（生物物理学专业论文）单一及复合污染物对水生生物抗氧化酶的影响.pdf

中文摘要 摘要 萘和镉是海洋环境中两种重要的化学污染物，对水生动植物及人类危害较大。 二者的毒性评价，对生物体造成的毒性效应和作用机理，一直是研究的热点问题。 本文主要从以下三个方面进行研究： ( 1 ) 以大型海藻孔石莼为受试生物，在实验室内考察5 0 m g l 、1 0 0 m g l 、 1 5 0 m g l 、2 0 0 m g l 四个浓度下暴露七天后，萘和镉单一和联合作用对孔石莼生长、 叶绿素含量、抗氧化酶( 超氧化物岐化酶s o d 和过氧化氢酶c a t ) 活力的影响。 ( 2 ) 以模式生物斑马鱼为受试生物，在实验室内以l c 5 0 的1 4 为暴露浓度， 连续暴露1 5 天，分析萘和镉单一和联合作用对斑马鱼s o d 和c a t 活力的影响。 ( 3 ) 将实验室连续培养的孔石莼分别暴露于大连市甘井子辖区内选定的三 种类型污染区( 工业、养殖和生活排污) 和相对洁净区的实际近岸海域内，分别 暴露1 天、3 天、7 天和1 4 天，与实验室培养的孔石莼材料进行对比研究，考察 暴露不同时间后孔石莼生长、叶绿素含量、s o d 和c a t 活力的变化，研究近海岸 复合污染对水生植物产生的生物学效应，对污染的状况进行初步评价。 实验室内实验结果表明，高浓度短时问处理，萘和镉单一及联合作用对孔石 莼的生长、叶绿素含量、s o d 和c a t 活力均有不同程度的抑制作用；萘和镉单一及 联合的亚急性处理( 1 4l c 5 0 浓度下处理1 5 天) ，对斑马鱼s o d 和c a t 活力均有 抑制作用。 孔石莼在真实复合污染环境下的实验结果表明，相对生长率和叶绿素含量在 各污染区短期( 卜3 天) 暴露处理的样品中无显著性变化，在较长时问( 7 1 4 天) 暴 露处理的样品中则表现出抑制作用。抗氧化酶的活力在各污染区短期暴露处理的 样品中表现为刺激作用，在较长时间暴露处理的样品中则表现出抑制作用。工业 污染区内的样品随时问延长相对生长率、叶绿素含量、抗氧化酶s o d 和c a t 的活 力均受较大程度的抑制，因此初步判断工业污染区的污染状况相对于生活污染区 和养殖污染区较为严重。 本论文在现有萘和镉单一毒性研究的基础上，首次对萘和镉的联合毒性进行 了初步研究，获得的实验结果可为二者的联合毒性提供基础研究数据，具有一定 的学术意义。另外，本论文将指示生物置于实际复合环境的胁迫下，应用实验室 建立的分子生物标志物方法进行分析，进而对复合环境的污染状况作出初步评价。 该方法灵敏、可行，具有一定的实践意义。 关键词：联合毒性，抗氧化酶，斑马鱼，孔石莼 英文摘要 a b s t r a c t n a p h t h a l e n ea n dc a d m i u ma r et w ok i n d so fi m p o r t a n tc h e m i c a lp o l l u t a n t si no c e a n a n da r eq u i t eh a r m f u lt ob o t hh u m a nb e i n g sa n da q u a t i cp l a n t sa n da n i m a l s s t u d i e so n t o x i c i t ya n db i o l o g i c a le f f e c tm e c h a n i s m so ft h e s et w op o l l u t a n t sa r eh o t s p o t si nr e c e n t y e a r s i nt h i sp a p e r ，t h ef o l l o w i n gs t u d i e sw e r ec a r r i e do u t ： ( 1 ) u l v a ( u l v ap e r t u s a ) w e r ee x p o s e dt of o u rc o n c e n t r a t i o n s ( 5 0 m g l 、10 0 m g l 、 15 0 m g la n d2 0 0 m g l ) o fi n d i v i d u a la n dj o i n tn a p h t h a l e n ea n dc a d m i u mf o r7d a y si n l a bc o n d i t i o n r e l a t i v eg r o w t hr a t e ，c h l o r o p h y l lc o n t e n ta n da c t i v i t i e so fa n t i o x i d a n t d e f e n s ee n z y m e ( s u p e r o x i d ed i s m u t a s ea n dc a t a l a s e ) i nu l v ae x p o s e dw e r em e a s u r e d a n dc a l c u l a t e d ，r e s p e c t i v e l y ( 2 ) z e b r a f i s h ( d a n i or e r i o ) w e r ee x p o s e dt o1 4l c 5 0c o n c e n t r a t i o no fi n d i v i d u a l a n dj o i n tn a p h t h a l e n ea n dc a d m i u mf o r15d a y si nl a bc o n d i t i o n a c t i v i t i e so f s u p e r o x i d ed i s m u t a s ea n dc a t a l a s ei nz e b r a f i s he x p o s e dw e r em e a s u r e da n dc a l c u l a t e d ， r e s p e c t i v e l y ( 3 ) l a b c u l t u r e du l v aw e r ee x p o s e dt or e a lp o l l u t i o na r e a sn e a rd a l i a ns e a s h o r ef o r 1 ，3 ，5a n d14d a y s t h r e et y p e so fp o l l u t i o n ( i n d u s t r y ，m a r i c u l t u r ea n dl i v i n g ) a r e a sa n d o n er e l a t i v ec l e a na r e aw e r ec a r e f u l l yc h o s e nf o rt h ec o m p a r i s o n sw i t hl a bc o n d i t i o n r e l a t i v eg r o w t hr a t e ，c h l o r o p h y l lc o n t e n ta n da c t i v i t i e so fs u p e r o x i d ed i s m u t a s ea n d c a t a l a s ei nu l v ae x p o s e dt oa b o v ea r e a sa td i f f e r e n tt i m ew e r em e a s u r e da n dc a l c u l a t e d ， r e s p e c t i v e l y r e s u l t sw e r ef u r t h e ru s e df o rp o l l u t i o na s s e s s m e n to ft h ec h o s e na r e a sn e a r d a l i a ns e a s h o r e i nl a bc o n d i t i o n ，v a r i e t i e so fd e c r e a s i n gw e r eo b t a i n e di ng r o w t h ，c h l o r o p h y l l c o n t e n t ，a c t i v i t i e so fs u p e r o x i d ed i s m u t a s ea n dc a t a l a s ei nu l v ae x p o s e dt oh i g h - c o n c e n t r a t i o na n ds h o r t p e r i o do fn a p h t h a l e n ea n dc a d m i u m ，b o t hi n d i v i d u a la n dj o i n t s a m et r e n d so fd e c r e a s i n go f s u p e r o x i d ed i s m u t a s ea n dc a t a l a s ea c t i v i t i e sw e r eo b t a i n e d f r o mz e b r a f i s he x p o s e dt o1 4l c s oc o n c e n t r a t i o no fi n d i v i d u a la n dj o i n tn a p h t h a l e n e a n dc a d m i u mf o r15d a y s i nr e a lp o l l u t e dc o n d i t i o n ，n os i g n i f i c a n tc h a n g ew a so b t a i n e di nr e l a t i v eg r o w t h r a t ea n dc h l o r o p h y l lc o n t e n tf r o mu l v ae x p o s e df o rs h o r tp e r i o d ( 1 - 3 d a y s ) ，w h i l e o b v i o u sd e c r e a s ew e r eo b s e r v e df r o mu l v ae x p o s e df o rr e l a t i v el o n gp e r i o d ( 7 1 4 d a y s ) a n t i o x i d a n td e f e n s ee n z y m e sa c t i v i t i e sw e r es t i m u l a t e dh i g h e ri n s h o r t - p e r i o d e x p o s u r ea n dd e c r e a s e da l o n gw i t he x p o s u r ep e r i o d r e l a t i v eg r o w t hr a t e ，c h l o r o p h y l l c o n t e n t ，a c t i v i t i e so fs u p e r o x i d ed i s m u t a s ea n dc a t a l a s ea l ls i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e di n i n d u s t r yp o l l u t i o na r e a ，w h i c hd e m o n s t r a t e dt h ei n d u s t r ya r e ai nd a l i a ns e a s h o r em a y b e w o r s e p o l l u t e dt h a nm a r i c u l t u r ea n dl i v i n ga r e a s o nt h eb a s i so fp u b l i s h e di n d i v i d u a lt o x i c i t yo fn a p h t h a l e n ea n dc a d m i u m ，j o i n t t o x i c i t yo ft h e s et w op o l l u t a n t sw a ss t u d i e df o rt h ef i r s tt i m ei n t h i sp a p e r f r o m a c a d e m i cp o i n to fv i e w ，r e s u l t so b t a i n e di nt h i sp a p e rw o u l dp r o v i d eb a s i cr e s e a r c hf o r j o i n tt o x i c i t ys t u d yo nn a p h t h a l e n ea n dc a d m i u m a d d i t i o n a l l y ，t h em e t h o de s t a b l i s hi n t h i sp a p e rf o rp o l l u t i o na s s e s s m e n tb ym o l e c u l a rb i o - i n d i c a t o ra n a l y s i so fl a b - - c u l t u r e d m a t e r i a le x p o s e dt or e a le n v i r o n m e n ti sq u i t es e n s i t i v ea n df e a s i b l e t h e r e f o r e ，t h i s e s t a b l i s h e dm e t h o dw o u l db eu s e df o rf u r t h e rs t u d yo nm u l t i p l e xp o l l u t i o no fr e a l s i t u a t i o n k e yw o r d s ：j o i n tt o x i c i t y ；a n t i o x i d a n td e f e n s ee n z y m e s ；z e b r a f i s h ( d a n i o r e r i o ) ；u l v a ( u l v ap e r t u s a ) 大连海事大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：本论文是在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，撰 写成硕士学位论文 = =望= 丛复金近染物过丞生生物埴氢丝酶的髭蛔：。 除论文中已经注明引用的内容外，对论文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本论文中不包含任何未加明确注明的其他个人或集体 已经公开发表或未公开发表的成果。本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名：盟 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解大连海事大学有关保留、使用研究生学 位论文的规定，即：大连海事大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论 文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连海事大学可以将本 学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编学位论文。同意将本学位论文收录到中囤优秀博硕上 学位论文全文数据库( 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社) 、中国学位论 文全文数据库( 中国科学技术信息研究所) 等数据库中，并以电子出版物形式 出版发行和提供信息服务。保密的论文在解密后遵守此规定。 本学位论文属于：保密口在年解密后适用本授权书。 不保密一( 请在以上方框内打“，) 论文作者签名：云汤 导师签名： 论文作者签名：钐纷 导师签名： 日期：扩7 年；旯j 日 单一及复合污染物对水生生物抗氧化酶的影响 第1 章绪论 随着人类工业活动的不断影响和海洋经济的迅猛发展，海洋生态环境不断恶 化，近岸污染同益严重，海洋正面临前所未有的巨大压力。中国更是成为近岸污 染较为严重的国家之一。要想有效地解决海洋的生态与环境问题，首先需要通过 海洋环境监测，快速准确地获取相关的海洋环境数据，并采取恰当的方法对这些 海洋环境数据进行评价，最终获得对海洋环境保护、海洋资源开发和可持续发展 具有指导意义的科学依据和决策支持。 与传统的理化检测方法相比，生物监测具有独特的优势，如在污染发生的初 期、或污染尚未对生态环境造成严重破坏前，即可进行预警预测，因此，作为一 种新兴起的环境监测方法，j 下逐渐被广泛地认识并采用。另外，污染指示生物在 细胞或分子水平上的生物标志物，作为污染物暴露和毒性效应的早期预警指标， 也受到广泛关注。其中，抗氧化酶系作为生物标志物的研究已成为国内外生态毒 理学研究的热点之一。 本文选取大连地区近岸海域两种具有代表性的污染物：萘( 石油烃类) 和镉 ( 重金属类) ，通过对指示生物海藻孔石莼和标准模式动物斑马鱼的单一和联合 毒性暴露处理，分析抗氧化防御酶系超氧化物岐化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) 和过氧化氢酶( c a t a l a s e ，c a t ) 的活力等分子生物标志物的变化；并将实验审毒性实 验建立的分子生物标志物分析方法，应用于大连近岸海域不同类型污染区的评估， 对复合污染物的分子检测和评价进行初步探索。 1 1 海洋污染物的种类及污染的评价方法 1 1 1 海洋污染物的主要类型 1 9 8 2 年联合国专家组把直接或间接由人类向大洋和河口排放的各种废物或废 热，引起对人类生存环境和健康的危害，或者危及海洋生命( 如鱼类) 的现象定义为 海洋污染。海洋污染物按照理化性质，可以分为【1 】如一1 r 几大类： ( 1 ) 石油类( 碳氢化合物) ：石油是一种复杂的混合物，包括原油和从原油 中分馏出来的溶剂油、汽油、煤油、柴油、润滑油、石蜡、沥青等等，以及经过 第1 章绪论 裂化、催化而成的各种产品。不当燃烧又会生成多环芳烃等各种烃类物质，污染 主要发生在从石油产地到炼油，一和石油消费地之间海上运输过程中的泄漏和海上 事故，大部分的海洋石油污染却来自船用内燃机燃料的不完全燃烧和油轮压舱水 的排放。溢油对于食物链中大部分海洋生物有毒。其中有些生物更易受到溢油的 危害。一次大规模的海上溢油往往引起近岸生态系的恶化，使当地的生物中毒甚 至死亡。目前种以石油为食物的细菌正在研究，用来分解、消化溢油。 ( 2 ) 重会属和类金属：重金属对于海洋环境有极大的危害，其中毒性较大的 是汞、铅、镉、铬、铜等元素。海水本身仅含有本底值很低的重金属，有些微量 金属还是生物生长必须的。但是大量重会属随着人类的工业生产、交通运输、日 常生活污水等被排放，却能造成严重的海洋污染。工厂排放的废水中含有大量的 重金属，废水随河流进入海湾，使其底质中含有大量污染物。重金属污染物通过 食物链在鱼虾贝类生物中富集，人类食用这些食品而中毒。 ( 3 ) 合成有机化合物( 含农药等) ：包括d d t ( 滴滴涕) 和p c b ( 多氯联苯) 等含 有卤素的碳氧化合物与自然界的石油等碳氢化合物不同，不能被细菌或简单的化 学反应所分解，所以一旦排放入海将在长期滞留。被生物吸收之后，在食物链中 逐渐被富集，最高级消费者最终因食物中的高浓度p c b 和d d t 而中毒死亡。 ( 4 ) 营养物质( 富营养化) ：海水中有硝酸盐、磷酸盐等营养盐，这是海洋生 物生长所必需的，一般海水中的磷酸盐常常会成为藻类生长的限制因子。当有大 量生活污水排放大海时，往往造成部分海区的富营养化，些藻类迅速生长，使 其它生物大片死亡，形成“水华”，爆发赤潮。赤潮会严重破坏生态平衡。 ( 5 ) 放射性核素：放射性核素是由核武器试验、核工业和核动力设施释放出 来的人工放射性物质，主要包括锶9 0 、铯1 3 7 等半衰期为3 0 年左右的同位素。在 较强放射性水域中，海洋生物通过体表吸附或通过食物进入消化系统，并逐渐积 累在器官中，通过食物链作用传递给人类。 ( 6 ) 固体废弃物：主要是工业和城市垃圾、船舶废弃物、工程渣土和疏浚物 等。废弃物的种类繁多，其中有部分不仅对人类有很大危险性，而且能够破坏人 类居住的生态环境。由于它们的高毒性和在环境中的长期滞留，可能带来严重的 环境i 、u j 题。 单一及复合污染物对水生生物抗氧化酶的影响 ( 7 ) 废热：工业排出的热废水造成海洋的热污染，局部海域，比原正常水温 高出4 摄氏度以上的热废水常年流入就会产生热污染，将破坏生态平衡和减少水中 溶解氧。 根据我国十五期间的调查报告显示，上述几大类海洋污染物均在我固有不同 程度的污染。国内海洋环境污染的主要原因有：1 由海岸工程、航道改扩建、海 产养殖、重工业废水和生活污水的近海岸排放等陆源污染造成的海域污染；2 由 远洋船舶压载水排放造成的外海污染物；3 由机动船只的溢油事故、废弃物不当 排放和农药化肥等对海域造成的局部污染。为了控制各类重要污染物向海洋的排 放，我国在1 9 9 2 年公布了水环境优先控制污染物的黑名单 2 | ，详见表1 。 表1 1 中国水环境优先控制污染物黑名单 t a b l e1 1b l a c kl i s t so fp r i o r i t yc o n t r o lp o l l u t a n t si nw a t e re n v i r o n m e n to fc h i n a 第1 章绪论 氰化物 重金属及化合物 氰化物 砷、铍、镉、铬、铜、铅、汞、镍、铊 作为持久性有机物污染物( p e r s i s t e n to r g a n i cp o l l u t a n t s ，p o ps ) 之一的多环芳 烃类物质( p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n ，p a h s ) ，在水体中的污染同益严重， 由二f 其极易在环境中累积并可通过食物链传递，对人类健康和生态环境具有很大 危害性。其中萘作为石化工业的八大原料之一，需要量随着石油化学工业的发展 显著增多。研究表明，萘具有三致( 致癌、致畸、致突变) 作用 3 ，美国及欧共 体环境保护机构已将萘等有机污染物列入环境优先污染物，我国也将其列为优先 控制污染物。 镉是一种对水生动植物和人体危害严重的有毒重金属微量元素，具有残留时 l 自j 长，极易在生物体内富集，可沿食物链转移蓄积，隐藏性和不可逆性等特点。 镉为最易在人体内蓄积的毒性物质，因其能诱发试验动物肺癌、前列腺癌和睾丸 肿瘤而被国际癌症研究机构( i a r c ) 归类为第一致癌物 4 | 。 对大连市当地近岸海域水体中的多环芳烃类物质进行取样分析，发现其中萘 的浓度相对较高，这弓2 0 0 8 年全国污染源普查工作中对大连地区重要排污口附近 水质结果比较一致 5 | 。另据2 0 0 7 年中国海洋环境质量公报f 7 显示，过去十年大连 近岸海域贝类体内沉积物的镉浓度一直呈上升趋势。尽管2 0 0 8 年研究表明镉浓度 未继续上升，但是仍然维持在较高的水平。 1 1 2 海洋污染的评价方法 1 1 2 1 海洋污染的理化监测和生物监测 国内外对海洋污染现有的监测手段，主要包括理化监测和生物监测两大类， 具体检测项目详见下表 8 | 。理化监测主要集中在对污染物含量的监测和分析 9 等 方面。生物监测包括的内容相对更多，水环境中进入的污染物质，作用于生物个 体、种群和群落，影响生态系统中固有生物种群的数量、物种组成及其多样性、 稳定性、生产力以及生理状况 0 j 。水污染生物监测就是利用这些变化来表征水环 境质量的变化 l | 。因此，水体污染中水生生物反应和变化可作为水环境评价常用 的良好指标【1 2 。 单一及复合污染物对水生生物抗氧化酶的影响 表1 2水环境质量监测项目的分析方法 t a b l e1 2a n a l y t i c a la p p r o a c hu s e df o rs u p e r v i s i o ni t e m so f w a t e re n v i r o n m e n t a lq u a l i t y 5 第1 章绪论 同理化监测相比，生物监测具有自己的特点： ( 1 ) 生物监测能反映各种污染物的综合影响：理化监测是定期采样，结果不 能反映采样前后情况，而水中生物汇集了整个生长期环境因素改变的情况； 单一及复合污染物对水生生物抗氧化酶的影响 ( 2 ) 生物监测具有更高的灵敏性：水生生物对污染物很敏感，在理化监测尚 不能检测到的低浓度污染物，能通过“生物放大”作用在生物体内被测出。 因此，生物监测作为理化监测的重要补充，对于环境质量的评价具有十分重 要的作用。理化监测由于只考虑瞬时的污染状况，通常在污染发生较为严重时才 会被检出，具有严重的滞后性，在污染尚未发生或尚不严重时，往往很难评估其 潜在的危害性。因此，要想准确了解污染的潜在毒性和累积效应，应采用生物监 测的方法更为合适 1 3 。 1 1 2 2 水生生物的毒理学实验 毒性试验按照受试对象的不同，可分为哺乳动物毒性试验、水生生物毒性试 验和蚯蚓毒性试验。其中，水生生物试验近年来已成为海洋污染研究的热点。 水生生物试验可以在实验室内进行某一种或几种污染物的毒理学研究，即选 取水生生态系统食物链中的代表性生物进行急性毒性实验、亚慢性毒性实验或慢 性毒性实验，获得致死剂量、半致死效应等一系列参数( 如表所示) ，用以评价 污染物的毒性强度e 1 4 。 表1 3 毒性实验种类 t a b l e1 3c a t e g o r yo f t o x i c i t yt e s t 毒性实验名称 定义实验目的 1 测试和求出化学毒物对一种或儿种试验动物的 致死量( 以l d ，o 表示) 以及其它的急性毒性参数，了 解急性毒作用强度。 2 并通过观察动物中毒表现和死亡的情况，了解急 是指机体( 人或试 性毒作用性质、可能的靶器官和致夕e 原冈，提供化 验动物) 性效应， 。 学毒物的急性中毒资料、初步评价对人体产生损害 急性毒性 包括一般行为、 的危险性。 ( a c u t et o x i c i t y l 外观改变、人 7 3 探求化学毒物急性毒性的剂簧一反应关系与中 体形态变化 毒特征。 以及死亡效应。 4 为弧慢性、慢性毒性作川试验的染毒剂量设计提 供参考依据。 5 研究化学毒物急性中毒预防和急救治疗措施。 6 为毒理学机制研究提供线索。 第1 章绪论 是指人或实验动物 弧慢性毒性 连续接触较长时 ( s u b c h r o n i ct o x i c i t y ) 间、较人剂鹫的外 源化合物所引起的 毒性效应。 是指人或实验 动物k 期( 其至终 慢性毒性 生) 反复接触低剂 ( c h r o n i ct o x i c i t y ) 鼙的化学毒物所产 生的毒性效应。 1 确定受试物哑慢性和慢性毒性的效应谱，对在急 性及弧急性毒性试验中发现的毒作用提供新的信 息，并发现在急性及急性毒性试验中未发现的毒 作用。 2 研究受试物哑慢性和慢性毒作用的靶器官。 3 研究受试物砸慢性和慢性毒性剂量一反应( 效应) 关系，确定其观察剑有害作用的最低剂量( l o a e l ) 和朱观察到有害作用的剂量( n o a e l ) ，提出此受 试物的安全限量参考值。 4 研究受试物亚慢性慢性毒性损害的可逆性。 5 慢性毒性试验为慢性毒性试验的剂量设计及观 察指标选择提供依据。 6 确定不同动物物种对受试物弧慢性和慢性毒效应 的差异，为将毒性研究结果外推剑人提供依据。 表1 4毒性试验常用参数 t a b l e1 4c o m m o np a r a m e t e r si nt o x i c i t yt e s t 毒性试验常j j 参数 8 单一及复合污染物对水生生物抗氧化酶的影响 对毒性实验，特别是评价污染物在较低浓度或较长时闻内对生物作用时，除 了考察上表所示指标，还可以考虑其他一些因素，如植物的生长速率、叶绿素含 量变化、光合作用、呼吸作用等，以及动物的行为、生长、发育和繁殖等方面的 影响。 水生生物实验还可以将实验室驯化培养的水生生态系统食物链中的代表性生 物置于实际的污染环境，通过一定时间的污染暴露处理，检测该水生生物的各项 生理指标，用以评价该实际污染环境对生物产生的生物学效应。 1 1 2 3 联合毒性概述 传统的毒理学研究和环境评价标准均依赖于单一化学品的毒性效应来实行， 对两种甚至多种化合物共同作用引起的复合污染研究则不多。近年对两种或多种 化学物质共同作用于生物体引起的具有复杂性、差异性的毒性反应i ”】，即火于联 合毒性( j o i n tt o x i c i t y ) 效应的研究j 下逐渐兴起1 1 6 】。 联合作用理论最早由b l i s s u 7 1 提出，2 0 0 2 年美国加州大学h a y e s 等用均不超标的 1 0 种化学品共同处理3 0 0 0 只蝌蚪，结果多数蝌蚪都出现了异常，从而证明了复合 污染效应的存在。 研究表明，必须同时满足以下条件才可被称为复合污染：l 、一种以上的化学 污染物同时或者先后进入同一环境介质或生态系统同一分室。2 、化学污染物之抽j 、 化学污染物与生物体之间发生交互作用3 、经历化学、物理化学过程、生理生化 过程和生物体发生中毒过程或解毒适应过程三个阶段。产生抑制、促进或毒理效 应。 随着对联合毒性研究的不断深入，p l a c k e t t 和h e w l e t t 1 s 将联合毒性的作用划分 为四种类型，即相加作用、协同作用、拮抗作用和独立作用，是目前联合毒性研 究中较为公认和普遍采用的分类方法。 表1 5联合作用的四种类型 t a b l e1 5f o u rt y p e so f j o i n tt o x i ce f f e c t s 联合作 j 分类定义 特征 相加作用几种毒物联合作 ；j 的毒性等丁其中各化学结构比较相近、或同系 ( a d d i t i o n ) 毒物单独作用的毒性总和。即混合物物、或毒作用靶器官相同、作 第1 章绪论 中一种毒物被同等比例另一毒物成分 崩机理类似的化学物同时存 所取代，混合物毒性无改变。 在时，易发生相加作片j 。 即火于相加( m o r et h a na d d i t i v e ) ，指对环境安全具有很大的威胁 联合作用的总效应人于各毒物单独作性，一些无毒或毒性很小的物 协同作用 用的毒性总和。一种物质的毒性被另 质，由于与环境中的其他物质 ( s y n e r g i s m ) 一种物质增强。 同时存在，可能产生较人的毒 性，严重影响环境质鼍。 拈抗作用即、- j - 相加( 1 e s st h a na d d i t i v e ) ，指 一种化合物抑制了另一种化 ( a n t a g o n i s m )联合作用的总效应小丁各有害化学物合物的毒性。 抑制作用 质单独作用时的毒性总和。 ( i n h i b i t i o n ) 各毒物对机体的侵入途径、作用部位、独立作用的毒性低丁相加作 独立作用 作用机理等均不相同，毒物对机体产用，但高于其中单项毒物的毒 ( i n d e p e n d e n c e ) 生的生物学效应彼此无关、互不影响，性。联合效应由最人毒性成分 无相互作用 只有在剂量很人时，有一个致死的共引起。 ( n o n i n t e r a c t i v e ) 同结局，这种联合作用称为独立作用。 近来人们对混合物的联合污染问题的认识，使化学混合物的水质标准受到关 注，相继展开复合污染对生物、环境乃至整个生态系统的联合毒性研究，联合毒 性研究目前集中在以下几个方面： ( 1 ) 不同化合物之间联合作用表征和联合效应。主要包括重金属之间的联合 作用，同系列有机物问的联合毒性，不同有机物之间的联合作用以及有机物或农 药和重会属的联合效应等的研究。其中重金属的联合作用研究较为成熟；有机物 由于作用机制相同，联合毒性往往是相加或是拮抗；不同种类的有机物由于自身 和环境的复杂性，得到的结论差别很大较为复杂；而有机物与重会属的研究相对 较少较浅，并未对致毒机理进行探讨。 ( 2 ) 不同化合物联合毒作用机理。其中研究较多的为重会属之i 、日j 的联合作用 机理。具体的联合作用效应因生物受体不同、金属类型不同而有差异，需要通过 实际判断。 单一及复合污染物对水生生物抗氧化酶的影响 ( 3 ) 在联合毒性实验受试生物的选择上，鱼类、藻类经常被用于海洋污染的 联合毒性检测。上述生物在多种污染物的单一毒性研究方面已获得大量实验数据， 可以为进一步的联合毒性研究提供有力参考。 1 2 生物标志物在海洋环境污染监测中的应用 1 2 1 海洋污染的指示生物 目前广泛使用的海洋污染指示生物如表所示，已取得相关研究结果的有藻类 【2 l 】、藤、浮游生物【2 2 1 、软体动物【2 3 】、甲壳类【2 4 】、贻贝、牡蛎【2 5 ，2 6 】等，以及各种鱼 类1 2 7 】，特别是各种海藻和鱼类1 2 8 ，如：牙鲆等。 表1 6j j - j - 水污染研究的指示生物 t a b l e1 6b i o l o g i c a li n d i c a t o r su s e di nw a t e rp o l l u t i o nr e s e a r c h 藻类 人型植物 浮游动物 水生昆虫 双壳软体动物 腹足动物 鱼类 两栖类 其他 1 2 1 1 孔石莼 孔石莼( u l v a p e r t u s a ) 是石莼属石莼目植物，典型的温带绿藻，广泛分布于 高潮带至低潮带，一年四季均有生长，具有孢子体( s p o r o p h y t e ) 和配子体 ( g a m e t o p h y t e ) 二种世代的同形多细胞藻。 孔石莼作为一种极为常见的大型海洋绿藻，经济易得，并且对外界胁迫或其 他极端环境具有极高的耐受能力，因此常被作为污染和毒理相关研究的重要指示 生物之一，并被广泛应用于对污染物颗粒的吸附作用，对养殖废水的净化作用， 以及对石油、赤潮、重金属、富营养化、排放废水等的植物修复作用。 第1 章绪论 孔石莼富含丰富的蛋白、多糖、植物凝集素、叶绿素。抗氧化酶等物质，其 中很多已作为生物标志物被广泛应用于污染监测。如2 0 0 5 年檗恒江【2 9 】等在研究u v b 辐射对孔石莼生长及其生理生化特征的影响时，将可溶性蛋白、叶绿素a 、过 氧化氢、丙二醛、超氧化物歧化酶等作为生物标志物来进行研究。此外，植物凝 集素【3 0 】其有抵抗植物病原菌和农业害虫的活性以及抗病毒活性，从海洋绿藻孔石 莼中分离到一种凝集素基因序列，在植物保护上具有广阔的应用前景。 本实验室目前培养的孔石莼为实验室驯化培养的纯系藻种。无性繁殖，无配 子体世代，是研究污染生物学效应t 3 1 1 t 常难得的好材料 1 2 1 2 斑马鱼 斑马龟( d a n i or e r i o ) 属于辐鳍亚纲c t i n o p t e r y g i i ) 鲤科( c y p r i n i d a e ) 短担尼鱼 属( d a n i o ) ，是一种小型热带淡水鱼。斑马鱼虽然是一种淡水鱼类，但由于其饲养简 单，管理方便，常年产卵，世代周期短( 一般3 - - - 4 个月就能达到性成熟) ，其胚胎透 明，在体外迅速发育，易于观察，且遗传背景清楚，与人类基因高度同源等特点，显 示了其在水体毒理学研究中的独特优势，正逐渐成为环境毒理学家们的新宠。 斑马鱼以及其胚胎和幼鱼对有害物质非常敏感，作为河水毒性实验鱼种已制 定相应的标准( i s 0 0 7 3 4 6 ) 。h a l l a r e 等( 2 0 0 5 ) 用野生型斑马鱼，检测了菲律宾l a - g u n a 湖的水质污染程度。 自上世纪未起，开始运用斑马鱼进行化学污染物如有机物和重金属等的急性 毒性研究( v i t o z z ie ta 1 ，1 9 9 1 ) 3 2 1 。斑马鱼还被用于混合化合物的急、慢性毒性检 测( e n s e n b a c h e ta 1 ，1 9 9 5 ) 【3 3 】，以及其中一种化合物相对其他化合物的生物累积效 应的研究( r i b e y r ee ta 1 ，1 9 9 5 ) 1 3 4 1 。另外，可以通过对斑马鱼整个生命周期的死亡 率、生长抑制情况、生殖毒性以及发育毒性和神经行为，对毒性环境毒物的慢性 生物学效应进行鉴定( g a h t a n e ta 1 ，2 0 0 2 ) 3 5 1 。今年有报道表明，使用转基因斑马 鱼可以更直观、更灵敏的对污染物的毒性进行动态监测( p a r n g ，2 0 0 5 ) 3 6 1 。以上研 究均表明斑马鱼在毒理学与环境检测中将会有更广泛的应用。 1 ，2 2 生物标志物 本世纪9 0 年代初，d e p l e d g e 和f o s s i t 3 7 】【3 8 1 等曾先后提出生态毒理范畴的生物 标志物概念，认为生物标志物是生物体组织或体液样品中或在个体水平上所能检 单一一及复合污染物对水生生物抗氧化酶的影响 测到的生化、细胞、生理或行为变化，这种变化可阐明生物体暴露和产生生物效 应的信息。g o k s o y r 3 9 等认为这些生物标志物系统是生物体暴露于亚致死剂量下的 有毒化合物而发生异常变化的信号指标，这种指标不仅可为环境质量退化提供早 期警报，而且可以特异性地检测到环境中致癌、致畸、致突变化合物的生物可利 用性。 环境污染物首先必须进入生物体，到达靶位点后，才可能产生生物学变化。 广义上说，从暴露到效应产生，其间的级联生物效应都可用适当的生物标志物进 行检测，这些生物反应从分子相互作用到细胞损伤及至整个生物体的毒性显现都 反映了生物系统与环境因子的相互作用，这些作用可发生在分子、细胞及个体水 平上，使生物体产生功能、生理、生化变化。如果这些生物反应先于严重的结构 损害，标志物就有助于确定生物体所处的污染状态及其潜在危害，为严重毒性伤 害提供早期警报。 环境接牲毓内卉l 。麟_ t 物放j 越制扣譬蝴l ：物掌放府结构功能改加绞i r 嚏。 l 上- l t 一一j - 一一一一j 图1 1 各种生物标志物之间的关系 f i g u r e1 1i n t e r r e l a t i o n s h i p sb e t w e e nb i o m a r k e r so fe x p o s u r ee f f e c ta n ds u s c e p t i b i l i t y 近年来，细胞或分子水平上的生物标志物，由于其具有特异性、预警性和广 泛性等特点，作为污染物暴露和毒性效应的早期预警指标受到广泛关注，并己成 为国内外生态毒理学研究的热点之一【l l - 1 4 1 。 目前较为公认的生物标志物测定方法包括酶、蛋白、激素、脂肪酸、酯、传 能物质、血液化学、骨畸形、膜稳定性及d n a 链断裂等【1 6 】。生物体的抗氧化酶系 【1 7 - 2 0 j 对污染物的胁迫相当敏感，其活性变化可为污染物胁迫下的机体氧化应激提 第1 章绪论 供敏感信息，用于指示环境污染的早期预警。另外，随着现代分子生物学的发展， 研究污染物的代谢与细胞内大分子，如蛋白质、核酸、酶的相互作用已成为可能。 1 2 3 抗氧化防御系统 1 2 3 1 活性氧自由基对生物分子的损伤 所有的需氧牛物体内均有一定的自由基( f r e er a d i c a l ) ，即独立存在的、具有 不成对电子的分子、原子、离子和基团。在体外，自由基可以通过加热( 热解或 焦解) 、电磁辐射( 光解和辐解) 和氧化还原反应等过程产生，一旦过多的自由 基进入体内或者在体内生成，而机体对自由基的防御能力又恰恰不足时，即可引 起病理生理反应。 活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ) 是生物体内最为常见和重要的自由基，因具 有促使细胞内发生氧化改变的能力而得名。随着研究的逐渐深入，人们发现确切 意义上的r o s 不仅仅包括一些自由基，还包括很多普通分子，具体见下表。 表1 7 活性氧的主要种类 t a b l e1 7m a i nt y p e so fr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s 自由基非自由基 超氧阴离子自由基( s u p e r o x i d ea n i o n ，0 2 一)过氧化氢( h y d r o g e n p e r o x i d e ，h 2 0 2 ) 羟自由基( h y d r o g e nr a d i c a l ，o h )次溴酸( h y p o b r o m o u sa c i d ，h o b r ) 氢过氧基( h y d r o p e r o x y lr a d i c a l ，h 0 2 )次氯酸( h y p o c h l o r o u sa c i d ，h o c i ) 烷氧基( a l k o x yr a d i c a l ，r o ) 臭氧( o z o n e ，0 3 ) 烷过氧基( p e r o x yr a d i c a l ，r 0 0 )单线性氧( s i n g l eo x y g e n ，1 0 2 ) 铁酰血红素蛋白、基f e r r o y l h a e m p r 。t e l n 氢过氧化物( h y d m p e r 。x i d e