n l ，随后减慢 灌流速度维持灌注多聚甲醛固定液3 0 m i n 。灌注完毕后，取出大鼠脑部，置于2 0 蔗醣溶液直至标本沉至容器底部。取出标本用o c t 包埋后于冷冻切片机( l e i c a ， g e 肌a n y ) 进行前额叶冠状切片，片厚3 0 “m 。 将切片浸入含6 正常驴血清( n d s ) ，1 牛血清白蛋白( b s a ) 和o 2 t r i t o n x 1 0 0 的0 0 1 mp b s ( 磷酸缓冲液，p h 7 。4 ) 中于4 过夜以降低非特异性背底 染色。然后一组切片移入含兔抗p 1 受体) 单克隆抗体( 1 ：1 0 0 0 ，s i g m a ) 和小鼠抗 s y r 砭l p t o p h s i n 单克隆抗体( 1 ：2 0 0 ，c h e m i c o n ) 的0 0 1 mp b s 抗体稀释液于4 孵育 7 2 h 。另一组切片移入含兔抗p 1 受体单克隆抗体( 1 ：1 0 0 0 ，s i g m a ) 和小鼠抗神经 核( n e u n ) 单克隆抗体( 1 ：2 0 0 ，c h e m i c o n ) 的0 0 1 mp b s 抗体稀释液于4 孵育7 2 h 。 两组切片用o 。0 1 mp b s 漂洗( 3 次每次1 0 m i n ) 后，分别于对应二抗4 孵育2 h ， 以显示结合位点。两组切片的二抗均为含德克萨斯红偶联的驴抗兔i g g ( 1 ：1 0 0 ， j a c k s o r l ) 和f i t c 偶联的驴抗鼠i g g ( 1 ：1 0 0 ，j a c k s o n ) 的0 0 1 mp b s 的抗体稀释液。以 上抗体稀释液中均含3 正常驴血清( n d s ) ，0 5 牛血清白蛋白( b s a ) 和o 2 t r i t o n x 1 0 0 。 反应完毕的切片用荧光封片剂封片后，在共聚焦激光扫描显微镜( l e i c a ， g e r n l a n y ) 下观察，使用4 0 倍或6 3 倍浸油物镜。 第。部分内侧前额叶皮层d 受体参与对兴奋性突触传递的调控 1 8 三、实验结果 本实验采用全细胞膜片钳方法，记录大鼠内侧前额叶皮层v i 层锥体细胞的 电活动。总共成功记录了2 0 0 个细胞，其静息电位均在一5 5m v 以上( 多数在一 6 0n l v 以上) ，动作电位的幅度均大于8 01 1 1 v ，且没有自发性电活动。此外，这些 细胞的动作电位表现出频率适应性，表明它们是锥体细胞。在所记录的细胞中， 动作电位的发放模式有规则发放模式( r e g u l a rs p i l ( i n g ，r s ) 和内在爆发模式 ( i n t r i n s i cb u r s t i n g ，i b ) 两种( 图1 2 ) ，这与前人对内侧前额叶皮层锥体细胞动 作电位类型的叙述相吻合( y a n ge ta 1 ，1 9 9 6 ) ，表明我们所记录到的是健康的细 胞。r s 发放的特征是动作电位无爆发式发放，动作电位的发放间隔逐步延长， 每一个动作电位后都有一后超级化后电位( a r e r h y p e r p o l 撕z a t i o n ，a h p ) 。i b 发 放的特征则是动作电位的发放在开始时有一个“串 发放，动作电位后常跟随去 极化后电位( d e p o l 撕z i n g 疆e r p o t e n t i a l ，d a p ) 。 a b 图卜2 前额叶锥体细胞动作电位发放模式分类 a ：规则发放模式( r e g u l a rs p i k i n g ，r s ) b ：内在爆发模式( i n t r i n s i cb u r s t i n g ，i b ) 第一部分内侧前额叶皮层b 受体参与对兴奋性突触传递的调控 1 9 i p 受体激活对自发兴奋性突触后电流的影响 在7 0m v 钳制电位下，绝大多数所钳制的锥体细胞都可记录到按一定频率发 放的微小内向电流，这些电流具有快速上升相和缓慢衰减相( 图1 3 ) ，提示它们 可能是自发兴奋性突触后电流。进一步的实验表明这些电流可以被n o n n m d a 谷 氨酸受体拮抗剂( c n q x ，2 0 “m ) 完全阻断( 图1 3 ) ，而不被n m d a 谷氨酸受 体拮抗剂( a p 5 ，5 0 “m ) 阻断，证明这些电流确实是自发兴奋性突触后电流， 而且是由突触后n o n - n m d a 受体介导。下面我们研究了加入肾上腺素能d 受体激 动剂异丙肾上腺素( i s o p r o t e r e n 0 1 ，i s o ) 对自发兴奋性突触后电流的作用及其机 制。 c o n t r o l 图卜3 自发兴奋性突触后电流可被 n o n - n m d a 谷氨酸受体拮抗剂所阻断 1 p 受体激活易化自发兴奋性突触后电流的频率和幅度 自发兴奋性突触后电流( s p o n t a l l e o u se x c i t a t o 巧p o s t s y n a p t i cc l l 玎e n t s ，s e p s c s ) 是在无突触前刺激的条件下，由突触前神经末梢囊泡自发释放谷氨酸引起的兴奋 性突触后电流，它反映的是自然状态下突触前神经末梢自发释放谷氨酸的情况。 在本部分实验，我们观察了在灌流液中加入1 0 0 mi s 0 对s e p s c s 频率和幅度 的影响。 在2 0 个细胞上，我们观察了i s o 对s e p s c s 频率的影响。结果表明，在大 多数细胞( 1 7 2 0 ) 上，加入1 0 0p mi s o 后，s e p s c s 的频率显著增加( k s 检 验，尸 0 0 5 ：图1 4 ) 。图1 4 a 是典型的原始记录图，可以看出1 0 0 “mi s 0 对 s e p s c s 的频率有明显的易化效应。图1 4 b 是给予1 0 0 “mi s o 前后s e p s c s 频 第一。部分内侧前额叶皮层d 受体参与对兴奋性突触传递的调控 2 0 率变化的时程图，可以看出，s e p s c s 的频率大约在给药后3 分钟开始增加，在 i s o 洗除后，这一效应仍然存在，并且能持续相当长的时间( 洗除后2 0 分钟， 易化效应依然存在) 。图1 4 c 是一例细胞上给予i s o 前后s e p c s s 自发电流间隔 时间的累积分布图，进一步显示给予i s o 后s e p s c s 的频率显著增加( k s 检验， 尸 o 0 5 ) 。实验在另外1 6 例细胞上进行了重复，得到了类似的结果，另有三例 细胞的s e p s c s 频率在加药后没有显著变化。在给予1 0 0 “mi s 0 前后，s e p s c s 的频率均值分别为2 2 0 3h z 和3 7 o 4h z ，两者配对t 检验，尸 0 0 5 ( n = 1 7 ； 图1 4 d ) 。这些结果表明1 0 0 mi s o 对s e p s c s 的频率有易化效应。 在上述2 0 个细胞，我们同时观察了i s o 对s e p s c s 的幅度的影响。结果表 明，i s o 增强锥体细胞s e p s c s 的幅度。在大多数细胞上( 1 2 2 0 ) ，1 0 0 “mi s o 对s e p s c s 幅度有显著增强作用( k s 检验，尸 0 0 5 ) 。图1 4 e 是一例细胞上给 予i s o 前后s e p s c s 幅度的累积分布图，显示给予i s o 后s e p s c s 的幅度显著增 强( k s 检验，p 山 第一部分内侧前额叶皮层p 受体参与对兴奋性突触传递的调控 c e 123 i n 协嗍n t ；n t e r 垤il s ) o1 0 2 03 0柏50 a m p t u d e ( p a ) 图卜4p 受体激活易化s e p s c s 的频率和幅度 c ： 给予1 0 0 “mi s o 前后s e p c s s 自发电流间隔时间的累积分布图。 d ：直方图显示i s o 引起所记录锥体细胞的s e p s c s 频率增加，这一效应被d 受体拮抗剂p r o p r a n 0 1 0 l 阻断。 e ：给予1 0 0p mi s o 前后s e p c s s 自发电流幅度的累积分布图。 f ：直方图显示i s o 引起所记录的锥体细胞s e p s c s 幅度增强，这一效应被p 受体拮抗剂p r o p r a n o l o l 阻断。 i 5 3 2 1 o “ ” 他 e o l (zhi_u螗山|s芎。暑已芭k严r vd一_o_葛毒星_iv o 8 6 4 2 o 仙 j 启 j j co；oek；罨辱一=e30 o 8 6 4 2 o 1 o co；u_cl9，；辱一：c；o 第部分内侧前额叶皮层d 受体参与刈兴俞性突触传递的调控 2 4 的这一易化效应。m e p s c s 的频率均值在给予1 0 0 mi s o 前后分别为1 8 0 2h z 和2 5 0 2h z ，两者t 检验，p 0 0 5 ) 。实验在此1 0 个细胞上都得到了类似结果。m e p s c s 的 幅度均值在给予i s o 前后分别为1 4 4 0 5p a 和1 4 5 o 5p ar 胗0 0 5 ，配对t 检 验；图1 6 f ) 。这些结果表明i s o 对锥体细胞的m e p s c s 的幅度没有显著影响。 a m e p s c si nt h ea b s e n c eo fl s o m e p s c si nt h ep r e s e n c e0 fl s 0 岬m 州俐叩椭忡州懒黼lr 甲州蝴删岬r 懒忡 z 。p a o 5s 6 0 雹 051 0 1 52 02 5 t i m e ( m i n ) 图卜6b 受体激活增加m e p s c s 的频率，但不影响其幅度 a ：在灌流液中没有i s 0 ( 左) 和存在1 0 0u mi s o ( 彳i ) 条件卜i 记录剑的锥 体细胞的m e p s c s ，钳制电压为7 0m v 。 b ：i s 0 易化m e p s c s 频率的时程图。 一协on、o价乱山i仁一唧_co山 第一一部分内侧前额叶皮层p 受体参与对兴奋性突触传递的调控 在另外6 例细胞上进行的对照实验显示，当灌流液中预先加入5 0 “m 的p 受体 拮抗剂p r o p r a n o l 0 1( p r o ，心得安) 时，i s 0 对m e p s c s 的频率和幅度均不产 生易化效应( 尸 0 0 5 ，配对t 检验；图1 6 d ，f ) ，这一结果表明i s o 的易化效 应是通过作用于p 受体产生的。 接下来，我们用1 0p m 的i s o 观察它对m e p s c s 的易化效应，得到了类似 的结果。m e p s c s 的频率均值在给予1 0 mi s o 前后分别为1 5 o 2h z 和 2 1 o 2h z ，两者t 检验，尸 0 0 5 ，配对t 检验；图1 6 f ) 。 cd e 1 o 量 8 苗 罡 6 宝 薹4 至 8 2 o o o123 l n 协卜e 坩n ti n 协r v a i ( s l o1 02 030o5 0 1 p m i s o1 p m i a m p l i t u d et p a n 椭s o口o ii s 口白咖il s o + p 图卜6p 受体激活增加m e p s c s 的频率，但不影响其幅度 c ：给予1 0 0p mi s o 前后m e p c s s 自发电流间隔时间的累积分布图。 d ：直方图显示i s o 引起所记录的锥体细胞的m e p s c s 频率的增加，这一效应 被d 受体拮抗剂p r o p r 明o l o l 阻断。 e ：给予1 0 0 “mi s o 前后m e p c s s 自发电流幅度的累积分布图。 f ：直方图显示i s o 不影响所记录锥体细胞的m e p s c s 幅度。 8 6 4 2 co一石歪u 9j等lne：u 第一部分内侧前额叶皮层d 受体参与对兴奋性突触传递的调控 i i d 受体激活对诱发兴奋性突触后电流的影响 在这一部分实验中，我们将双极刺激电极的尖端放置在所记录锥体细胞的 2 0 0 斗m 附近，将锥体细胞钳制在7 0 m v ，给予一定大小的电刺激，可记录到一个 诱发兴奋性突触后电流( e v o k e de x c i t a t o 巧p o s t s y n a p t i cc u r r e n t ，e e p s c ) 。进一步 的实验表明此电流可以被n o n - n m d a 谷氨酸受体阻断剂( c n q x ，2 0p m ) 和 n m d a 谷氨酸受体阻断剂( a p 5 ，5 0 “m ) 共同阻断，证明这些电流确实是兴奋 性突触后电流，而且它们是由突触后谷氨酸受体介导的。下面我们研究了加入 1 0 p m 或1 0 0 肚mp 受体激动剂i s o 对诱发兴奋性突触后电流的影响。 1 p 受体激活增强诱发兴奋性突触后电流的幅度 在所记录的8 例细胞中，灌流给予1 0u mi s o 均能不同程度增强所记录的 e e p s c ，图1 8 a 上图是细胞上的原始记录图。药物的易化效应通常从给予i s o 后3 分钟左右开始出现，并在药物洗除后2 0 分钟依然存在。e e p s c 幅度的均值 在给药前后分别为1 3 0 7 士1 4 5p a 和1 7 3 1 士2 1 9p a ，表明i s 0 能将e e p s c 的幅 度增大到给药前的1 3 3 0 士9 8 ( 尸 o 0 5 ；配对t 检验；图1 8 a ) 。而当肾上腺素 能p 受体的拮抗剂心得安( p r o p r a n o l o l ，p r o ，5 0 “m ) 共同存在时，这一增强效应 被阻断，证明这一效应确实是由p 受体所介导的。 用1 0 0 “mi s 0 也得到了类似的结果，在所记录的1 0 例细胞中，e e p s c 幅度 的均值在给药前后分别为8 5 3 士1 0 4p a 和1 1 2 3 士8 8p a ，表明i s o 能将e e p s c 的幅度增大到给药前的1 4 1 8 士1 3 o ( 尸 0 0 5 ；配对t 检验；图1 8 a ) 。而当肾 上腺素能p 受体的拮抗剂心得安( p r 叩r a n o l o l ，p r o ，5 0 “m ) 共同存在时，这一增 强效应被阻断， 兰二部分内侧前额叶皮层p 受体参与对兴奋性突触传递的调控 2 8 a 2 0 0 重1 5 0 c o o o 冰 i 1 口 = a e 司 2 5 0 乱 山 口 o i s o n = 5 2 0 m 1 0 0 l i m i s o n = 1 0 n = 6 一一丁一一一 喀0i s o 岬r o 临oi s o p 图1 - 8p 受体激活增强e e p s c 的幅度 上：在给予l op m 或1 0 0 “mi s 0 前后的e e p s c ，钳制电 压为7 0m v 。 下：在p r o ( 5 0p m ) 存在与否条件下，i s o 对e e p s c 的影 响。 第一部分内侧前额叶皮层p 受体参与对兴奋性突触传递的调控 2 p 受体激活增强n o n n m d a 受体介导的诱发兴奋性突触后电流的幅度 接下来，我们试图研究这一增强效应的具体作用位点。前面的实验已经表明， i s o 能增强突触前兴奋性谷氨酸递质释放，那么，i s o 对突触后的谷氨酸能受体 究竟有无影响呢? 突触后的离子型谷氨酸受体分为n o n n m d a 受体和n m d a 受体两大类，当 我们在灌流液中加入5 0 肛m 的n m d a 谷氨酸受体阻断剂a p - 5 ，并将所记录细 胞钳制在一7 0 m v ，就能阻断诱发兴奋性突触后电流中的n m d a 受体所介导的成 份，从而得到n o n - n m d a 受体介导的兴奋性突触后电流。进一步的实验显示， 该电流可以被2 0 m 的n o n - n m d a 谷氨酸受体阻断剂c n q x 完全阻断。 如图1 9 a 所示，1 0 “mi s o 显著增强n o n n m d a 受体所介导的e e p s c 的幅 度。这一现象在总共记录的5 例细胞上都得到了重复，i s o 将n o n - n m d a 受体 介导的e e p s c 平均增大2 3 1 士8 1 ( 图1 9 a ；p 0 0 5 ，配对t 检验) 。e e p s c 幅度 的均值在给药前后分别为1 2 9 0 士1 0 6p a 和1 5 6 7 土8 9p a 。 同样，1 0 0 “mi s o 显著增强n o n - n m d a 受体所介导的e e p s c 的幅度。这一 现象在总共记录的1 4 例细胞上都得到了重复，i s 0 将n o n n m d a 受体介导的 e e p s c 平均增大3 9 6 6 1 ( 图1 9 b ；尸 0 0 5 ，配对t 检验) 。e e p s c 幅度的均值 在给药前后分别 第一。部分内侧前额叶皮层p 受体参与对兴奋性突触传递的调控 3 0 4 b 图1 9p 受体激活增强n o n n m d a 受体介导的e e p s c a ：给予l o “mi s o 前后的n o n n m d a 受体介导的e e p s c ，钳制电位为一7 0m v 。 b ：给予1 0 0 “mi s o 前后的n o n n m d a 受体介导的e e p s c ，钳制电位为一7 0m v 。 接下来，我们通过观察i s o 对双脉冲易化( p a i r e d - p u l s ef a c i l i t a t i o n ，p p f ) 指 标的影响，来研究i s o 易化效应的作用位点。所谓p p f ，就是在突触前给予2 个时间间隔很短的脉冲刺激，在突触后可记录到2 个突触反应，并且第二个刺激 引起的反应比第一个大。由于p p f 主要是由突触前机制介导的，如果药物处理 引起p p f 变化，那么就可认为这种处理主要是通过突触前机制影响递质释放来 起作用的；否则就是通过突触后机制起作用。因此，p p f 通常被认为是检验突触 前或突触后机制的重要指标之一。 在我们的实验中，将连续两次刺激的间隔控制5 0m s ，可以记录到n