（特种经济动物饲养专业论文）家蚕尿酸氧化酶基因的克隆及其原核表达研究.pdf

中文摘要 屎酸氧化酶( u r g eo x i d a s e ，u o ，e c1 7 3 ，3 ) 是生物体内嘌呤代谢的一个关键酶，可催 化尿酸形成尿囊酸。大多数的原核和真核生物都有完整的尿酸氧化酶基因，产生具生物活性 的尿酸氧化酶，以尿囊酸作为代谢最终产物。在人类和一些灵长类动物的尿酸氧化酶基因中 存在无义突变，尿酸氧化酶不具活性。它们在嘌呤降解途径中排泄尿酸作为最终产物。重组 尿隘氧化酶可作为l | i i 废治疗高屎酸症和预防肿瘤溶解症候群的有效药物。利用基因工程方法 构建高效表达载体，在适当表达系统中表达尿酸氧化酶基因，是提高尿酸氧化酶产量的首选 方法。在国外已有若干种碌酸氧化酶基因被克隆并在大肠杆菌中表达出有生物活性的蛋白 质。但在国内还未见此方面的研究。本文在家蚕尿酸氧化酶基因的克隆和高教表达方面进行 了研究。利用d n a 同源序列，p c r 方法扩增得到尿酸氧化酶基因，在原核表达系统 p e t 2 8 一a e c o l i b l 2 1 ( d e 3 ) 中进行了表达。主要包括以下内容： 1 尿酸氧化酶基因预测：研究用生物信息学方法利用果蝇的尿酸氧化酶同源序列在 家蚕基因组数据库中进行同源性检索，检索到的家蚕尿酸氧化酶序列。 2 家蚕尿酸氧化酶基因的克隆及原核表达：根据预测序列设计引物，用r t - p c r 检测 和克隆测序验证，成功地克隆到家蚕尿酸氧化酶基因的完整开放阅读框，并克隆到p e t 2 8 a 载体上，重组质粒转化表达宿主菌e s c h e r i c h i ac o l ib l 2 1 ( d e 3 ) 细胞。通过i p t g 诱导重组质 粒表达目的蛋白，经s d s p a g e 分析发现目的蛋白表达，但是通过活性测定，在粗酶液中 并没有检测到有活性的尿酸氧化酶，这可能是因大肠杆菌里表达真核生物的蛋白质，在原核 系统里，该蛋白质得不到正确的翻译后修饰，使得该蛋白质失去了本有的功能。 3 家蚕尿酸氧化酶基因的序列分析：克隆的e d n a 长为1 0 8 8 b p ，o r f 长1 0 1 4 b p ，编 码3 3 7 个氨基酸残基，预测分子量为3 8 1 8 k d ，等电点为69 0 ，基因名暂定为b m u o 。家蚕 尿酸氧化酶在氨基酸水平上与果蝇和按蚊的尿酸氧化酶的相似性分别为4 5 6 和5 1 在第 9 1 个氨基酸残基处具有a s n s e t x v a l f l l e - v a l i l e - a l a p r o t h r - a s p - s e r t h r x l y s a s n 的高度 保守序列，这一序列在真核生物和原核生物中均广泛存在，可能与尿酸氧化酶的酶活性有关。 与其他物种尿酸氧化酶的聚类分析中，家蚕与果蝇、按蚊聚为一类，说明昆虫问结构较保守。 关键词：家蚕；尿酸氧化酶；原核表达；序列分析 a b s t r a c t ur a t eo x i d a s e ( u o ) ，a ne n z y m et h a tc a t a l y z e st h eo x i d a t i o no f u r i ca c i dt oa l l a n t o i n ，p l a y sa n i m p o r t a n tr o l ei n t i l em e t a b o l i s mo fp u r i n e s m o s tp r o k m 3 o t ea n de u k a r y o t eh a v ei n t a c tu r a t e o x i d a s eg e n e ( z t o ) t h a tp r o d u c e su r a t eo x i d a s ea c t i v i t ya n de x c r e t e sa l l a n t o i na st h ee n dp r o d u c t o fp mi n em e t a b o l i s mb e c a u s eo fas i n g l en o n s e n s em u t a t i o n ，h u m a na n dc e r t a i nn o n h u m a n p r i m a t e sl a c ku r a t eo x i d a s ea n de x c r e t eu r i ca c i da st h ee n dp r o d u c tu t i l i z i n gg e n ee n g i n e e r i n g m e t h o d st oc o n s t r u c te p r e s s i o nv e c t o ro fh i g he f f i c i e n c y ，a n de x p r e s s i o no fu r i ca c i di np r o p e r e x p r e s s i o ns y s t e mw h i c hc ane l e v a t ey i e l do fu r i c a s e ，t h e r ea r es e v e r a iu r i c a s e sb e e nc l o n e da n d e x p r e s s i o no fb i o l o g ya c t i v i t yp r o t e i ni nt h eec o i lo v e r s e a s b u tt h e r ei sn or e s e a r c hi n t e r i o r l y i n t h i sp a p e rw es t u d i e do nt h eu r i c a s eo fs i l k w o r m ，w h i c hu t i l i z e dh o m o l o gd n as e q u e n c eo f d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e ra n dp c rt og e td n as e q u e n c eo fu r i c a s ei ns i l k w o r m ，a n dt h e n e x p r e s s i o ni nt h ep r o k a r y o t i ce x p r e s s i o ns y s t e m c l o n i n ga n di d e n t i f i c a t i o no ft h eu r i c a s eg e n ei n bm o r t ，h e r e i nw cp r e s e n tam o l e c u l a rc h a r a c t e r i z a t i o no f bm o r iw h i c hi n c l u d e s ： li d e n t i f i c a t i o nt h es e q u e n c eo ft h eu r i c a s eg e n ei n 且m o r i ：t h ea m i n oa c i ds e q u e n c eo f d r o s o p h i l au r i c a s ew a su s e dt os e a r c ha g a i n s tt h es i l k w o r mg e n u i n ed a t a b a s e w i t hb l a s t pj o g r a l n ，a n dw ep r e d i c t e dt h eu r i c a s eg e n eo f s i l k w o r m ，b o m b y xm o r i 2c o m n g ，a n a l y s i st h ee x p r e s s i o np a t t e r no f u r i c a s eg e n eb yr t - p c ra n du r i c a s eg e n eo f b f r o ，i e x p r e s s i o ni n , 9 2c o i lt h eg e n ew a sc l o n e da n ds e q u e n c e d ，t e r m e di t a sb m u o ，a t t dt h e f r a g m e n tw a sc l o n e di n t o t h ec u k a r y o t ee x p r e s s i o nv e c t o rp e t - 2 8 a t h er e c o m b i n a n tu r i c a s e u n d e rt h ei n d u c t i o no fi p t g a f t e rt h es d s p a g ew ef o u n dt h eu r i c a s ee x p r e s s e db u ti nour e x p e r i m e n t ，w ec a n td e t e c tt h ea c t i v i t yo ft h eu r i c a s e ，m a y b ei nt h ep r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n ，t h e p r o t e i no fe u k a r y o t e se x p r e s s e di nt h eec o l ic o u l dn o tc o r r e c tp o s t t r a n s l a t i o nm o d i f yr t - p c r a n a l y s i s f i l e e x p r e s s i o np a t t e r ni n d i c a t e dt h a tb m u ow a se x p r e s s e do n l y i nt h ef a tb o d ya n d m a l p i g h i a nt u b u l e so f t h ef i f t h i n s t a rl a r v a 3s e q u e n c ca n a l y s i so f u r i c a s ei nt h e 且m o r i ：t h eg e n ec o m p r i s e da no p e nr e a d i n gf l a m eo f 1 0 1 4b p ，w h i c hw a ss p l i ti n t of i v ep a r t sb yf o u ri n t r o n s t h ee n c o d e du r i c a s ew a s3 3 7a m i n oa c i d s w i t h 4 56 s e q u e n c ei d e n t i t yw i t ht h a to fd r o s o p h i l am e l a n o g a s t e rt h em o l e c u l a rw e i g h t d e d u c e dw a s3 81 8k d a n dt h ep r e d i c t e di s o e l e c t r i cp o i n tw a s6 9 0 t h ep u t a t i v ep r o t e i nh a st w o 1 1 1 _ i c a s ed o m a i n s ，a nu r i c a s es i g n a t u r ea n dah i g hc o n s e r v e dr e g i o nt h el a t i e rm a y b eh a v er e l a t i o n w i t ha c t i v i t yo f u r a t eo x i d a s e k e yw o r d ：b o m b y xm o r i ；u r a t eo x i d a s e ；p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n ；s e q u e n c ea n a l y s i s 独创性声明 学位论文题目：避亟垒照蔓图亟查应垒筻盈：垫基堇盈垒 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经笈表或 撰写过的研究成果，也不包含为获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者：l 锄签字日期：彳年，月拶日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘允许论文被查阅和借阅。本人授权西南 大学研究生院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 如鬲 学位论文 乍者签名：立t i 知导师签名： 牙侈 签字日期：州盼月吖目签字日期：沙名年，月z 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位：应盘叁星电话：! 望：生丝! ! 盟 通讯地址： 显审查姿生牟缉崖差强。 邮编：蚴 1 ，1 尿酸氧化酶研究进展 1 1 1 屎酸代谢与尿酸氯化酶 第一章文献综述 作为d n a 和r n a 的前体，核苷酸在所有细胞内均有重要作用，几乎参与细胞的所有生物 化学过程。核苷酸在体内可分解为核苷和磷酸，核苷在核苷酶的作用下分解为噪呤和嘧啶碱。 嘌呤可进一步分解，以代谢废物形式排出体外( 图1 1 ) 。但不同种类的生物分解嘌呤的能 r i目 $ ：一驻： 弋n 亡、h 。咚，、n 簧味畸氧化酶i 砖： 黄噍呤飒化孵l 最玲= 。一露 = 。 力是不一样的，代谢产物也各不相同【i i 。 嘿呤威的分解首先是在脱氨酶作用下水解脱去氨基，腺嘌呤水解脱氮基生产次黄嘌岭 ( h y p o x a n t h i n e ) ，鸟嘌呤水解则生成黄嘌呤( x a n t h i n e ) - 次黄嘌呤和黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶 的作用下生成尿酸( u r i ca c i d ) 【”。 不同种类生物进一步分解尿酸的能力是不一样的( 图1 2 ) 。人和猿类、鸟类、陆生爬行类 和某些昆虫以尿酸作为嘌呤代谢的终产物。人和猿类体内缺乏有功能的尿酸氧化酶，不能分 l 西南太学硕士学位论文 解尿酸，鸟类和陆生爬行类由于体内水分有限，其排氨方式是形成无毒性且不溶性的屎酸悬 浊液排出体外。 由此可以看出，尿酸氧化酶在嘌呤代谢途径中有重要作用，它催化尿酸进步分解。尿 酸在体内主要以钠盐形式存在，自由形式的尿酸及其钠盐在水中溶解度很低，如果体内嘌吟 复：) ： 一黜戮 一“一i 。0 目 五少r 夕“”“”一” - l 】。i l 甲p i f - 。，。 。矿、，6 、日。n 6 。1 1 。l i o 。g 。 0 图1 2 尿酸分解途径 f i g1 2d e g r a d a t i o no f u r i ca c i d 代谢紊乱，产生过量尿酸，或者尿酸排泄受阻，血液中尿酸浓度增高，形成高尿酸血症l ”。人 类中约有千分之三的人血液中尿酸浓度过高，使得尿酸在关节处易沉淀形成钠盐，引起关节 发炎，疼痛。如不及时治疗，可使关节遭受严重破坏 1 。对于敏感个体来说，食用富含嘌吟的 食物，如动物肝赃、鱼类、果滔( 酵母细胞) 易引起痛风，随着人们生话水平的不断提高，饮食 中富含嘌岭的成分增加，痛风的发痛率有逐渐上升的趋势p l 。 治疗痛风常用别嘌呤醇( a l l o p u r i n 0 1 ) ，这是一种次黄嗳呤的类似物，是黄嘌呤氧化酶的竞 争性抑制裁。在黄噤岭氧化酶活性被掷制后，嘌呤分解钓产物以黄嘌呤私次黄嘌呤撵出【6 。不 过，对于有肾脏炎症的痛风患者来说，直接注射尿酸氧化酶能使肾脏中的尿酸沉淀更快地被 吸收。这种注射治疗可防止和解决化学治疗痛风时引起的高屎酸紊乱嗍。 在临床上，尿和血清中尿酸浓度是诊断痛风和高尿酸疰的重要指标。尿酸氧化酶已坡广 泛用于酶法测定尿酸，酶法测定迅速、灵敏、特异性强、易于操作1 4 1 。目前，随着临床上自动 生化分析仪的普及，与分析仪配合的酶试剂盒已被临床医生接受，成为临床分析诊断的主要 2 方法。正是由于尿酸氧化酶在临床诊断和治疗上的应用价值，人们对各种生物来源的尿酸氧 化酶进行了广泛和深入的研究。 11 2 尿酸氧化酶的研究 尿酸氧化酶( u r a t eo x i d a s e ，u f i c e ，e c l 7 33 ) 是一种以分子氧作为受体的氧化酶，能够催 化尿酸氧化生成尿囊素、二氧化碳和过氧化氢。此酶在自然界广泛存在，动物、植物、真菌、 酵母和细菌中均发现有此酶的存在。s c h i t t e n h e m 首先在牛的肾脏中发现尿酸氧化酶，此后多 种来源的尿酸氧化酶陆续被发现，并对酶的物理化学性质进行了研究。 早在1 9 0 9 年b a t e l l i $ 1 s t e r n l ；p 提纯了尿酸氧化酶删，随后又有很多改进的方法呻i 。m a h l e r , h r 】研究了猪肝尿酸氧化酶的纯化和性质。此酶存在于线粒体中，可以用碱性缓冲液提取。 分子量为1 0 0 0 0 0 d a ，铜离子与酶的活性密切相关酶中含有一个铜离子结合位点，为一个富 含h i s 的区域”q 。与c u ，z n _ s o d 的铜离子结合位点( h i s - v a l h i s ) 相比尿酸氧化酶的结合位点略 有变化，第三位的h i s f l j o l u 代替。t r u s c o er i i ”研究了牛肾中尿酸氧化酶的性质，t h i o l s 试剂 ( t h i o g l y c o l l a t e ，g l u t a t h i o n e ) 可提高酶的活性，促进酶的稳定性。 在多种微生物中尿酸氧化酶的合成受培养基成分的调控。k a l t w a s s e r , h 发现当a l c a l i g e n e s e u t r o p h u s ，p s e u d o m o n a sa e r u g m o s a 和m i c r o c o c c u sd e n i t r i f i c a n s 被转移到宙有尿酸的培养基时， 尿酸氧化酶产量升高。s c h a z z o c h i o 和d a r l m g t o n 发现4 s p e r g i l l u sn i d u l a n s 尿酸氧化酶的合成是 由尿酸诱导而来。s t r e p t o m y c e sc y a n o g e n u s 培养于尿酸为唯一氮源的培养基时有大量尿酸氧 化酶诱导产生，并且建立了最佳的产酶条件和纯化条件呻】。b o n g a e r t s ，g pa 和k a l t w a s s e r ，h 报道b a c i l l u s f a s r t i d i o u s 经尿酸诱导可产生太最的尿酸氧化酶【l ”，但尿囊素和尿囊酸的存在则 可抑制尿酸氧化酶的合成f j l j 。这样。当r f a s t i d i o s u s 生长在尿酸培养基且限制氧气供应时，尿 酸氧化酶产量可太幅度提高，达细胞可溶性蛋白的5 0 。 大多数酵母可在嘌呤培养基上生长。s a c c h a r o m y c e sc e r v i s i a e , s c h i z o s a c c h a r o m y c e s 和 c a n d i d au t i l u s 均可合成尿酸氧化酶，降解喋岭“。c a n d i d au t i i u s 来源的尿酸氧化酶的纯化和 理化性质已有了深入的研究l ，此种酶由四个相同的亚基组成，凝胶过滤法测得的分子量为 1 2 0 0 0 d a ，等电点5 4 ，在4 1 0 n m 处有一吸收峰。此酶不含铜离子，重金属离子如h g ”、c n 可 使酶失活t h i o l s 试剂( t h i o g l y c o l l a t e ，g l u t a t h i o n e ) j ! u 可使失活的酶蛋白恢复活性，可见自由巯 基与酶的活性中心有关。我国学者对假丝酵母合成尿酸氧化酶的诱导和发酵条件进行了洋细 研究，并利用尿酸氧化酶配制了测定尿酸的酶试剂盒婵。l 。 在植物中，研究比较深入的是豆科植物报瘤中的n o d u l i n 一3 5 蛋白。此蛋白分子量为 3 5 0 0 0 d a ，具有尿酸氧化酶活性。豆科植物与共生固氮菌r h i z o b i u ms p 形成共生根瘤，从而有 效地固定大气中的氮气。这一过程需要宿主和r h i z o b i u ms p 的相关基因协同表达。有些豆科植 3 西南大学硕士学位论文 物以a s p 形式将同定的氮从根瘤转至植物根部。有些则是在根瘤中将固氮产物转化为酸p a ( 尿 囊素和尿囊酸) ，并主要以此种方式将固定的氮转移到根部1 2 ”。j fh a n k s 等研究t 根瘤中过氧 化质体和微小体中酞脉台成有关的酶的定位【2 5 l 。尿囊素和尿囊酸是固氮转移的主要形式”i ， 其合成主要通过嘌呤降解途径。 113 尿酸氧化酶基因的研究 随着分子生物学技术的发展，已有多个物种的尿酸氧化酶基因被壳隆。人们对这种酶分 子的结构和作用机理有了越来越深入的了解。tn g u y e n 首先报道了大豆n o d u l i n ，3 5 基因m 】，此 基冈被七个内含子隔开，e d n a 编码3 0 9 个氨基酸。n 3 5 可在e c o l i r # 表达成有括性的蛋白质。 免疫荧光实验证实，此酶位于根瘤未感染细胞的过氧化质体。n - 3 5 在游离核糖体上翻译后再 由分选信号肽转运至过氧化质体。如前所述，n o d u l i n 3 5 在植物固氮产物运输中有重要作用。 n o d u l i n - 3 5 基因在大肠杆菌中可表达，并可在细胞质中组装为有活性的四聚体1 2 ”。可见对于 n o d u l i n 3 5 来说其定位到过氧化质体并穿过膜对于蛋自的组装折叠并不是必需的。 pg o p a lr e d d y 等报道了鼠肝尿酸氧化酶c d n a 的克隆和序列分析，但此序列缺少编码n 端 1 0 个氨基酸的核菅酸序列p “。免疫杂交和免疫化学实验证实了尿酸氧化酶仅在鼠肝细胞的过氧 化质体内存在。m o t o j i m ak 和i t o m 分别克隆了鼠肝来源的尿酸氧化酶i ”】，但他们报道的 e d n a 序列有些区别。随后k e i t h a i v a r e s 等测定了完整的鼠肝e d n a 序列，它含有编码3 0 3 个氨 基酸的开放阅读框，c 端有一个s e r - a r g l e u - c o o h 的信号肽序列，可将翻译后的蛋白质转运至 过氧化质体。m o t o j i m ak 又报道了兔尿酸氧化酶e d n a 序列，并将鼠、大豆和兔的序列作了比 较，发现三者均有c 端三肽s e t a r g l y s - l e u c o o h 作为向过氧化质体转运的信号，这一序列也 是多数过氧化质体蛋白的转运信号。 c h e n gc l 等用p c r 方法扩增出猪的尿酸氧化酶e d n a ，发现与人的基因组有同源性m l 。 xw u 等对尿酸氧化酶的初级结构和进化上的意义作了研究p “。他们对来自猪、小鼠和狒狒的 尿酸氧化酶c d n a 序列徽了比较，发现在编码区序列高度保守，氨基酸的变化也是保守的同类 置换，有几个高度保守的区域存在。与猪和狒狒的尿酸氧化酶比较，小鼠的第2 0 0 位的组氨酸 缺失。另外还研究了人类的尿酸氧化酶同源e d n a 序列，它由四个外显子组成，在第3 3 和1 8 7 位处有两个无义突变( c g a a g a - - - , t g a ) ，导致编码区提前终止，这样，人类体内便没有有功 能的尿酸氧化酶，不能氧化分解尿酸，只能以尿酸作为嘌呤代谢的终产物。基因组d n a 杂交 实验发现，人类基因组d n a 与鼠肝尿酸氧化酶基因有相同的限制性片段，但在人肝中检测不 到尿酸氧化酶m r n a ，免疫杂交实验也不能检测到人肝细胞的过氧化质体中有免疫活性的尿酸 氧化酶 ”1 。 w a i i r a t h ，l l 等测定了黑腹果o l 目d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r 的尿酸氧化酶基因序列【3 6 1 ，随后n p s o u d o o b s c u r a ( 欧洲分子生物学实验室捡索号x 5 7 1 1 3 ) 和d v i r i f i s ( 欧洲分子生物学实验室检索 号，x - 5 7 11 4 ) 来源的尿酸氧化酶基因也被克隆。在果蝇中，尿酸氧化酶仅在马氏管中存在。三 者有7 2 的同源性，但表达方式并不相同m 。尿酸氧化酶及其m r n a 在三种果蝇中的表达时 期如下：2m e l a n o g a s t e r ，成虫和三龄幼虫；np s e u d o o b s c u r a ，成虫；1 2v “捃，三龄幼虫。 迄今为止已克隆了数种微生物来源的尿酸氧化酶基因。r l e g o u s 克隆了丝状真菌 a s p e r g i l l u s f l a v u s 的尿酸氧化酶基因，并在大肠杆菌中表达了该基因，得到了完全可溶的、有 生物学活性的蛋白质产物1 。表达产物可达细胞总蛋白的4 0 。此基因编码3 0 2 个氨基酸，含 有两个短的内含子，内含子内部有剪切信号( g c t a a t ) a s p e r g i l l u s f l a v u s 来源的尿酸氧化酶序 列与哺乳动物的相比有4 2 的同源性，与大豆的相比有4 1 的同源性，与果蝇的相比有4 1 - 4 2 的同源性。在所克隆的尿酸氧化酶基因中，存在两个共同的保守序列。结构域 - - ：v a l - l e u - l y s - t h r - t h r - g i n s e r ，其功能不详。a s p e r g i l l u s f l a v u s 此保守序列稍有不 同：v a l l e u l y s s e r t h r - a s n s e r ，被置换的氨基酸的化学性质并未有改变( t h r s e r g l n a s n ) 。结构域一- ：s e t - p r o - s e r - v a l g l m l y s i - i i s a s n - t h r - l e u - t y r ，此结构在丘华p 馏f f f 淞月g v 中也略 有变化，s e r _ a l a - s e t - v a l g i n a l a - t h r - m e t t y r 。d s p e r g i l l u s f l a v u s 也含有s e t - l y s l e u c o o h 转 运信号。另外a s p e r g i l t u s f l a v u s 中酶蛋白的n 端被乙酰化封闭，大肠杆菌表达的重组蛋白没有 己酰化，却依然有生物学功能。可见，乙酰化对蛋白质的活性并不是必需的，其作用可能是 与酶的稳定性有关，可以防止蛋白酶降解。 随) 舌r a a s p e r g i l l u sn i d u t a n s 的尿酸氧化酶基目亦被克隆。人们已仔细地研究了 a s p e r g i l l u s n i d u l a n s 的嘌呤代谢途径【4 04 “4 ”，其基因结构也己用突变技术进行了确认j 。a s p e r g i l l u sn i d u l a n s 尿酸氧化酶基因编码3 0 1 个氨基酸，有两个内含子。此酶与a s p e r g i l l u s f l a v u s 来源的尿酸氧化酶 有8 2 8 的同源性m i ，与其他物种来源的尿酸氧化酶也有同源性。不过其c 端的过氧化质体转 运信号肽略有不同：a l w l y s - l e u - c o o h 。在萤火虫w 塘r m e 的过氧化质体转运信号中， s e r l y s - l c u 也可以变) 自a l a - l y s l e u - c o o h 而不影响转运定位【“。 k y a m a m o t o 报道了枯草杆菌b a c i l l u s 印9 0 的尿酸氧化酶基因的克隆和在大肠杆菌中的 表达m j 。此基因编码3 3 2 个氨基酸，亚基分子量3 7 9 9 4 d a , s d s p a g e 掼4 定的来自大肠杆菌的重 组尿酸氧化酶的分子量与之相符。但b a c i s p t 9 0 来源的尿酸氧化酶的亚基分子量却是 3 4 0 0 0 d a ，这是缘于c 端1 3 个氨基酸被剪切掉了。与b a c i l l u s s p t - 9 0 来源韵酶蛋白相比重组尿 酸氧化酶的热稳定性要高1 0 度，可见c 端1 3 个氨基酸与酶的热稳定有关。与其他来源的屎酸氧 化酶基因相比，b a c i l l u s s pb 9 0 的基因缺乏铜离子结合位点( h i s - x h i s ) ，在b a c i l l u ss p t - 9 0 来 源的和e c o l ij m l 0 9 表达的重组尿酸氧化酶中均未检测到铜离子。b a c i l l u ss p t - 9 0 来源的尿酸 氧化酶也有相对于真核生物的保守序列，但同源性不高。另外，发现了一个高度保守序列： a s n s e t x v a l l l e v a l l l e a l a p r o t h r - a s p s e r t h r - x l y s - a s h 。这一序列在真核生物和原核生 物中均广泛存在，可能与尿酸氧化酶的酶活性有关f 4 j 】。 5 y k o y a m a 克隆f c a n d i d au t i l i s 的尿酸氧化酶基因，并在大肠杆菌中实现了高效表达，表 达产物为有生物活性的可溶性蛋白，可占细胞可溶性蛋白的2 0 l 。此基因无内含子，编码 3 0 3 个氨基酸，在一9 9 位有一个t a t a 盘结构( t a t a a a a ) ，但未发现有其他的调控序列。此酶 蛋白与各种物种来源的尿酸氧化酶相比，其同源性如下：a s p e r g i l l u s f l a v u s ，4 9 ：d r o s o p h i l a ， 3 7 ；s o y b e a n ，3 3 ；m a m m i a l ，3 3 ；b a c i l l u s ，2 1 。相对于真核生物的两个保守序列， c a n d i d au t i l i s 来 源的略 有 不同： v a l l e u - l y s s e r - t h r g l y s e t ： s e t - p r o s e r _ v a l g i n 。a l a t h r - m e t p h e 。此基因中含有y a m a m o t o 报道的共存于原核生物和真核 生物的高度保守序，d 即l 。另外，还有一个n 端保守序列；t y r p r l i s - g l y - l y s x x - v a l ，删除此序 列的突变体无尿酸氧化酶活性，可见这一序列对酶活性十分重要。如前所述，真核生物尿酸 氧化酶有铜离子结合位点( h i s - x h i s ) ，但在c a n d i d au t i l i s 和d s p e r g i l l u sf l a v u s 的尿酸氧化酶中 并未有铜离子，虽然有铜离子结合位点存在( h i s - a s p h i s y “t 。c a n d i d au t i l i s 来源的尿酸氧化酶 含有四个半胱氮酸残基，k o y a m a 研究了半胱氨酸巯基对酶活性的影响，发现c y s ”5 被氧化或替 代后尿酸氧化酶活性大大下降；还原剂阻巯基乙醇可抑制酶的热失活，这种作用可能是通过保 护自由形式的半胱氨酸的疏基来实现的。 114 屎酸氧化酶在临床治疗上的应用 现代医学己明确指出，痛风性关节炎是由血尿酸浓度过高，形成结晶沉积于关节所引起 的关节病变。因此，治疗痛风性关节炎不仅要控制局部的红肿和疼痛，还要降低血液中的尿 酸浓度。即使在关节炎症消退以后，患者也需长期服用降低血液尿酸浓度的药物，保证m 清 尿酸在安全的范围，以免关节炎反复发生。 现有的降尿酸药物主要有两类，即促进尿酸排泄的药物和减少尿酸产生的药物。前者常 用的是丙磺舒、苯溴马隆，后者主要有别嘌呤醇。 痛风是妖期嘌呤代谢障碍，血尿酸增高引起组织损伤的一组异质性疾病。其特点是高尿 酸血癌，特征性急性关节炎反复发作，关节滑渡中可见尿酸钠结晶，有痛风石或肾尿酸结石川。 尿酸主要由细胞代谢分解的核酸和其它嘌吟类似物及食物中的嘌呤经酶的作用分解而来。 由于人体内缺乏有功能的尿酸氧化酶尿酸不能进一步分解，作为嘌呤代谢的终产物。尿酸 的生成速度主要取决于细胞内i - 焦磷酸5 ，磷酸核糖( p r p p ) i ￥i 浓度，p r p p 合成酶，磷酸核糖焦 磷酸酞胺转移酶，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶和黄嘌呤氧化酶对尿酸的生成均有重要作 用。 对于痛风的治疗，一般使用排尿酸或抑制屎酸合成的药物，使血屎酸浓度维持在正常范 围内。排尿酸药有羧苯磺胺、苯溴酮和苯磺唑酮，通过抑制肾小管对尿酸重吸收，增加其排 泄，从而降低血尿酸浓度。抑制尿酸合成的药有别嘌岭醇，是黄嘌呤氧化酶的竞争性抑制剂 6 使得尿酸合成减少。不过，剐嘌岭醇使得黄嘌呤浓度上升。事实上，黄嘌呤比尿酸的溶解度 还要低，有些痫人会发生黄嘌呤肾损伤和沉积。因此，别嘌呤醇是有一定副作用的【4 9 】。 尿酸氧化酶可将尿酸转化为远比尿酸易溶的尿囊素，是一种很有价值的治疗痛风和高尿 酸血症的药物。 c hp u i 等进行了将屎酸氧化酶用于治疗高尿酸血症的实验i ”，发现尿酸氧 化酶比别嘌吟醇更有效地降低病人血中的尿酸浓度。m a s e r a ，g 等进行了相似的实验，得到了 相似的结果i 。 多年来，国外一直使用从黄曲霉菌中提取的屎酸氧化酶。国内也有进口。2 0 0 2 年f d a 批准了法国s a n o f i 公司研制的重组黄曲霉菌尿酸氧化酶用于青少年及儿童自血病、淋巴瘤 化疗后高尿酸血症的预防和治疗。 2 0 0 3 年，北京双鹭药业股份有限公司利用原核表达原理和技术，表达、纯化了假丝酵母 尿酸氧化酶，井用于高尿酸血症的治疗。 1 2 家蚕尿酸代谢 12 ，1 昆虫体内的尿酸代谢 在昆虫体内，尿酸作为氨代谢废物，同时具有抗氧化的功能。昆虫从外界摄取的氮化合 物在代谢、分解过程中产生氨，因为氨对动物细胞具有极强的毒性，所以必须迅速将其清除 以解毒。昆虫的解毒过程一般是：首先氨在谷氨酰胺合成酶的作用下转换成谷氨酰胺，然后 经嘌呤代谢转换成尿酸而排泄。有些昆虫体内存在有尿酸酶和尿囊素酶，可将部分尿酸再转 换戍尿囊素和尿囊索酸两排泄。尿酸难溶于水常以固体或半固体状排泄，排泄时较少损失 昆虫体内水分，这对于生活在干旱环境下的昆虫来说，尿酸是一种很好的排泄产物【5 2 l 。 尿酸作为氮的代谢物，还具有多种功能，抗氧化作用就是其中之一。也有一种观点认为， 人类、大猩猩等类人猿因为体内没有尿酸氧化酶活性所以血液中有较高的尿酸浓度t 从而利 用尿酸韵抗氧化作用。抗氧化作用对昆虫来说好像非常重要，铡如黄嘌岭脱氢酶活性缺失的 家蚕突变体在蛹期的死亡率高而且雌蛾不育 ，”。 除上述两种作用外，在昆虫中尿酸还有各种各样的作用，家蚕体内产生的尿酸，部分随 粪、尿等排泄出体外，部分蓄积在蚕体体壁中，起到防御紫外线等光氧化损害的作用 “。蓄积 在体内的尿酸具有特异的生理作用，这在其它昆虫体中也广泛存在。例如，菜青虫妒j e r i sr a p a e ) 翅内的尿酸蓄积量在雌雄间存在较大差异，雄性翅内的尿酸蓄积量远远大于雌性翅内的尿酸 蓄积量，这造成了雌雄翅吸收紫外线能力的不同，雄虫就是依靠这种差别找到雌虫来完成交 配 ；吸血昆虫长红猎蝽( r 幻d h i 埘p m f 蠡神在吸收、消化动物血液血红蛋白的过程中，大量生 7 成可产生活性氧韵氯高铁血红素，而在此同时虫体内大量合成的尿酸，起到了用于消除氯高 铁血红素产生的活性氧的作用；金风蝶( p a p i l i ox u t h u s ) 和j 七美黑风蝶( p a p i l i op o t y x e n e s ) 的 虫体壁中成带状蓄积的尿酸，使虫体外表呈黑白相间似鸟粪，起到了躲避捕食者捕杀而保护 自身的作用f ”。 122 家蚕体内的尿酸代谢 脂肪体产生的尿酸的一部分排除体外，一部分以尿酸颗粒的形式储存在真皮细胞中。正常 的家蚕因为尿酸颗粒反光而使皮肤不透明油蚕突变中有的不能生成尿酸，有的不能在表皮 积累尿酸颗粒m k 图1 3 ) 。 同其他生物一样，家蚕由嘌呤代谢产生尿酸，幼虫的黄嘌呤氧化酶活性主要在脂肪体、 马氏管、消化道中，表皮和血液中没有检测出来。油蚕皮肤透明的原因有两个：第一，因为 促进尿酸生成的黄瞟呤氧化酶酶活性缺乏；第二，生成的屎酸不能在真皮细胞内积累。到目 前为止，已经进行生理生化研究的油蚕当中，o g , f u o q 突变体是尿酸生成缺陷型，另外的十二 釉是尿酸蓄积缺陷型【”1 ， 图1 3 家蚕体内尿酸的生成与蓄积l 删 f i gl 3p r o d u c i n g a n dc u m u l a t i o n o f u r i ca c i d i n b o m b y x m o r i 用”c 标记的尿酸注射家蚕体表皮的试验发现，在正常蚕体内标记的尿酸被全部畋回。同 样的实验在油蚕中进行，尿酸生成缺陷型的油蚕能够被完全回收，而尿酸积累不全型的回收 率低或者完全不能回收，斑油蚕只有在不透明的部分被回收i 。给正常的家蚕添食蜜胺和别嘌 呤醇而使表皮变得透明，b q 嘌呤醇是黄嘌呤脱氢酶的抑制剂，能够抑制尿酸的生成而使幼虫 表皮变得透明，而蜜胺不能抑制黄嘌呤脱氢酶的活性但能阻止真皮细胞蓄积尿酸，其详细 机理还不清楚1 。 1 3p e t 原核表达系统概述 p e t 系统是在大肠杆葡中克隆和表达蓐组蛋白最强大的系统之一。根据最初f hs t u d i e r 等开发的t 7 肩动子驱动系统n o v a g e n 的p e t 系统已j j l ! | 予表达成千j 二万种不同蛋白。 1 3 ，1 撅述 p e t 系统提供6 种载体宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。 没有单一策略或条件适用予所有目标蛋臼，所以进行优化选择是必要的。 质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有t 7r n a 聚合酶基闻的宿生菌 ( x d e 3 漆原茼) 中表达目标蛋白。在x d e 3 溶原茼中，t 7 r n a 聚台酶基因由l a c u v 5 启 动子控制。未诱导列便有”定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作剧 的 蝗基凼。而宿主菌带有p l y s s 和p l y e 时调控会更严紧。p l y s 质粒编码t 7 溶菌酶， 它是7 7r n a 聚台酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。 p l y s s 宿主菌产生低量t 7 溶苗酶，而p l y s e 宿主菌产生更多酶，因此是最严紧控制的 d e 3 挤麒菌。 有1 1 种不同d e 3 溶原化宿主茁。使用最产泛的为b l 2 1 及其衍生菌株，岜的优点在于 缺失f 0 平o m p t 蛋白酶。 b 8 3 4 荫株为甲硫氨酸营养缺陷型，因此词 ： = | 3 5s 甲硫氨酸和 硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记。b l r 为r e c a 一衍生菌株，改善了质粒单体 产量，有助于稳定含有重复序列的目标质粒。两个硫氧还蛋白还原酶( t r x b ) 突变菌株 ( a d 4 9 4 ，b l 2 1t r x b ) ，有利于火肠杆菌胞浆中二硫键形成。o r i g a m i t m 和o r i g a m i b 菌株为 t r x b g o r 双突变，这两个酶是主要还原途径的关键酶。o r i g a m i 和o r i g a m i b 宿主菌的主要优 点是能形成正确折叠的食有二硫键的蛋白。新的r o s e t t a t m 菌株补充了四砖大肠杆荫稀有密 码子的t r n a 改善了由丁密码子使用频率不同而引起的一些真核蛋白低袤达。其它菌株背 景包括k 1 2 菌株h m s l 7 4 和n o v a b l u e ，象b l r 一样为r e c a 一。这些菌株可稳定表达其 产物可能导致d e 3 噬菌体丢失的某些目标基因。由于存在f 附加体编码的高亲和力k 向 阳遏蛋白，n o v a b l u e 为一个有用的严紧犁宿主菌。此外，n o v a g e n 提供了xd e 3 溶骤化 试剂盒，_ l j 予制备其它遗传背景的新表达宿丰荫。表达高毒性基因或制箭新的xd e 3 溶原茼 的另。替代方法是通过c e 6 感染提供t 7r n a 聚合酶。虽然不如用i p t g 诱导 , d e 3