（动物学专业论文）uv介导的细胞dna损伤及损伤后修复的初步研究.pdf

u v 介导的细胞d n a 损伤及损伤后修复的初步研究 刘淼 摘要目的：研究不同波段紫外线( u l t r a v i o l e tr a d i a t i o n ，u v ) 对不同细胞d n a 损伤的效应，用u v c 及k 5 6 2 细胞构建了细胞d n a 损伤修复的研究模型，对u v c 介导的细胞d n a 损伤与损伤修复的机制进行初探。 方法：1 采用彗星电泳检测紫外线的不同波段与能量对细胞d n a 损伤的效应 以及不同种类细胞d n a 对u v c 损伤敏感度的差异。2 利用m t t 法、细胞计数、 彗星电泳等方法结合流式细胞仪检测细胞周期分布，并使用细胞形态学技术研究 u v c 造成的细胞d n a 损伤与细胞周期分布的关系，探讨细胞d n a 损伤后的修复 机制。 结果：1 分别用1 2 1 2 0 j m 2 的u v a ，u v b ，u v c 照射小鼠原代肝细胞、小 鼠肝癌细胞系h e p a l 6 和人白血病k 5 6 2 细胞，彗星电泳即时检测结果显示：u v a 对细胞d n a 无损伤，u v b 与u v c 能引发细胞d n a 的即时性损伤并有能量依赖 效应。u v c 造成的细胞d n a 损伤显著大于u v b 。 2 不同细胞对u v 的敏感度不同：u v b 、u v c 造成的小鼠原代肝细胞d n a 的 损伤检测阈值分别为1 0 j m 2 、3 2 j m 2 ；h e p a l 6 细胞对u v b 、u v c 的损伤检测低 限分别是3 2 j m 2 、1 2 j m 2 ；k 5 6 2 细胞的损伤检测低限分别为2 0 j m 2 ( u v b ) 、 3 2 j m 2 ( u v c ) 。u v c 照射两种人肝癌细胞系s m m c 一7 7 2 1 和h e p g 2 细胞，损伤低 限前者为1 0 8 j m 2 ，后者则大于1 6 j m 2 。 3 k 5 6 2 细胞经u v c 照射后，细胞d n a 损伤具有延时效应，实验显示3 0 j m 2 的u v c 照射后细胞d n a 损伤在2 4 h 后恢复漕胞计数与形态观察的结果显示k 5 6 2 细胞在照射后1 4 h 数目降至最低，形态学观察发现部分细胞的损伤严重。彗星电 泳检测表明d n a 损伤最大值在照射后2 4 h 达到最大值。 4 3 0 j m 2 的u v c 照射同步化的k 5 6 2 细胞彗星电泳检测结果显示：不同周期 时相的细胞对u v c 的敏感度不同，由高到低依次为g 2 m s g 1 ；u v c 照射后k 5 6 2 细胞的周期分布改变，发生g 1 s 期阻滞。k 5 6 2 细胞对u v 的敏感度具有异质性。 5 低剂量u v c 照射k 5 6 2 细胞经2 h 孵育后，彗星电泳可检测到即时检测不能 发现的损伤，表明细胞的损伤具有延时效应。 结论：u v 造成的细胞d n a 损伤与照射波段、能量密切相关：彗星电泳即时 检测发现，1 2 1 2 0 j m 2 a 段紫外线对细胞d n a 没有损伤，b 、c 段紫外线产生的 细胞d n a 损伤具有能量依赖关系，c 段紫外线对细胞d n a 的损伤能力大于b 段。 肿瘤细胞比正常细胞对u v 更为敏感；人源肿瘤细胞对u v 的敏感性与其增殖速度 正相关。u v c 对k 5 6 2 细胞的损伤具有延时效应，3 0 j m 2 u v c 照射细胞后的d n a 损伤在2 4 1 1 内消失。u v c 处理同步化k 5 6 2 细胞时发现，不同周期时相的细胞对 u v c 的敏感性有差异，g 2 m 期的细胞对u v c 最为敏感。u v c 造成的细胞d n a 损伤将使细胞周期被阻滞在g i s 期。低能量u v c 照射细胞后，使用彗星电泳延 时检测，可发现即时检测未测出的细胞d n a 损伤，这种延时损伤可能与核苷酸切 除修复机制相关。彗星电泳检测到的损伤，可能是修复过程中内切与重接步骤综 合作用的反跌。 关键词：紫外线彗星电泳k 5 6 2 细胞d n a 损伤细胞周期d n a 修复 s t u d y o nt h ed n a d a m a g ea n dr e p a i ro fc e l ll i n e si n d u c e d b yu l t r a v i o l e tr a d i a t i o n ( u v ) l i u m i a o a b s t r a c ta i m ：w es t u d i e dt h ee f f e c t so fd i f f e r e n tw a v e so fu l t r a v i o l e tr e d i a t i o n ( u v ) o nd n ad a m a g ei nd i f f e r e n tc e l l s ，a n de s t a b l i s h e dt h em o d e lo f d n ad a m a g ea n d r e p a i ro f k 5 6 2c e l li n d u c e db yu v c m e t h o d s ：1 t h ee f f e c t so fd n ad a m a g ei nd i f f e r e n tc e l l si n d u c e db yd i f f e r e n t w a v e sa n dd o s e so f u l t r a v i o l e tr a d i a t i o n 州) w e r et e s t e db yc o m e ta s s a y 2 t h ee f f e c t s o fu v co nk 5 6 2c e l lw a si n v e s t i g a t e db ym t t t e s t ，m o r p h o l o g i c a lo b s e r v a t i o n , c e l l c o u n ta n dc o m e ta s s a y t h ec e l lc y c l ed i s t r i b u t i o nw a sd e t e c t e db yt h ef l o wc y t o m e t e r ( f c m ) r e z u l t s ：1 t h em o u s eh e p a t o c y t e sp r i m a r yc u l t u r e d ，m o u s eh e p a t o m ah e p a l 一6 c e i l sa n dh u m a nl e u k e m i ak 5 6 2c e l l sw e r ei r r a d i a t e d b yu v a , u v b ，u v co f 1 2 1 2 0 j m 2 t h ed n a d a m a g eo ft h ec e l l st e s t e db yc o m e ta s s a ys h o w e dt h a tu v a c o u l d n ti n d u c ed n ad a m a g ei m m e d i a t e l y , w h i l eu v ba n du v cc o u l di n d u c ec e l l u l a r d n a d a m a g ei na d o s em a n i l _ e r ，a n du v cc o u l di n d u c ed n a d a m a g em o s ts e v e r e l y 2 t 1 1 es e n s i t i v i t i e so fd i f f e r e n tc e l l st ou vw e r ed i f f e r e n t 1 0 j m 2 u v ba n d 3 , 2 j m 勺v cc o u l di n d u c et h em o u s eh e p a t o c y t e sd n ad a m a g e ；3 2 j m 2 u v ba n d 1 2 j m 2 u v cc o u l di n d u c eh e p a l 6c e l l u l a rd n ad a m a g e ；f o rk 5 6 2c e h s ，t h el o w e s t e n e r g y sw e r ea b o u t2 0 j m z ( u v b ) a n d3 2 j m 2 ( u v c ) t h el o w e s td o s eo fu v c i n d u c e d h u m a nh e p a t o m as m m c 一7 7 2 1c e l l u l a rd n ad a m a g ew a s10 8 j m 2 ，a n da b o v e 1 6 j m z u v cc o u l di n d u c e d n a d a m a g e o f h - h e p a t o m a h e p g 2c e l l 3 a f t e ri r r a d i a t e db yu v c ，t h ed n ad a m a g eo fk 5 6 2c e u sr e p r e s e n t e dd e l a y e d e f f e c t ，a n di tc a l lb er e p a i r e dd u r i n g2 4 h c e l lc o u n ta n dm o r p h o l o g i c a lo b s e r v a t i o n s h o w e dt h a tt h en u m b e ro f k 5 6 2c e l l sd e c l i n e dl e a s ta f t e ri n c u b a t e d1 4 h a n ds o m ec e l l s d a m a g e ds e v e r e l y t h er e s u l t so fc o m e ta s s a ys h o w e dt h a tt h eh i 曲e s td a m a g ew a s a p p e a r e da f t e ri n c u b a t e d2 - 4 h 4 w h e ns y n c h r o n i z e dk 5 6 2c e l l sw e r ei r r a d i a t e db y3 0 j m 2u v c ，t h ec e i l so f g 2 mp h a s es h o w e dm u c hs e n s i t i v et h a no t h e r s t h ec e l lc y c l ed i s t r i b u t i o nw a sa l s o c h a n g e da f t e ri r r a d i a t e d c e i l sw e r ea r r e s t e di ng i s 5 k 5 6 2c e l l sw e r ei r r a d i a t e db yl o wd o s eu v c ，t h ed n a d a m a g ew a sd e t e c t e db y c o m e ta s s a ya f t e rt r e a t e d2 hb u tn o ti m m e d i a t e l y t h et h r e s h o l do fd a m a g ed e l a y l y i i i d e t e c t e db yc o m e ta s s a yw a s1 2 j m 2 c o n c l u s i o n s ：砀ec o m e ta s s a yr e s u l t ss h o w e dt h a t 嗍c o u l d n ti n d u c ed n a d a m a g ei m m e d i a t e l y ，w h i l eu v b a n du v cc o u l di n d u c ec e l l u l a rd n a d a m a g ei na d o s em a n n e r , a n du v cc o u l di n d u c ed n ad a m a g em o s ts e v e r e l y n l es e n s i t i v i t i e st o u vw e r ed i f f e r e n ti nd i f f e r e n tc e l l s t h ec a n c e rc e l l sw e r em o r es e n s i f i v i et ou v a n d t h es e n s i t i v i t yo fc e l l st ou vw a sr e l a t e dt ot h ep r o l i f e r a t i o ns p e e d d a m a g eo fc e l l i n d u c e db yu v cr e p r e s e n t e dd e l a y e de f f e c t ，a n di tc a l lb er e p a i r e dd u r i n g2 4 h k 5 6 2 c e l l sh a dh e t e r o g e n e i t yr e s p o n s i o n ，a n dc e l l si ng 2 mw e r em o r es e n s i t i v i et ou v a f t e r i r r a d i a t e db y3 0 j m zu v c t h ee e l lc y c l eo fs y n c h r o n i z e dk 5 6 2e e l lw a sa r r e s t e di n g 1 s w i l e si r r a d i a t e db yl o w e rd o s e u v c d n ad a m a g eo f k 5 5 2c e l l j u s ta p p e a r e di n ad e l a y e dm a u n e r , b u tn o ti m i l l e d i a t e l y k e y w o r d s ：u l t r a v i o l e tr a d i a t i o n ( l w ) c o m e ta s s a y ；k 5 6 2c e l l ；d n ad a m a g e ： d n a r e p a i r ；c e l lc y c l e i v 学位论文独创性声明 y 9 0 0 1 6 1 本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，论文中不包含其他个人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得陕西师范大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中 作了明确说明并表示谢意。 作者签名：刮矩 j 学位论文使用授权声明 本人同意研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属陕西师范大 学。本人保证毕业离校后，发表本论文或使用本论文成果时署名单位仍为陕西师 范大学。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其它指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校 图书馆、院系资料室被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索； 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。 作者签名：= 型1 彝日期：坦 ：7 第一章引言 自沃森和克里克发现d n a 双分子结构以来，人们已经明确了d n a 是储存与传 递遗传信息的重要生物大分子，其双螺旋结构具有良好的稳定性。d n a 分子由鸟 嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、戊糖和磷酸组成，这些碱基在d n a 分子上不 同的排序能够编码不同的生物信息，通过碱基互补配对，d n a 分子可精确地向后 代传递遗传信息，因此维护d n a 分子的完整性对生物体生命活动至关重要。 然而，在生物体和外界环境作用的过程中，一些因子会影响细胞d n a 的结构， 造成其损伤。若细胞d n a 的损伤不能更正，就可能造成遗传信息改变，影响细胞 正常功能的行使。若这一改变发生在生殖细胞，则可能影响后代的正常发育和生 理。d n a 修复( d n ar e p a i r i n g ) 是细胞对d n a 受损伤后的一种反应，这种反应可能 使损伤的d n a 分子得到恢复，重新执行其原有的功能。有时细胞不能完全消除d n a 的损伤，仅仅是增强了细胞耐受d n a 损伤的能力，使之能够继续生存。因此，细 胞损伤及损伤的不完全修复为细胞突变，癌变，畸变提供了可能；而细胞d n a 损伤的 修复能力，为生物进化过程中遗传稳定性的维持提供了保障。 1 1d n a 的损伤与损伤修复 1 1 1 细胞d n a 的损伤 造成d n a 损伤的原因有多种，主要包括自身和环境两个方面。环境因素是造 成细胞损伤的主要原因，这是指生物、化学、物理等多方面的因子对细胞d n a 造 成的影响。 生物因素主要指d n a 与r n a 病毒，它们可以插入宿主细胞的基因组d n a 中 而引起细胞突变甚至癌变。 化学因素对d n a 的损伤如芥子气、氮芥等烷化剂类( 属于生化武器) 。这类 亲电子的化合物分子能使d n a 发生碱基的烷基化、碱基脱落、断链、交联等多种 类型的损伤；亚硝酸盐类物质也可使胞嘧啶、腺嘌呤改变或鸟嘌呤脱氨等变化， 造成碱基错配，引起d n a 的损伤。 物理因素主要有电离辐射、紫外线与其他辐射因子。例如n 、p 射线和x 射线 在高能量时可引起磷酸二酯键的断裂或脱氧核糖与碱基的共价键断裂，造成碱基 脱落或d n a 链的断裂等损伤。紫外线( u l t r a v i o l e tr a d i a t i o n ，u v ) 的波长范围为 4 0 0 1 0 0 n m ，依照其对生物组织的作用分为a 、b 、c 三个谱段，即u v a ( 3 1 5 4 0 0 m m ) 、u v b ( 2 8 0 - - 3 1 5 r a m ) 和u v c ( 1 0 0 2 8 0 r a m ) 。波长越短辐射能 越大，其产生的化学和生物学效应越强。过量的紫外辐射可引起高等动植物细胞 内碱基发生c n t 的突变以及c c n t t 的突变。u v 诱导原核和真核细胞产生两种主 要的光损伤产物如环丁烷嘧啶二聚体( c y c l o b u t a n ep y r i m i d i n ed i m e r s 。c p d s ) 和6 4 光产物( 6 - 4p h o t o p r o d u c t ) p f e i f e r g p ，e ta l ，2 0 0 5 。紫外线照射可引起细胞d n a 断裂和d n a 蛋白交联以及染色体畸变，还可抑制皮肤免疫功能，使突变细胞容易 逃脱机体的免疫监视，易诱导皮肤鳞癌和基底细胞癌的发生，也可引起黑色素瘤 产生，皮肤癌主要是紫外线照射后细胞d n a 损伤与基因突变累积的结果皿i t l s p a h r j g ，e t a l ，2 0 0 3 ：n o c e n t i n is ，2 0 0 3 ；p e t e r a s t e e r e n b e r g ，e ta l ，2 0 0 6 。 1 1 2d n a 损伤的修复 无论是原核生物还是真核生物都具有应付d n a 损伤的修复机制。在修复过程 中，或者直接纠正损伤；或者先切除损伤部分形成单链缺口，然后再合成新链替 代缺口；如果损伤无法消除，细胞将产生突变或者损伤“耐受”吴曼，2 0 0 4 ，或 者发生凋亡。细胞d n a 的损伤修复主要包括直接修复、切除修复、错配修复、重 组修复以及“s o s ”修复等。 ( 1 ) 直接修复 对d n a 损伤的最简单的修复方式是通过一步反应修复，将损伤部位的序列恢 复到原状。这是比较简单的修复方式，修复过程可有光解酶、甲基鸟嘌呤甲基转 移酶、d n a 连接酶以及d n a 嘌呤插入酶等参与。 ( 2 ) 切除修复 切除修复是细胞d n a 损伤的最普遍的修复方式，这种修复方式主要针对无碱 基位点、嘧啶二聚体、碱基烷基化、单链断裂等多种d n a 损伤，普遍存在于各种 生物细胞中，也是人体细胞主要的d n a 修复机制，包括碱基切除修复和核苷酸切 除修复等，需要多种蛋白共同参与才能有效完成。其过程主要是：核酸内切酶识 别d n a 的损伤部位，并在5 端作一切口，再在外切酶的作用下沿5 端到3 端方向切 除损伤；然后在d n a 聚合酶的作用下，以损伤处相对应的互补链为模板，合成新 的d n a 单链片段以填补切除后留下的空隙；最后再在连接酶的作用下，将新合成 的单链片段与原有的单链以磷酸二酯键相联接而完成修复过程。 ( 3 ) 错配修复 错配修复负责切除d n a 复制时发生的错误配对碱基，并充填正确碱基。包括 长片段修复和短片段修复两种类型。人类细胞具有修复连续5 个以上碱基的能力， 而大肠杆菌却只能修复连续3 个碱基。 ( 4 ) 重组修复 重组修复也叫做d n a ) c y , 链断裂修复( d o u b l es t r a n db r e a kr e p a i r ) 。d n a 双链断裂 是比较常见的一种损伤，可因d n a 代谢、电离辐射和活性氧损伤等原因而产生孙 敬芬，2 0 0 2 。根据d n a 末端连接需要的同源性，可以将重组修复分为同源重组和 2 非同源末端连接，前者是低等真核细胞如酵母和细菌的修复形式，而后者则是脊 椎动物应付d n a 损伤的主要手段。 ( s ) s o s 修复 “s o s ”是国际上通用的紧急呼救信号。s o s 修复是指d n a 受到严重损伤、细胞 处于危急状态时所诱导的一种d n a 修复方式。修复时不仅原有损伤保留下来，并 且含有错误的碱基配对，故又称为错误倾向修复( e r r o r - p r o n er e p a i r ) 。修复结果是 能维持基因组的完整性，提高细胞的生存率，但留下的错误较多，使细胞有较高 的突变率。 1 2d n a 损伤的检测方法 目前d n a 损伤与损伤修复的研究方法很多。除形态学的观察、生理指标的测 量以及蛋白表达的测定外，对于较为普遍的d n a 链断裂损伤，检测方法主要有微 核实验、染色体畸变、姊妹染色体交换实验、沉降技术、单细胞凝胶电泳检测等。 ( 1 ) 微核实验 微核( m i c r on u c l e u s ，m n ) 是一种完全游离在细胞质中，结构与主核类似， 而体积小于主核l ，3 的“小核”【邢卫平等，2 0 0 2 】。它是细胞在致突变物质的影响和 作用下，因纺锤体损伤及染色体断裂后造成无着丝粒的染色体或染色单体片段， 进而在细胞分裂时未被包被于主核，滞后于胞浆中形成的。由于微核的形成会因 外界诱变因子的作用而加剧，产生的数量又与诱变因子能量的强弱成比例，因此 可以用微核出现频率来评价环境诱变因子对生物遗传物质的损伤程度。用含微核 的细胞与正常细胞相比较，对各种理化因子的遗传毒性进行检测的实验称为微核 实验。微核实验方法是一种不需要特殊试剂及设备的快速而简便的遗传环境毒理 的检测方法。但该方法的主要缺点是灵敏度较低b 酣ic ，e ta l ，1 9 9 5 1 。 ( 2 ) 姐妹染色体交换实验 姐妹染色体交换是指来自一个染色体的两条姐妹染色单体之间同源片段的互 换，这种互换是完全的、对称的。该技术的核心环节是姐妹染色单体色差显示 ( s i s t e r - c h r o m a t i dd i f f e r e n t i a t i o n ，s c d ) ，即利用5 b r d u ( 5 溴脱氧尿嘧啶核苷) 掺入d n a 来观察不同数量胸腺嘧啶核苷组成的染色体区域。由于姐妹染色体交换 的诱导因子多而复杂，故目前其只能作为d n a 受损的一般指标，而不是某种特定 疾病的表征 郑科等，2 0 0 2 】。 ( 3 ) 染色体畸交 染色体畸变是较为经典的观察指标，d n a 损伤后，染色体可出现各种异常表 现，故是至今仍被沿用的主要观察指标。但是对具体某种畸变形态能否作为损伤 指标，尚在不断筛选中。 ( 4 ) 碱性解旋法 碱性解旋法的原理是在一定p h 和温度下，d n a 分子内单链断裂处发生链分 离，在一定的时间内，残余的双链d n a 量与断裂点的数量成反比。这是通过检查 d n a 分子的完整性，来证明d n a 损伤情况的有效方法。 ( 5 ) 单细胞凝胶电泳 单细胞凝胶电泳( s i n g l ec e l lg e l e l e c t r o p h o r e s i s ，s c g e ) ，也称彗星实验( c o m e t a s s a y ) ，是在碱性解旋的基础上发展起来的在单细胞水平上进行d n a 损伤和损伤 修复的荧光检测方法，具有简单、快速、灵敏、原位等特点。琼脂糖凝胶包埋待 测细胞并经细胞裂解，而后进行碱性解旋，打开d n a 双链，随后带负电荷的d n a 断片在电场力的作用下向阳极移动，采用荧光染料染色并通过荧光显微镜观察， 损伤细胞具有一个较亮的头部和弥散的尾部，呈彗星样，彗尾的长度和荧光强度 能够显示d n a 单链断片、碱性不稳定点以及与切除修复后的d n a 单链碎片等的 数量。通过计算和分析彗星的相关参数，可检测细胞d n a 的损伤程度。 自彗星实验问世以来，该技术已广泛应用于检测真核细胞内各种d n a 损伤。 s c g e 可对基因毒物在体内和体外的效应进行评估，是评价遗传毒性损害的极为敏 感的检测手段之一，可检测每1 6 5 7 x 1 0 - 17 蚝中0 1 个d n a 链的断裂，甚至能够检 测体外经自然光照射淋巴细胞1 h 所引起的d n a 损伤，它可与3 2 p 标记检测d n a 加合物的灵敏度一致，被认为是低水平辐射( 0 0 5 g y ) 检验的快速、敏感方法 m a n c i n im a ，e ta l ，1 9 9 4 ，且s c g e 法无需同位素标记，可以对单个细胞进行分 析，适用于体内、体外不同实验、不同细胞的研究；与染色体畸变、微核、姐妹 染色体交换实验以及u d s ( 非程序d n a 合成实验) 相比，s c g e 有更高的灵敏度， 可以用于活细胞包括非增殖细胞d n a 的检测，对外周血中的t 、b 细胞亦较敏感， 也可用于死亡细胞d n a 的分析，使s c g e 不仅可以研究低能量下的生物效应，也 可用于研究高能量下的生物效应张建平等，1 9 9 7 ；宋博等，2 0 0 0 。 不仅如此，s c g e 还可提供d n a 修复能力的信息。研究者利用彗星电泳的方 法分析不同种类细胞d n a 氧化损伤及自身修复能力【马爱国等，1 9 9 7 】；检测不同 的肿瘤细胞对y 射线辐射的敏感性【薛文成等，2 0 0 2 ；探讨细胞衰老与d n a 损伤与 修复能力的关系l e m a n a a 1 b a k e r ，e t a l ，2 0 0 5 】。目前该方法已应用于新型化学药 物的遗传毒性检n q t h i e r r yg o d a r d ，e ta l ，2 0 0 2 ；e r d a lk a n ，e ta l ，2 0 0 2 1 ，环境污 染毒性检测，人类生物监视，分子流行病学以及d n a 损伤修复等研究中 a n d r e w r c o l l i n s ，2 0 0 4 ；张显忠等，2 0 0 5 。 本论文采用彗星电泳方法检测u v 照射所引发的细胞d n a 损伤及损伤后修 复。以下将紫外线诱导的细胞d n a 损伤及损伤修复的国内外研究现状作一简要介 绍。 1 3 紫外线照射导致的细胞d n a 损伤及损伤修复的研究现状 1 3 1 紫外线诱导细胞d n a 损伤的研究现状 紫外线具有多种生物学效应。紫外线与物质相互作用的主要方式是紫外光子 的能量被物质的原子或分子吸收，使物质原子或分子的电子由基态跃迁到激发态。 研究表明，有机分子中的共轭键能吸收较短波长的u v 射线，而线性重复结构或 环状结构则吸收较长波长的u v 射线。由于d n a 上的碱基以及某些氨基酸包含有 环状结构和共轭键结构，因此细胞中的d n a 和蛋白质能吸收紫外线，致使细胞内 的d n a 损伤f 任建廷等，2 0 0 4 。紫外线造成的d n a 的损伤形式主要包括嘧啶二 聚体以及不同程度的蛋白d n a 交联或单链断裂等【闵玮等，2 0 0 4 。紫外线诱导d n a 损伤的效应最终可在细胞增殖、凋亡、周期等方面体现。 1 3 1 1 损伤对细胞增殖与分化的影响 u v 对细胞生长的影响，可以表现在细胞形态、增殖能力、存活情况等方面。 1 9 5 9 年f a n 等 f a nj ，e ta l ，1 9 5 9 最早发现u v 照射后表皮郎格汉斯细胞的形 态改变，随后s e i t es s e i t es ，e ta l ，2 0 0 3 等采用不同波长的紫外线照射健康志愿 者的皮肤，结果发现在给予2 m e ( m i n i m a l e r y t h e m a l d o s e ，最小红斑量) 照射后， l c 密度及其表面标志分子数量明显下降，表现在l c 细胞体积变小，树突减少并 缩短，部分断裂，l c 与角质形成细胞之间的连接变松散等：还有研究发现，较大 能量u v b 照射可直接损伤肥大细胞的细胞膜，使大量生物活性物质释放，引起局 部血管扩张【杨敏，2 0 0 4 】。可见，u v 照射将通过抑制免疫细胞的增殖和破坏正常 的细胞形态，进而影响皮肤免疫系统。 t h o m a ss e h m i d t r o s e t h o m a ss e h m i d t r o s e ，e ta l ，1 9 9 9 的实验发现4 0 m j e r a 2 的u v - b 能够影响细胞的增殖能力，使角化细胞和成纤维细胞的细胞活力降低； u v 照射还可以抑制c o n a 诱导的脾细胞增殖反应王家骏等，2 0 0 1 ，而2 0 0 j m 2 的u v - b 几乎可以完全抑制淋巴细胞增殖 李燕华等，2 0 0 0 】。另外，u v 照射还可 以抑制细胞的克隆形成能力 p a u lc p o r t e r ，e ta l ，2 0 0 6 ，甚至导致细胞死亡李字 国等，2 0 0 4 。 1 3 1 2 损伤对细胞凋亡的影响 细胞凋亡是一种受多基因控制的程序性细胞死亡过程，是与细胞坏死完全不 同的细胞的生理性死亡形式。当细胞损伤严重、修复无望时，细胞群体以凋亡的 形式以消除严重受损的细胞，避免将错误的遗传信息传递给子细胞或发生恶性转 化 b e r t o nt r ，e ta l ，2 0 0 1 ；n o r b u r yc j ，e ta l ，2 0 0 4 ；l oh l ，e ta l ，2 0 0 5 ；谢成 英等，2 0 0 6 1 。u v 产生的d n a 损伤即可诱导细胞凋亡的发生。 冯莉 冯莉等，2 0 0 4 等人在研究紫外线诱导的h e p g 2 凋亡的分子机制时发现， 经紫外线辐射处理的h e p 2 g 2 细胞的p 5 3 、c a s p a s e 3 和b c l 2 基因表达增加，表明 紫外线辐射所致的d n a 损伤可诱导d n a 受损细胞内p 5 3 等多种细胞凋亡调控基 因表达改变，从而导致细胞凋亡。许多学者研究表明，u v 辐射造成的损伤可通过 激活f a s 途径诱导细胞凋亡 k j m u r ac ，e ta l ，1 9 9 8 ；n i s h i g a k ir ，e ta l ，1 9 9 8 ；g n i a d e c k i r - e ta l ，1 9 9 7 ；1 w a s a k ik ，e ta l ，1 9 9 7 ：s u n n i a n - k a n g ，e ta l ，2 0 0 2 1 。 1 3 1 3 损伤对细胞周期的影响 许多学者的研究发现，细胞在受到u v 照射后其细胞周期出现阻滞现象，且 阻滞的时相与细胞类型有关。1 ) u v 对不同种类细胞产生效应不同。a n n e l n t z e n a n n el l a t z e n ，e ta l ，2 0 0 4 等人用u v - c 照射s w 4 8 0 以及l o v o 细胞，结果 发现经1 5 j m 2 的u v - c 处理2 4 ，4 8 h 后，s w 4 8 0 细胞的g 1 期细胞明显减少，而 l o v o 细胞周期无显著变化。2 ) 处于不同代龄的同种细胞之间存在差异。成纤维 细胞在经u v 照射后细胞周期的改变也表现出显著差异，年轻细胞g l 期阻滞率明 显高于衰老细胞段建明等，1 9 9 9 1 。3 ) 同种细胞的野生型与突变型之间存在差异， 1 w a m o t ok 1 w a m o t ok ，e ta l ，1 9 9 9 的研究发现u v 可使照射的结肠癌细胞( w i d r ) 停止于g 1 期，并且这种效应在p 5 3 突变型和p 5 3 野生型的细胞中均有体现，而在 p 5 3 缺失的细胞中却无此现象。与之相似的是人正常的角化细胞经u v 照射后表现 g 1 期的短暂停滞，而p 5 3 突变的癌变细胞却不发生细胞周期的阻滞 o u j u l u v ac n ， e ta l ，1 9 9 4 。进一步研究发现，u v 造成的g 1 s 停滞存在依赖p 5 3 和不依赖p 5 3 的两种途径 g e y e ri l k ，e ta l ，2 0 0 0 1 。因此，u v 造成的细胞周期的变化与细胞内 信号通路中某些蛋白的表达量密切相关。 1 3 2 紫外线诱导的细胞d n a 损伤修复的研究现状 1 3 2 1 紫外线诱导的细胞d n a 损伤修复的途径及主要机制 d n a 损伤的修复是影响细胞存活和死亡的主要原因【朱应葆等，2 0 0 4 】。对细胞 损伤修复的研究最早源于细菌对紫外线光复活效应的研究f 吴曼，2 0 0 4 1 。目前研究 表明，无论是原核生物还是真核生物，u v 诱导产生的d n a 损伤主要都是通过核苷 酸切除修复( n u c l e o t i d ee x c i s i o nr e p a i r ，n e r ) 途经进行修复的 j u n - h y u kc h o i ，e t a l ，2 0 0 6 1 。n e r 机制是切除细胞内大量d n a 力n 合物以及螺旋扭曲损伤的主要路径 a d a y a b a l a ms b a l a j e e ，e ta l ，2 0 0 0 ，也是d n a 损伤修复最主要的机制之- - s a g ee ， 1 9 9 3 1 。该修复机制的缺乏可导致着色性干皮病、c o c k a y n e 综合症某些人类遗传病 的出现 e r r o lc f r i e d b e r g ，2 0 0 3 ；印木泉，2 0 0 2 1 。 n e r 机制可分为两种作用模式：能够修复全体基因组上损伤的称为全基因组 n e r ( g l o b a lg e n o m e n e r ，g g - n e r ) 、修复位于转录d n a 链上损伤的称为转录耦 联性n e r ( t r a n s c r i p t i o n - c o u p l e dn e r ，t c - n e r ) ，前者修复速度相对较慢 f r i e d b e r g e c ，2 0 0 1 ；l e o nh f m u l l e n d e r s ，e ta l ，2 0 0 1 ；h a n a w a l te c ，2 0 0 1 1 。g g n e r 修复速度依赖于损伤的类型，如6 4 光产物自基因组的去除要快于环丁烷嘧啶二聚 体，这可能与损伤传感器，c h h r 2 3 b 对不同损伤的敏感性有关。此外，损伤位置 也会影响切除修复的速度，在t c - n e r 中，损伤只有遇到延伸r n a 聚合酶n 时才能 够被识别 印木泉，2 0 0 2 】。 1 3 2 2 细胞修复d n a 损伤的能力与细胞类型的关系 关于细胞d n a 损伤修复能力的研究一直是细胞生物学的研究热点，这与细胞 癌变、衰老、遗传等机理密切相关。 ( 1 ) 正常细胞、癌变细胞对损伤修复的影响 a m yt u c k a m yt u c k ，e ta l ，2 0 0 0 l 等人用彗星电泳法比较了经不同能量u v - c 处理的慢性淋巴细胞白血病的细胞和正常淋巴细胞d n a 损伤修复情况。结果表明， 正常淋巴细胞可在照射后4 d , 时完全修复损伤，而白血病细胞在照射后4 8 , 1 , 时损伤 仍未修复完全。还有实验发现，正常的与癌变的人类胚胎肺细胞经能量为l o j m 2 的u v - c 照射后，两种细胞r n a 合成速率均显著下降，但正常细胞在照射后1 6 d x 时 r n a 转录活性得以恢复正常，而癌变细胞的r n a 合成速率在照射后2 4 4 时仍呈下 降趋势 a n n e k e - q a l a h o f f e n ，e ta l ，2 0 0 3 1 。以上实验表明，正常细胞修复u v 诱导损 伤的能力强于肿瘤细胞。 肿瘤细胞内基因表达的不同也会影响细胞对u v 照射的应答。曲建慧f 曲建慧 等，2 0 0 3 1 等人比较了野生型p 5 3 的h e p g 2 、突变型p 5 3 的p l c p r f 5 、p 5 3 全基 因缺失的h e p 3 b 三种肝癌细胞系的d n a 损伤修复能力，结果发现，接受一定能 量的紫外线照射后，野生型p 5 3 的h e p g 2 细胞与其它两种细胞相比，具有更高的 d n a 损伤修复能力以及细胞存活率。表明同一基因不同表达量的细胞之间的差异 会影响细胞对u v 损伤的应答。 ( 2 ) 细胞供体差异对损伤修复的影响 关于细胞供体对细胞损伤修复的影响，尚未有确定的研究结论。早期有研究 指出，以紫外线照射不同年龄小鼠脾淋巴细胞时，发现老年小鼠细胞的修复的能 力低于青年小鼠卓勤等，1 9 9 8 ；闫雪冬等，1 9 9 9 ；以人胚肺二倍体成纤维细胞为 对象，经紫外线( 0 4 5 j m 2 s ，5 m i n ) 诱导d n a 损伤后，结果表明，衰老( 5 5 代) 细胞形态及增殖能力的改变不如年轻细胞( 3 0 代) 显著，且衰老细胞总的修复能力 较年轻细胞明显下降p 1 3 ) ，d n a 双链将解螺旋且碱变性为单链，而单链断裂的碎片可进入凝胶，电泳时也形成拖 尾。细胞d n a 受损愈重，产生的断链或碱易变性断片就愈多。在一定范围内，“彗 星”尾部的长度( 即d n a 断片的迁移距离) 和“彗星”尾部的荧光强度( 代表d n a 的含量) 与d n a 的损伤程度相关。因此，通过测定彗星尾部的荧光强度以及d n a 的迁移距离即可定量测定单个细胞d n a 的损伤程度。 2 1 2 单细胞凝胶电泳的优点及应用 单细胞凝胶电泳方法适用于各类细胞( 待检细胞应为单细胞) ，无需放射性标 记，样品用量少，检测时间短，能够灵敏快速高效安全地检测d n a 损伤r 田云等， 2 0 0 4 。该方法的最大优点是可进行单细胞的原位检测，可以研究细胞群体内不同 细胞的反应多相性( h e t e r o g e n e i t y ) 。目前这一方法已被广泛应用于放射生物学、 遗传毒理学 m a r yn m o h a n k u m a r ，e ta l ，2 0 0 2 1 、分子流行病学 k a s s i ef ，e ta l ，2 0 0 0 ； m a h i m ab a j p a y e e ，e ta l ，2 0 0 2 、环境生物监测【杨东平等，2 0 0 3 1 等多种领域的研 究，并可为药物筛选提供技术手段 t h i e r r yg o d a r d ，e ta l ，2 0 0 2 ；e r d a lk a n ，e t a l ， 2 0 0 2 】，应用于细胞衰老、凋亡机制的研究等诸多领域【霍冠华等，2 0 0 3 】。 9 2 1 3 单细胞凝胶电泳的操作流程 经本实验室改良后的单细胞凝胶电泳的实验流程由如下步骤构成： ( 1 ) 镀膜：将清洗后的载片擦干，竖直放入o 2 常熔点琼脂糖( 6 04 c ) 溶液 中静置3 5 秒钟后取出，置于载片架上，在3 7 。c 烘箱中烤膜待用。 ( 2 ) 收集细胞：将经不同条件处理后的细胞离心收集，用p b s ( p h 7 2 ， 0 1 m o l l ) 重悬，并调整细胞密度为2 3 x 1 0 5 e e l l s m l 。 ( 3 ) 制胶：预先在载片两端使用搭桥法放置已清洗好的盖片。分别吸取8 0 1 -