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人微小病毒b 1 9 一v p 2 基因真核表达质粒的构建 硕士学位申请人彭新 推荐导师赵国强武峰 郑州大学基础医学院微生物与免疫学教研室( 郑州4 5 0 0 5 2 ) 摘要 研究目的：人微小病毒b 1 9 ( h u m a np a r v o v i r u sb 1 9 ) 系微小病毒属中唯- - t i 致人 类疾病的一种病原体，可引起传染性红斑、再障危象等多种人类疾病。目前尚未 建立针对该病毒的特异性疫苗，对人微小病毒b 1 9 感染的预防和治疗是急待解决 的问题。近年来国外开始把b 1 9 的衣壳蛋白作为疫苗抗原进行研究。本课题的目 的是利用真核表达质粒p c d n a 3 1 为载体，将选择出的b 1 9 - v p 2 抗原表位丰富区 基因片段重组其中，构建出p c d n a 3 1 一v p 2 重组表达载体，并将重组质粒免疫动 物，观察其免疫效应，以探讨人微小病毒b 1 9 一v p 2 基因作为基因疫苗的可行性， 为最终建立针对该病毒的特异性实用疫苗奠定基础。 方法：从人微小病毒b 1 9 的基因序列和结构分析中可获得b 1 9 一v p 2 的氨基酸序列， 利用a n t h e w i n 和d n a s i s 软件对b 1 9 一v p 2 的表位进行分析；在此基础上设计出 b 1 9 一v p 2 靶区域引物，为了克隆方便和插入方向正确，特意在两条引物上分别加 入h i n d i i i 和b a m h i 内切酶位点；利用p c r 技术从含b 1 9 病毒d n a 序列的质粒中 扩增出v p 2 基因；将其连接在p g e m t 质粒上，转化j m l 0 9 ，运用p g e m - t 质粒的 t 7 s p 6 序列设计出引物对连接的正确性进行鉴定，利用a m p 抗性对阳性克隆进 行筛选，并进行d n a 测序，以保证克隆的目的片段的正确性；将重组质粒 p g e m - t v p 2 和p c d n a 3 1 同时用h i n di i 和b a m hi 酶切，电泳纯化后进行亚克隆， 转化细菌，再次筛选和鉴定出阳性克隆，并进行d n a 测序。大量培养、提取、纯 化p c d n a 3 卜v p 2 ，肌注家兔，动态采血，e l i s a 方法测特异性抗体。 结果： 1 表位分析：通过对v p 2 的2 9 4 5 4 1 位氨基酸序列分析，初步确定了9 个表位。 它们分别是v n s v s t k e g d s s n t t g l s t g t s s l r p g p v s q p y h h w d t i s h g q t t y g n a e d k e y o g r f p n e k e q m h t y f p n k g t q q y t d f l k i l p q s g f k l g p r k a t g r w n ) l y d p t a t d a k q h h r h g y e k 2 靶基因扩增：以含有b 1 9 病毒全基因的质粒为模板，利用p c r 扩增得到v p 2 基因中的靶基因( 4 1 6 8 4 9 6 8 ) ，共8 0 0 个碱基对。 3 克隆和亚克隆重组子结果鉴定：靶基因与p g e m - t 质粒连接后，以t 7 s p 6 作为 引物对转化后的质粒进行筛选扩增，得到9 6 0 b p 的阳性克隆，证实b 1 9 一v p 2 靶基 因成功插入p g e m - t ，即得到p g e m t v p 2 重组质粒。将重组质粒p g e m - t v p 2 和 p c d n a 3 1 同时用h i n d h l 和b a m hi 酶切后进行亚克隆，以t 7 s p 6 作为引物对转 化后的质粒进行扩增，得到9 6 6 b p 的阳性克隆。证实b 1 9 一v p 2 靶基因成功插入 p c d n a 3 1 ，即得到p c d n a 3 卜v p 2 重组质粒。 4 克隆和亚克隆重组子测序结果：对鉴定得到的克隆和亚克隆重组子 p g e m - t v p 2 和p c d n a 3 卜v p 2 进行d n a 测序，证实我们所克隆亚克隆出的v p 2 基因片段的碱基组成与公开发表的v p 2 序列完全一致，即成功构建p c d n a 3 卜v p 2 真核表达载体。 5 e l i s a 结果：实验动物的体内产生了高效价的抗b 1 9 病毒的i g g 抗体。 结论：本课题利用分子生物学软件分析出b 1 9 v p 2 抗原表位丰富区，确定了9 个抗原表位，主要集中于2 9 4 - 5 4 1 位氨基酸序列中。利用分子生物学的方法，成 功构建含b 1 9 一v p 2 基因的真核表达质粒p c d n a 3 卜v p 2 。并通过免疫接种，在动 物体内产生了较强的免疫应答。通过此项研究，为人微小病毒b 1 9 基因疫苗的研 制奠定了坚实的基础，并为进一步研究基于v p 2 的表位生物学和表位疫苗提供了 详实的数据。 关键词：人微小病毒b 1 9 ；v p 2 ：基因疫苗；真核表达 c o n s t r u c t i o no f h u m a np a r v o v i r u sb 1 9 - v p 2 g e n e i ne u c a r y o t i c e x p r e s s i o no f p l a s m i d a p p l i c a n tf o rm a s t e rd e g r e e p e n g x i n t u t o r sz h a o g u o q i a n gw u f e n g d e p a r t m e n to f m i c r o b i o l o g ya n di m m u n o l o g y , b a s i c a lm e d i c a l c o l l e g e ， z h e n z h o u u n i v e r s i t y , z h e n g z h o u 4 5 0 0 5 2c h i n a a b s t r a c t o b j e c t iv e ：h u m a np a r v o v i r u sb 1 9i s o n l yk i n do fp a t h o g e nc a u s i n gh u m a nd i s e a s e ， w h i c h m a yb r i n ga b o u ts u c hc r i t i c a ld i s e a s e sa si n f e c t i o u se r y m e m a ，a p l a s t i ca n e m i aa n ds oo n ， a n dy e tn os p e c i f i cv a c c i n ea g a i n s tt h ev i r u sh a sb e e nf o u n do u t , p r e v e n t i n ga n d t r e a t i n gt h e i n f e c t i o no fh u m a np a r v o v i r u sb 1 9i s u r g e n tp r o b l e m n e e dt ob e s o l v e d r e c e n t l y r e c o m b i n a t i o no fb 1 9c a p s i dp r o t e i na sv a c c i n ea n t i g e ni s p r o c e s s i n gi n f r e m d n e s s t h e o b j e c t i v e o ft h ep r o j e c ti s u s i n ge u k a r y o t i ce x p r e s s i o n o fp l a s m i dp c d n a 3 1a s v e c t o r , s e l e c t i n gt h eg e n ef r a g m e n to fa b u n d a n c ea n t i g e ne p i t o p ea n dr e c o m b i n a t i n gi t t o v e c t o r , c o n s t r u c t i n gp c d n a 3 1 v p 2e u c a r y o t i ce x p r e s s i o n o f v e c t o r f i n a l l y w ei n j c o t e dt h e r e c o m b i n a t i o np l a s m i dd i r e c t l yi n t oa r te x p e r i m e n t a la n i m a lt oo b s e r v ei t si l n n l u n er e a c t i o ni n o r d e rt o e x p l o r et h ef e a s i b i l i t yo fh u m a np a r v o v i r u sb 1 9 一v p 2g e n ea sg e n i ev a c c i n e t h e s u b j e c tl a y as o l i df o u n d a t i o nf o rf i n a l l y e s t a b l i s h i n gs p e c i f i cu t i l i t yv a c c i n eo f t h e v i r u s m e t h o d s ：t h eg e n es e q u e n c eo fb 1 9 一v p 2c a nb eo b t a i n e df r o mg e n es e q u e n c ea n di t s s t r u c t u r a la n a l y s i so f h u m a n p a r v o v i r u sb 1 9 t h eb 1 9 - v p 2t a r g e tg e n ep r i m e rw a sd e s i g n e d o nt h eb a s i so f a n a l y s i so f t h ee p i t o p eo f b l 9 一v p 2w i t hs o f t w a r ea n t h e w i na n dd n a s i s i no r d e rt of a c i l i t a t ec l o n i n ga n de n s u r et h ee x a c t n e s so f i n s e r td i r e c t i o n w ed e s i g n e d l y j o i n e d h i n d i i ia n db a m t - i ii n s c r i b e d e n z y m ep o i n t i n t o p r i m e r ；g e n es e q u e n c e o fv p 2w a s a m p l i t i c a t e d f r o m p l a s m i d o f d n as e q u e n c e o f b l 9v i r u s w i t h p e r m e t h o d a n d w a s l i n k e d t o p g e m tp l a s m i d ，w h i c hw a st r a n s f o r m e di n t o j m l 0 9 t h ep r i m e rd e s i g n e dw i t ht 7 s p 6 s e q u e n c eo fp g e m - tp l a s m i dw a sa p p l i e dt oi d e n t i f yt h el i n k i n gc o t t p , c t n e s s f u r t h e r m o r e ； a m pf a s t n e s sw a sa l s ou s e dt os e l e c tt h ep o s i t i v ec l o n ea n dt oi d e n t i f yt h es e q u e n c eo fd n a f o rt h ep u r p o s eo ft h ec o r r e c t n e s so fo b j e c t i v ef r a g m e n tc l o n e d a f t e rt h er e c o m b i n a t e d p l a s m i dp g e m t - v p 2a n dp c d n a 3 1t m d e r w e n te n z y m ec u t t i n gw i t hb o t hh i n d i i ia n d b a m h i ，a n dt h e nw i t he l e c t r o p h o r e t i cp u r i f i c a t i o n ，t h e yw e r el i n k e d a n dt r a n s f o r m e di n t o b a c t e r i a o n c ea g a i nt h ew o r kw a sc a r r e do u to n s e l e c t i n ga n di d c n t i 聊n gp o s i t i v ec l o n ea n d d n a s e q u e n c e f i n a l l yt h es p e c i f i ca n t i b o d yw a si d e n t i f i e dw i t he l i s a m e t h o da f t e ras e r i e s o fw o r k i n gp r o c e s s e ss u c ha sm a s sc u l t u r i n g ，e x t r a c t i n ga n d p u r i f y i n gp c d n a 3 1 v p 2a n d i n j e c t i n g i ti n t oar a b b i ti nt r a m u s c u l a r l ya n d c o l l e c t i n gi t sb l o o dd y n a m i c a l l y r e s ui t ：1 e p i t o p ea n a l y s i s ：n i n ee p i t o p e sw e r ep r i m a r i l yi d e n t i f i e dt h r o u g ha n a l y s i so n n o 2 9 4 5 4 1o fv p 2 t h e y w e r e v n s v s t k e g d s s n t t g l s t g t s s l r p g p v s q p y h h w d t i s h g q t t y g n a e d k e y q g r f p n e k e q m h t y f p n k g t q q y t d f l k i l p q s g f k l g p r k a t g r w n l y d p t a t d a k q h h r h g y e k 2 a m p l i f i c a t i o no ft a r g e tg e n e ：8 0 0b a s ep a i r sw e r ef o u n do u tb yw a yo fw h o l eg e n e p l a s m i do f b 1 9v i r u sa st e m p l a t ea n dt a r g e tg e n e ( 4 1 6 8 4 9 6 8 ) i ng e n ev p 2a n a p l i f i c a t e db y p c r 3 r e s u l to fr e c o m b i n a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fc l o n ea n ds u b c l o n e ：t h e p o s i t i v ec l o n eo f 9 6 0 b pw a so b t a i n e dt h r o u g hl i n k i n gb e t w e e nt a r g e tg e n ea n dp g e m tp l a s m i d ，a n dt h e n a m p l i f i c a t i n gt r a n s f o r m e dp l a s m i db yp r i m e rt t s p 6 t h a tp r o v e db 1 9 一v p 2t a r g e tg e n ei n s e r t p g e m ts u c c e s s f u l l y a n dw eg a i n e dr e c o m b i n e dp g e m - t - v p 2p l a s m i d t h ep o s i t i v ec l o n e 9 6 6 b p w a so b t a i n e d b y m e a n so f l i n k i n gr e c o m b i n a t e d p l a s m i d p g e m t - v p 2 a n d p c d n a 3 ，1 a f t e ru n d e r g o i n ge n z y m e c u t t i n g w i t hb o t hh i n d a n db a mh i a n d b y m e a n s o f a m p f i f i c a f i o n o f p l a s m i dt r a n s f o r m e db yp r i m e rt t s p 6 t h a tp r o v e db 1 9 一v p 2t a r g e tg e n ei n s e r tp c d n a 3 1 s u c c e s s f u l l ya n d w e g a i n e dr e e o m b i n e dp c d n a 3 1 - v p 2p l a s m i d 4 r e s u l to fs e q u e n c ea n a l y s i so fc l o n ea n ds u b c l o n e ：t 1 1 ei d e n t i f i c a t i o no fd n ai n p o s i t i v ec l o n ep g e m t - v p 2a n dp c d n a 3 1 - v p 2d e m o n s t r a t e dt h a tt h eb a s ep a i n so fo u r c l o n e do rs u b c l o n e dv p 2 g e n ef r a g m e n t sw e r ei d e n t i c a l 埘mt h ev p 2s e q u e n c ep u b l i s h e di n t h ew o r l d w ec o n s t r u c t e d e u c a r y o t i ce x p r e s s i o n o f v e c t o r p c d n a 3 1 v p 2s u c c e s s f u l l y 5 r e s u l to fe l i s a ：h i g h l yc o n c e n t r a t i o ni g ga g a i n s tb 1 9v i r u sw a sg e n e r a t e di nt h e r a b b i t c o n ciu sio n ：t h i s s u b j e c t m a k eu s eo fm o l e c u l a r b i o l o g y s o f t w a r e a n a l y z i n gt h e a b u n d a n c ea n t i g e ne p i t o p er e g i o no fb 1 9 - v p 2 ，n i n ee p i t o p e sw e r ec o n c e n t r a t e dp r i m a r i l yo n n o 2 9 4 5 4 1o f v p 2 w i t hm o l e c u l a rb i o l o g i c a lm e t h o d s ，s u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t i n ge u e a r y o t i c e x p r e s s i o np l a s m i dc o n t a i n i n gg e n eb 1 9 一v p 2 ，a n da c h i e v i n gs 订o n g e ri l n r l l u n er e a c t i o ni n t h e a n i m a lb o d yt h i se x p e r i m e n th a sl a i daf i r mf o u n d a t i o nf o re x p l o r a t i o na n dp r o d u c t i o no fg e n e v a c c i n eo f h u m a n p a r v o v i r u sb 1 9 i na d d i t i o n ，i th a sp r o v i d e dt h ed e t a i l e dd a t af o rf u r t h e rs t u d y b a s e do n e p i t o p eb i o l o g y o f v p 2a n de p i t o p ev a c c i n k e y w o r d s ：h u m a np a r v o v i r u sb 1 9 ；v p 2 ：g e n i ev a c c i n e ；e u c a r y o t i ce x p r e s s i o n 人微小病毒b 1 9 v p 2 基因真核表达质粒的构建 硕士学位申请人彭新 推荐导师赵国强武峰 郑州大学基础医学院微生物与免疫学教研室( 郑州4 5 0 0 5 2 ) 1前言 1 1 基因疫苗的研究现状基因疫苗免疫是9 0 年代初刚刚兴起的新方法，受到国内外的 广泛重视，成为当前分子生物学研究的重点和热点之一。 基因疫苗又称为dna 疫苗或核酸疫苗，是指将编码某一特定蛋白质抗原的基因片段扩 增出来，并与一载体相连接而构建的真核表达载体。它将有望成为继病原体疫苗、亚单位疫 苗之后的第三代疫苗。将基因疫苗直接接种机体后，即可在被接种者体内表达出该抗原蛋白， 从而诱导韧体产生保护性免疫应答0 4 1 。 基因疫苗与传统的蛋白质疫苗相比，理论上主要有以下几个优点睁”1 ：1 ) 基因疫苗产生的 抗原更接近自然感染状态，产生的抗体主要针对抗原决定簇的构象。重组蛋白质疫苗产生的 抗体则主要针对连续性抗原表位。2 ) 基因疫苗是杀伤性t 细胞( c t l ) 最有效的诱导剂，能够 激发机体产生强烈而持久的细胞免疫，而机体抗病毒主要依靠细胞免疫。重组的蛋白质疫苗 则主要产生体液免疫。3 ) 基因疫菌可用同一个质粒制备针对多种疾病的基因疫苗，相当于多 价疫苗；重组的蛋白质疫苗通常为单价疫苗。 1 2 人微小病毒b 1 9 的致病性及生物学性状人微小病毒b 1 9 是己知唯一使人类致 病的细小病毒，易侵犯代谢较活跃的组织细胞或器官，如骨髓、红细胞、肝脾、心肌，感染后 宿主细胞内可出现病毒包涵体。b 1 9 的嗜红细胞特性是因其能结合p 血型抗原( 即b 1 9 的细胞 受体为红系细胞膜上的糖苷酯) 所致：p 抗原不仅局限于红细胞膜上，在巨核细胞、心肌细胞 也可发现，因而导致贫血、血小板减少、心肌炎的发生“”。针对该病毒的重组蛋白质疫苗 正处于实验阶段“。 人微小病毒b 1 9 无胞膜、耐热，直径2 3 n m ，基因组为线性单链d n a 分子，约5 5 k b 。基 因组右侧编码两个结构蛋白v p i ( 8 4 k d ) 和v p 2 ( 5 8 k d ) ，两者分别占整个衣壳蛋白的4 和9 6 ， 1 除了在v p l 氨基末端有- - 2 2 7 个氨基酸的独特区外，其他结构相同。其中v p l 和v p 2 均可诱发 产生高滴度的抗体，是b 1 9 的重要保护性抗原。也是b 1 9 亚单位疫苗的首选抗原之一。”1 。 1 3 研究的目的、内容和意义为探讨v p 2 基因作为b 1 9 基因疫苗的可行性，我们将 b 1 9 一v p 2 部分基因片段克隆入真核表达载体p c d n a 3 1 中，进行了筛选和鉴定，并进一步观察 了其该基因片段的免疫效果，为进一步研究基于v p 2 的表位生物学和表位疫苗奠定了坚实的 基础。 2 实验材料 2 1 材料 2 1 1 引物：参考g e n b a n k 的n c 一0 0 0 8 8 3 基因序列设计出1 对v p 2 引物：i 对t 7 s p 6 基 因序列引物。由生工公司合成，p a g e 纯化。 表1 b 1 9 v p 2 引物 表2 t 载体克隆鉴定引物 灯载体是环状质粒，p r o m e g a 公司p g e m 系列衍生的产品。 2 1 2 普通试剂：饱和酚、氯仿、异丙醇、异戊醇、无水乙醇、冰乙酸甘油、青霉素、 卡那霉素、e d t a 2 n a 、n a o h 、c a c l 。、h c i 、n a c i 、k c i 、m g c l z 、n a h p o t 、k h z p o t 等分析纯、 化学纯、优质纯的普通试剂购自国内各大试剂公司、厂家。 2 2 1 3 主要分子生物学试剂： q i a g e n - t i p2 0m i n ip l a s m i dp u r i f yk i t 质粒小量提取试济嗡购自q i a g e n 公司。 p c r 试剂：t a qd n a 聚合酶、dn t p 、琼脂糖购于p r o m e g a 公司。 d n am a r k e r ：购于船i 和华美公司。 t 。d n a 连接酶、限制性内切酶；均购自于p r o m e g a 公司。 d n a 胶回收试剂盒s k l 3 1 ：购于上海生工。 低熔点a g a r o s e ：购于p r o m e g a 。 x - g a l ( 5 - 溴_ 4 _ 氯一3 删除b 廿半乳畦漪) 和i p i g ( 异丙基渐 b 廿半乳 瞎苷) ：购于p r o m e g a 公司。 胰蛋白胨、酵母浸出液：购自o x i o d 。 b 1 9v pi g gk i t ：购自德国i b lh a m b u r g 公司。 2 1 4 菌株 埘1 0 9 菌；购自于p r o m e g a 公司。 d h 5 。：本实验室保存。 2 1 5 质粒 p c d n a 3 1 ：购自美国i n v i t r o g e n 公司。 含b 1 9 全基因质粒：由本室保存。 2 2 主要仪器设备 超净工作台( x t 一8 7 5 ) ：苏州净化仪器设备公司 台式高速冷冻离心机：德国h e r a e u s 全自动d n a 序列测定仪( a b i 一3 1 0 ) ：美国p e 公司 高速冷冻离心机( c r 2 1 f ) ：日本日立 深低温冰箱：新飞集团 p c r 仪( p e 4 8 0 0 型) ：美国p e 公司 电泳仪( 7 2 2 型) ：上海医疗器械厂 3 电泳槽：北京科普仪器厂 恒温震荡器( z d 一8 5 ) ：常州国华有限公司 紫外透反射分析仪：上海康华 电热恒温水槽( d k 一8 0 ) ：上海康华 单盘分析天平：日本岛津 凝胶图像分析仪( g e n eg e n i u s ) ：美国s y u g e n e 超纯水系统( m i l i p o r e ) ：美国 雪花制冰机( s i m - f 1 2 4 ) ：日本三洋 超低温冰箱( 1 d d f u 4 0 8 6 5 s ) ：日本三洋 基因扩增仪( u n oi i ) ：德国b i o m e t r a 2 3 实验中配制的主要试剂 l u r i a b e r t a n i 培养基( l b 培养基) ：称取胰蛋白胨l o g 、酵母提取物5 9 、氯化钠l o g 、 加三蒸水至9 0 0 m l ，氢氧化钠调p h 值7 4 ，定容至1 0 0 0 m l ，在1 5l b f i n 2 ( 1 0 3 4 xi 0 5 p a ) 高压下蒸汽灭菌2 0 m i n ，4 保存备用。 含2 琼脂的l b 固体培养基：称取胰蛋白胨l o g 、酵母提取物5 9 ，氯化钠l o g 、加三蒸 水至9 0 0 m l ，i o n 氢氧化钠调p h 值至7 4 ，加琼脂粉2 0 9 ，定容1 0 0 0 m l ，在1 5 l b f i n 2 ( 1 0 3 4 1 0 5 p 丑) 高压下蒸汽灭菌2 0 m i n ；将上述灭菌培养液在超净台中以每板约2 0 m l 倒入经1 6 0 c 干烤4 h 的9 c m 玻璃培养皿，( 铺板前，加氨苄青霉素1 0 0 瞻m 1 ) ，每板约2 0 m l ，凝固后于4 保存。 0 ，i m o l lc a c l 2 ；称取c a c i 。h 扣加三蒸水至l o o m l ，过滤除菌，室温保存。 0 5 m o l l e d t a ( p h 8 0 ) ：称取e d t a 2 n a1 8 6 9 ，加三蒸水7 0 m l 搅拌溶解，i o n 氢氧 化钠调p h 值至8 ，0 ，定容l o o m l ，高压灭菌，室温保存。 i m i lt r i s c i ：称取t r i s 碱1 2 1 9 ，加三蒸水8 0 m l ，浓h c l 将p h 值调至7 2 ，定容 至l o o m l ，室温保存。 1 0 s d s ：称取s d s1 0 9 ，；b n - - 蒸水8 0 m l ，6 8 。c 助溶，1 nh c l 调p h 至7 2 ，定容l o o m l ， 4 室温保存。 碱裂解法提取质粒之溶液i ：5 0 m m o l l 葡萄糖，2 5 m m o l lt r i s h c l ( p h 8 o ) ，l o m o l l e d t a ( p h 8 0 ) ，高压灭菌，室温保存。 5 m o l l 乙酸钾：取乙酸钾9 8 1 4 9 ，双蒸去离子水1 6 0 m l ，搅拌溶解后，定容至2 0 0 m l 。 碱裂解法提取质粒之溶液i i ( 应用时临时配制) ：0 2 nn a o h ，i o s d s ( w v ) 。 碱裂解法提取质粒之溶液i ：取5 m o l l 乙酸钾6 0 m l ，冰乙酸11 5 m l ，双蒸水2 8 5 m l ， 4 c 保存。 t e 缓冲液( d h 8 0 ) ：l o m m o l lt r i s h e l ( p h 8 0 ) 、l m m o l le d t a ( p h 8 0 ) ，4 x 2 保存。 l o m g m l r n a s ea ：溶解r n a s ea 于l o m m o l lt r i s h c i ( p h 7 5 ) 、1 5 m m 0 1 l n a c l ，浓度 l o m g m l ，l o o 。c 力l 热1 5 m i n ，冷却至室温，分装l m l 管，一2 0 保存。 5 0 x t a e ：取t r i s 碱2 4 2 9 、冰乙酸5 7m 1 、0 5 m o l le d t a ( p h 8 0 ) l o m l ，加蒸馏水 至l o o m l ，室温保存。 l o m g m l e b ：称取e b l o o m g ，加三蒸水l o m l ，充分溶解，分装l m l 管，4 保存。 2 琼脂糖凝胶：预制备l o o m l 体积的琼脂糖凝胶，首先称取2 9 琼脂糖，加1 0 0 m ll x t a e 电泳缓冲液，加热使熔解，冷却后加入5 u1 髓至终浓度0 5 m g m 1 ，倒入备好之带梳子 的平板槽中，完全凝固后使用。 6 凝胶上样缓冲液：称取溴酚蓝0 2 5 9 、二甲苯腈蓝0 2 5 9 、蔗糖4 0 9 、加三蒸水至l o o m l ， 分装成l m l 管，于一2 0 保存备用。 7 5 乙醇：新开瓶无水乙醇7 5 m l ，加d e p c 水2 5 m l ，混匀后室温保存，用于r n a 提取。 x - g a l ( 5 - 溴- 4 - 氯- 3 - 哼i 哚一b d - 半乳糖苷) 储存液：x - g a l 溶于二甲基甲酰氨中，配 成2 0 m g m l 浓度白勺；翻既装乎潆邑由黼避，b f 5 i = 尔储存于一2 0 。c 。 i p t g ( 异丙基硫代一b d - 半乳糖苷) 溶液：将2 9i p t g 溶于8 m l 水中，用m i l i q 级纯 水调节到l o m l 。用0 2 2pm 的一次性滤器过滤除菌，分装成i m l 小份，贮存于一2 0 。c 。 3 实验方法 3 1目的基因( b i g - v p 2 ) 的克隆： 3 1 1 b 1 9 - v p 2 蛋白表位分析： 利用a n t h e w i n 和d n a s i s 软件，对b 1 9 病毒v p 2 抗原的氨基酸序列的分析，分析确定了 9 个抗原决定簇( 表位) 。 3 1 2 引物设计； b 1 9 一v p 2 基因引物设计：参照g e n b a n k 报道的序列，应用d n a s i s 、o l i g o 等软件设计针 对b 1 9 v p 2 基因4 1 6 8 位一4 9 6 8 位碱基的1 对引物：b p l 和b p 2 ，为了定向克隆，在上下游引 物上分别加进了酶切位点b a m h i 和h i n d i i i ，待扩增目的片段与d c d n a 3 1 质粒重组用。 3 1 3p c r 扩增： 扩增反应体积为3 0 l ，1 0 x 缓冲液3 儿，5 m m o l l4 x d n t p2 9 l ，上游引物b p l 和下游 引物b p 2 各1 肛1 ，p r o m e g a 公司高保真t a q 酶2 u ，含b 1 9 全基因质粒2 n ，用去离子水补足 3 0 p l ；以去离子水为模板设立阴性对照。9 4 预变性3 m i n ，9 4 变性4 0 s ，5 5 复性4 0 s ， 7 2 。c 延伸5 0 s ，扩增3 5 个循环。 3 1 4 电泳分析： 取扩增产物1 0 斗l ，用1 5 的琼脂糖凝胶电泳，e b 染色，2 5 6 n m 紫外灯下观察结果，在 8 1 6 b p 处出现条带为b 1 9v p 2 基因扩增产物，照相。 3 1 5p c r 产物b 1 9v p 2 基因的酶切鉴定： 取8 d 1 扩增产物，加入1 肛ll o x b u f f e r ，l “1 内切酶p v u i i ，混匀3 7 。c 水浴酶切1 h 。 电泳观察酶切效果。 3 1 6b 1 9v p 2 基因的电泳回收： 使用德国q i a g e n 公司b n a 胶回收试剂盒回收，低熔点琼脂糖凝胶电泳分离d n a ，3 0 0 n m 紫外光照射引导割下所要回收d n a 琼脂块，放入离心管中。按l o o m g 胶加入4 0 0 ns o l u t i o n 置于5 0 。c - 6 0 。c 水浴中l o m i n ，使胶溶化，将回收分离柱放入2 m l 收集管中，将溶化的胶移 到柱上，室温放置2 m i n ，1 0 0 0 0 r p m 离心l m i n ，弃滤出液，加入5 0 0 p 1w a s hs o l u t i o n ，室温 1 0 0 0 0 r p m 离心1m i n 洗涤两次，将柱放入一新离心管中，加e l u t i o n b u f f e r3 0 9 l 室温放置 6 2 m i n ，1 0 0 0 0 r p m 离心3 m i n 即得纯化的b 1 9v p 2 基因d n a 片段，- 2 06 c 备用。 3 1 7 回收片段加a 处理： 取回收b 1 9v p 2 基因d n a 片段1 5 ，加i 0 缓冲液2 “l ，l o m m o l ld a t p2 肛l ，t a q 酶 5 u ，混匀后7 2 水浴2 0 m i n ，4 c 备用。 3 1 8b 1 9v p 2d n a 与质粒p g e m - t 的重组连接： t 4 连接酶2 x b u f f e r1 0 u l ，p g e m t 载体2 u l ，加a 的靶d n a6 u l ( b 1 9v p 2d n a ) ， t 4 连接酶2 ul ，总体积2 0 ul ，4 c 冰箱过夜。 3 1 9 大肠杆菌感受态细胞制备： 从保存的j m l 0 9 菌种中挑取单菌落在l b 平板划线，3 7 。c 培养1 8 h ；挑取单菌落于3 m ll b 培养基上，3 7 。c 过夜振荡培养后转入5 0 m ll b 液体培养基，3 7 。c 振荡培养3 5 h ，使细胞浓度 至约1 0 8 m l ；o c 冰浴l o m i n ，4 。c 6 0 0 0 r p m 离心l o m i n ，弃上清回收细胞；l o m l 冰预冷的 0 1 m o l lc a c i2 ，重悬沉淀，冰浴2 0 m i n ；4 6 0 0 0 r p m 离心l o m i n ，弃上清，加2 m l 冰预 冷的0 1 m o l lc a c l ：重悬沉淀，分装到1 0 个离心管中，每管2 0 0 i l1 即成感受态细胞， 置4 c 保存2 4 h 内使用。 3 1 1 0 转化细菌； 2 0 0ul 感受态细菌+ 重组d n a ( 体积1 0u1 ，d n h b o o n g ) ，同时设立两种对照，即分 别将空质粒载体( p g e m - t ) ，受菌体( j m l 0 9 ) ，在同样条件下进行转化反应；轻旋混匀，冰 浴3 0 m i n ，4 2 c 水浴9 0 s ，快速冰浴2 m i n ；加8 0 0ul l b3 7 c 恒温震荡培养4 5 m i n l 取5 0 u1 涂布在铺过x - g a l 和i p t g 的a m p + 的l b 平板上，3 7 c 培养1 8 2 4 h 。 3 1 1 1 重组克隆的筛选与鉴定： 选取平板上生长的白色菌落为阳性菌落，转种于a m p + 的l b 平板，3 7 培养1 8 2 4 h ，取 少量菌苔溶于5 0ul 去离子水中，1 0 0 ( 2 水浴l o m i n 。1 0 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，取上清5 ul 用 克隆鉴定引物t 7 和s p 6 进行p c r 扩增，方法同前，扩增产物为9 5 9 b p 的即鉴定为正确重组 的p g e m - t v p 2 ，编号并保存重组细菌。 3 1 1 2d n a 序列测定： 将提取质粒用双脱氧终止法p c r 扩增：扩增产物的纯化，反应体系中加入8 0 u1 7 5 异丙醇沉淀d n a ，室温放置1 5m i n ，1 2 0 0 0 r p m 离心2 0m i n ，小心移去上清；样品开口置 9 04 ci m i n ，加入2 5u1t s r 入9 5 。c 水浴5 m i n ，冰浴5 m i n ，全部液体转入测序管；上机测 序。 3 1 1 3d n a 序列计算机分析比较： 测得序列用d n a s i s 、o m i g a 软件与g e n b a n k 中n c 一0 0 0 8 8 3 序列进行同源性比较分析。 3 2 目的基因( b 1 9 - v p 2 ) 的亚克隆 3 2 1 重组质粒p g e m - t - v p 2 的提取： 转种重组细菌p g e m - t v p 2 于l b 液体培养基( 氨苄青霉素1 0 0 ug u1 ) 3 m l 、3 7 。c 振 荡培养过夜，取菌液1 5 m l 入e p 管，5 0 0 0 r p m 离心i m i n 沉淀细菌，弃上清，加入生理盐水 洗菌，再次沉淀细菌后加入s o l u t i o ni 剧烈振荡重悬细菌，加入s o l u t i o n i i 裂解细菌，加 入s o