（海洋生物学专业论文）中国东南沿海两种常见纺锤水蚤的分子系统学研究.pdf

摘要 刺尾纺锤水蚤( a o a r t i as p i n i c a u d ag i e s b r e c h t1 8 8 9 ) 和太平洋纺锤水蚤 ( 彳p a c i _ f i c as t e u e r1 9 1 5 ) 是我国近岸、河口区的重要浮游桡足类之一，常成 为海区的优势种。这两种纺锤水蚤的亲缘关系，过渡类型，系统分类地位，各地 理种群的遗传差异与分化等等生物学和生态学问题依然迷惑不解。本文根据纺锤 水蚤线粒体d n ac o i 基因片段和1 6 sr r n a 基因片段序列信息，分析了纺锤水蚤的 遗传多样性，遗传结构和特点，基因流模式；探讨了两种纺锤水蚤及其过渡类型 的分类地位，不同地理种群之间遗传差异以及在不同环境条件下种群分化的遗传 学证据，探讨其生存策略等有关生态适应和生态进化的问题，为纺锤水蚤的种群 补充、种群动力学研究以及地理分化提供科学依据。主要结果如下： 1 、采用苯酚一氯仿法提取基因组d n a ，以相应引物经p c r 扩增得到厦门港刺尾 纺锤水蚤( 彳s p i n i c a u d a ) 和太平洋纺锤水蚤( 彳p a c i f i c a ) 线粒体d n a 细胞 色素氧化酶i 亚基基因( m t c 0 1 ) 片段，经过连接、转化、扩大培养最后测 序得至l j 6 5 8 b p 的有效片段。共获得1 5 个m t c o i 序列( 刺尾纺锤水蚤7 个个体， 太平洋纺锤水蚤8 个个体) ，其中四条序列己上传至国际基因库( g e n b a n k ， 检索号：d q 6 6 5 2 5 1 、d q 6 6 5 2 5 2 、d q 6 6 5 2 5 3 、d q 6 6 5 2 5 4 ) 。共获得3 0 个1 6 sr r n a 序列( 刺尾纺锤水蚤1 7 个个体，太平洋纺锤水蚤1 3 个个体) 。 2 、厦门港刺尾纺锤水蚤( 爿s p i n i c a u d a ) 和太平洋纺锤水蚤( 彳p a c i f i c a ) 的 m t c o i 序列( 6 5 8 b p ) 平均差异为1 9 1 3 ，1 6 sr r n a 序列( 2 0 9 b p ) 平均差异为 2 4 9 5 。达到了种间的水平，明确了这两种纺锤水蚤的亲缘关系。这两种 纺锤水蚤在自然海区中有两种常见的过渡类型，本文利用m t c o l 序列，确定 了这两种过渡类型的分类地位，并对传统的形态学分类方法提出了改进。 3 、九龙江口和闽江口的太平洋纺锤水蚤的m t c o i 基因片段( 2 7 3 b p ) 的平均差 异为1 2 8 ，1 6 sr r n a 基因片段( 2 1 4 b p ) 的平均差异1 8 0 。基于m t c o l 序列计算其基因流值为：f s t = 0 1 3 0 6 ；n m = 1 6 6 。属于高基因流的种群。 但是结合纺锤水蚤具有休眠卵的生物学特性和福建沿岸流的季节性，推测 九龙江口和闽江口两海区的种群已有分化的趋势。 4 、珠江口外海与台湾海峡南部的太平洋纺锤水蚤1 6 sr r n a 平均遗传距离为 0 7 ，卡方检验没有显著差异( p = 0 2 1 7 3 ) ；它们与福建沿海太平洋纺锤 水蚤的1 6 sr r n a 遗传距离达至l j 3 1 6 ( p = 0 0 2 7 7 ) ，大于太平洋纺锤水蚤与 刺尾纺锤水蚤这两个种类之间的遗传距离( 2 4 9 5 ) 。根据珠江口一台湾海 峡南部种群和福建沿海种群的基因流模式f s t = 0 9 4 6 2 ，肠= 0 0 1 ，提出 珠江口一台湾海峡南部的太平洋纺锤水蚤与福建沿海的太平洋纺锤水蚤是 生殖上完全隔离的两个地理种群，珠江口一台湾海峡南部种群很可能是纺锤 水蚤属中的另外一个物种。 5 、形态学、线粒体1 6 sr r n a 序列和初步的生态学等方面的证据清楚地表明： 福建沿岸低盐水中的太平洋纺锤水蚤与日本a r i a k e 湾发现的新种 a o h t s u k a i 是一个种，并不是真正的月p a c i f i c a 。分布在中国南海北部高 盐水中的太平洋纺锤水蚤才是真正的彳p a c i f i c a 。 6 、结合g e n b a n k 数据库中纺锤水蚤属其它种类的m t c o i 和1 6 sr r n a 同源序列， 通过生物信息学方法对其进行序列分析和核酸变异比较，探讨了这些种类 的系统发生与演化关系。 关键词：中国东南沿海；太平洋纺锤水蚤；刺尾纺锤水蚤；m t c o i ；m t l 6 sr r n a ； 种群遗传学；系统发生 a b s t r a c t a c a r t i as p i n i c a u d ag i e s b r e c h t1 8 8 9a n da c a r t i ap a c i f i c as t e u e r1 9 1 5 a r et h eh i g h l y a b u n d a n t ， w i d e l y d i s t r i b u t e d ， a n dc h a r a c t e r i s t i c a l l y e s t u a r i n eh o l o p l a n k t o n i cc a l a n o i dc o p e p o di nc h i n as e a s ，t h e yh a d d e s c r i b e df r o ms e v e r a le s t u a r i e s w eh a v e1i t t l ek n o w l e d g eo nt h e s i g n i f i c a n tp r o b l e m sa sf o l l o wa st h ee v o l u t i o nr e l a t i o n s h i po ft h e s et w o a c a r t i as p e c i e s ，t a x o n o m i cs t a t u so ft h e i ri n t e r m e d i a t ef o r m s ，p o p u l a t i o n g e o d i v e r s i t y a n dd i f f e r e n t i a t i o n f o rt h i ss t u d y ，t h em o l e c u l a r p o p u l a t i o ng e n e t i cd i v e r s i t yo fas p i n i c a u d aa n da p a c i f i c aw a s d e s c r i b e db a s e do nd n as e q u e n c ev a r i a t i o nf o rm t c o lg e n ea n dm t l 6 sr r n a g e n e b a s e do nt h ea n a l y s i sa n dc a l c u l a t i o no ft h em t c o la n dm t l 6 sr r n a s e q u e n c e s ，w ew a n tt ok n o wt h eg e n e t i cd i v e r s i t y ，p o p u l a t i o ng e n e t i c s t r u c t u r e ，g e n ef l o wa m o n gf u ji a nc o a s t a lw a t e r s t h eb r i e fr e s u l t sa r e a sf o l l o w s 1 7f e m a l ei n d i v i d u a l so fa s p i n i c a u d aa n d8a p a c i f i c af e m a l e i n d i v i d u a l s m t c o ig e n ef r a g m e n ts e q u e n c e sw e r eo b t a i n e d t h el e n g t h o ft h es e q u e n c ei s6 5 8b p w es u b m i t e d4s e q u e n c e st ot h eg e n b a n k ( a s s e s s i n gn u m b e r ：d q 6 6 5 2 5 1 ，d q 6 6 5 2 5 2 ，d q 6 6 5 2 5 3 ，d q 6 6 5 2 5 4 ) w ea l s o o b t a i n e d3 0m t l 6 sr r n as e q u e n c e so ft h e s et w oa c a r t i as p e c i e s ( 1 7 i n d i v i d u a l so fa s p i n i c a u 如1 3i n d i v i d u a l so fa p a c i f i c a ) 2 t h ea v e r a g eg e n e t i cd i s t a n c eo fa s p i n i c a u d aa n da ，p a c i f i c ab a s e d o nt h em t c o i ( 6 5 8 b p ) a n dm t l 6 sr r n a ( 2 0 9 b p ) i s1 9 1 3 a n d2 4 9 5 ， r e s p e c t i v e l y i tw o u l db ec o n c l u d e dt h a tt h e ya r ed i f f e r e n ts p e c i e s f o rac e r t a i n t y w ea ls of o u n dt w ok i n d so fi n t e r m e d i a t ef o r m sb e t w e e n t h e s et w os p e c i e s ，a n dd e f i n et h e i rt a x o n o m i cs t a t u s a st h er e s u l t ， w e b r o u g h t f o r w a r dan e wm o r p h 0 1o g ic a lt a x o n o m icm e t h o dt o d i s t i n g u i s ht h et w oa c a r t i as p e c i e sa n dt h e i ri n t e r m e d i a t ef o r m s 3 w eo b t a in e dt h em t c o ia n dm tl6 sr r n ag e n ef r a g m e n ts e q u e n c e so fa p a c i f i c af r o mj i u l o n gj i a n ge s t u a r ya n dm i nj i a n ge s t u a r y ，t h ea v e r a g e g e n e t i cd i s t a n c ei s1 2 8 a n d1 8 0 ，r e s p e c t i v e l y t h ev a l u eo ff s t , 0 13 0 6 ，w a sm e a s u r e d ，a n dt h ev a l u eo fn m , 1 6 6 ，w a se s ti m a t e db a s e d o nt h ev a l u eo ff s t t h er e s u l t sr e v e a l e dt h a t 丘p a c i f i c af r o mf u ji a n c o a s t a lw a t e r sw a sap o p u l a t i o nw i t hh i g hg e n ef l o w t h e r ew a ss t i l l n op o p u l a t i o nd i f f e r e n t i a t i o nf o u n di nf u j i a nc o a s t a lw a t e r sb yu s i n g c h i - s q u a r et e s ta n dp m ( p e r m u t a ti o n ) t e s tw it hpv a l u e 0 0 5 ( n o s i g n i c a n t ) 4 d n as e q u e n c e so fm t c o ig e n e sd i f f e r e db e t w e e ni n d i v i d u a l so fa p a c i f i c af r o ms o u t ht a i w a ns t r a i ta n da p a c i f i c af r o mf u ji a nc o a s t a l w a t e r sa n ds u p p o r t e dt h e i rd e s i g n a t i o na sd i s t i n c ts p e c i e s ：3 1 6 f o r m t c o i t h eg e n ef l o wp a t t e r nb e t w e e nt h e ma l s os h o w sh i g h l yi s o l a t i o n ： f s t = 0 9 4 6 2 ：n m = 0 0 1 5 t h ee v i d e n c eo fm t c o la n dm t l 6 sr r n as e q u e n c e s ， m o r p h o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s a n de c o l o g yb r i n gu sac l e a r l yc o n c l u s i o n ：a p a c i f i c aw h i c hi sd i s t r i b u t e di nl o ws a li n i t yf u j i a nc o a s t a lw a t e r s i st h es a m es p e c i e st oan e wa c a r t i as p e c i e sw h i c hw a sr e p o r t e df r o m t h ea r i a k eb a y ，j a p a n t h er e a la p a c i f i c ao fc h i n as e ai sd i s t r i b u t e d i nt h eh i g hs a li n i t yw a t e r so ft h es o u t hc h i n as e a 6 i no r d e rt of u r t h e re x a m i n et h ep a t t e r no fe v o l u t i o na n dp h y l o g e n y w it h i nd c a r t i a , c o n s e n s u sm t c o ia n dm t1 6 sr r n as e q u e n c e so fa c a r t i a s p p w e r eu s e dt or e c o n s t r u c tp h y l o g e n e tict r e e k e yw o r d s ：c h i n as o u t h e a s tc o a s t a ls e a s ：a c a r t d as p i n i c a u d a ：a c a r t i a p a c i ，i c a ；m t c o l ：m t l 6 sr r n a ；p o p u l a t i o ng e n e t i c s ：p h y l o g e n y 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成果。 本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中以明 确方式标明。本人依法享有和承担由此论文产生的权利和责任。 声明人( 签名) ：卸皿逸 立刀9 7 年1 7 r 月多e l 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大学有权保留 并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电子版，有权将学位论文用 于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的 内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的 学位论文在解密后适用本规定。 本学位论文属于 1 保密( ) ，在年解密后适用本授权书。 2 不保密( ) ( 请在以上相应括号内打“) 作者签名：玑1 2j 翟日期： 矿哆年9 月多日 新签名：雌姒龟嗍砷年7 月弓日 中国东南沿海两种常见纺锤水蚤的分子系统学研究 第一章前言 第一章前言 浮游桡足类是海洋中最占优势的浮游动物，种类多，数量大，是海洋生态系 统中重要的次级生产者，在生物生产过程中占据重要地位和起着重要作用。在能 流与物流过程中，上行影响着渔业产量和渔业结构，下行则调控浮游植物的产量 和初级生产力。在某些海域，浮游桡足类特征种、关键种往往数量大，其数量变 动对浮游生物群落结构、能流途径和通量等有着举足轻重的影响。研究它们的种 群动力学是了解海域资源变动规律、生态系统中生物过程及其“上行一下行 调 控机理等的基础研究。由于桡足类体型较小，研究其生物多样性和直接观察其迁 移过程及分布变得非常艰难，通过现有的调查只对其1 5 的分布进行了估计1 。随 着分子生物学的发展和新的研究手段的不断产生，人们开始运用可遗传的性状来 研究物种的遗传多样性，产生了多种的遗传标记技术。将遗传分析与生态学、进 化学和海洋学的研究相结合，能够改进对种群动力学参数、分布与基因流的评估 技术，并较为准确地测定种群大小和繁殖率的变化以及生物多样性。其中分子遗 传标记技术的快速发展为海洋桡足类的分类学、群体遗传学、系统发育和分子进 化等研究提供了良好工具。 第一节遗传标记技术的发展及其在桡足类研究中的应用 2 0 世纪5 0 - 8 0 年代，桡足类群体结构主要通过不同群体的个体形态特征分析， 种群年龄结构以及生命周期表构建，以此分析群体结构及种群发生、补充及世代 更替情况。桡足类群体结构研究已在一些专著或评述中得以阐述。毋庸置疑，自 然海区中桡足类群体结构研究为种群遗传学和分子生态学的发展和深层研究奠 定了基础。在遗传研究过程中，人们一直致力于寻找一些可靠的遗传标记来提高 研究效率。遗传标记的种类和数量随着遗传学的发展而不断增加，经历了一个从 简单到复杂、从宏观到微观、从表型到本质的发展过程。随着生物学技术的不断 发展，遗传标记也在不断发展，经历了形态学、细胞学、生物化学及d n a 分子标记 l h u 神s g i i o - m 卸yc o p e p o d s ? j 1 l y d r 曲i o l o g i a ，1 9 9 4 ，2 9 2 2 9 3 ( 1 ) ：1 2 7 ( 原文未见。参阅刘光兴，2 0 0 7 ) l 中国东南沿海两种常见纺锤水蚤的分子系统学研究第一章前言 等几个主要发展阶段。 1 1 形态学标记 十九世纪6 0 年代，孟德尔对相对性状遗传规律的研究，构成了最早的遗传标 记一形态学标记，奠定了近代遗传学的基础。形态学标记是与目标性状紧密连锁， 表型上可识别的等位基因突变体。但是形态学标记数量少，不能随机代表生物体 遗传组成，也无法确定哪种或哪些性状更为重要、更符合研究目的。每种形态标 记变异小，通常只有两种变异类型。虽然观测方便易行，但是生物表型是遗传因 素与环境因素相互作用的综合结果，并不能完全或真实地反映遗传变异，得到的 结果往往不够完善。 1 2 细胞学标记 生物学研究进入细胞学水平后，染色体组型分析成为研究遗传多样性的重要 工具。这种方法通过比较细胞分裂时期染色体的形态参数，如相对长度、着丝点 指数、臂比等将每条染色体按各自特征进行区分，得到一定的染色体组型。不同 生物染色体组型不同，但某些种类的核型或染色体大小并未表现出明显差别。因 此，要利用差异染色，借助特殊处理，使染色体显示特定带纹，以进行更细致的 染色体带型分析。根据带型和常规组型分析的指标识别染色体的异同，揭示染色 体多态性。染色体多态性对于生物遗传多样性的认识非常重要，但对染色体数目 相等、形态相似的物种、类群或同一群体不同个体来说，单纯用染色体多态性来 进行遗传学研究是不够的。1 9 8 0 年以来，国外学者便开展了对桡足类染色体的研 究，不仅对桡足类染色体数目进行了研究，而且从遗传学的角度解决了许多形态 分类及生态方面的难题。如l a z z a r e t t o ( 1 9 8 5 ) 曾经对k e r g u e l e n 海区猛水蚤目 虎斑猛水蚤( t i g r i o p u s ) 的2 个地理种群进行了染色体分析，其染色数目和组型 均不相同，因此被认为是2 个不同的种。我国在桡足类染色体研究方面起步较晚， 从1 9 9 4 年才开始出现关于桡足类染色体研究的报道。曹文清等( 1 9 9 4 ) 对刺尾 纺锤水蚤( a c a r t i as p i n i c a u d a ) 、太平洋纺锤水蚤( a c a r t i ap a c i _ f i c a ) 、火腿许 水蚤( s c h m a c k e r i a p o p l e s i a ) 染色体数目和形态作了初步分析，发现刺尾纺锤水 蚤和太平洋纺锤水蚤的二倍染色体数目均为2 n = 2 0 ，且均为中部和亚中部着丝点 染色体，并初步认为二者应属于同一种的不同种群。林元烧等( 2 0 0 0 ) 对厦门港 2 中国东南沿海两种常见纺锤水蚤的分子系统学研究第一章前言 中华哲水蚤( c a l a n u ss i n i c u s ) 中期染色体形态作了分析研究，并对其不同世代 和不同地理种群的染色体进行了比较，发现染色体数目频率分布并没有统计学上 的差异。毛连菊等( 2 0 0 2 ) 对挪威小毛猛水蚤( m i c r o s e t e an o r v e g i c a ) 和硬鳞 暴猛水蚤( c j y t e m n e s t r as c u t e l l a r e ) 染色体的数目和组型进行了初步观察和分 析。 1 3 生物化学标记 二十世纪6 0 年代中期，同工酶电泳技术问世，并在随后的2 0 多年时间内成为 研究群体遗传变异和群体间遗传分化、系统发育的主要手段。同工酶电泳是比较 不同物种问基因表达产物异同的一种重要技术，其共显性标记可以揭示基因序列 和功能差异。同工酶标记已经被广泛应用于建立遗传图谱、种群分析、资源评价 等的研究中。但同工酶分析仍存在其内在的局限性：同工酶是基因表达产物而不 是基因本身，因此在翻译后可能会被修饰，且其活性受环境及发生状态的影响； 只能分析编码可溶性酶的基因和检测可导致产物分子静电荷改变的氨基酸组成 性交异。将同工酶技术应用于桡足类的研究始于二十世纪7 0 年代末，许多研究表 明，同工酶在海洋桡足类中也是高度可变的( s e v i g n y ，1 9 8 9 ；b u c k l i n ，1 9 8 9 ： b u c k l i n ，1 9 9 1 ) ，因而可藉以对形态学无法区分的一些系统关系( 遗传关系、地理 分布关系等) 进行更有效的定位。b u r t o n ( 1 9 7 9 ；1 9 8 1 ) 对美国j n 卅l 沿岸的加利 福尼亚虎斑猛水蚤( t i g r i o p u sc a l i f o r n i c u s ) 的系列研究与b a t t a g li a ( 1 9 7 8 ) ， b i s o l ( 1 9 7 6 ) 对猛水蚤属的研究结果都显示了环境变化与种群遗传差异有密切 的联系。b u c k l i ne ta 1 ( 1 9 8 5 ) 以4 种酶5 个位点分析了美国西海岸夏眠唇角水 蚤( l a b i d o c e r aa e s t y v a ) 的种群遗传分化，证明存在高的遗传变异水平和遗传分 化，认为地理隔离、生活史差异和所受选择不同可能是遗传分化产生的原因。k a n n e 芒a 1 ( 1 9 9 6 ) 对缅因湾飞马哲水蚤( c a l a n u sf i n m a r c h i c u s ) 的种群结构进行了 研究，以等位酶分析其遗传相似性，结果同线粒体d n a ( m t d n a ) 的1 6 sr r n a 和c y t b 基因的r f l p 结果基本一致。我国对海洋桡足类同工酶研究较国外起步晚。王桂忠 等( 1 9 9 2 ) 通过对不同季节的真刺唇角水蚤种群进行了同工酶分析，以探明这些 季节个体产生变异的生化基础。曹文清等( 2 0 0 2 ) 对中华哲水蚤不同地理种群苹 果酸脱氢酶进行了分析，发现台湾海峡与黄海东南部地理种群的一些同工酶位点 存在明显差异，这些基因型的差异可能是其对所处的不同生态环境产生适应能力 中国东南沿海两种常见纺锤水蚤的分子系统学研究第一章前言 所引起的。谭树华等( 2 0 0 3 ；2 0 0 4 ) 通过对黄、东海的中华哲水蚤与精致真刺水 蚤几种同工酶多态性位点进行分析，研究了其种群分化。 1 4d n a 分子水平标记 随着分子生物学和分子克隆技术的发展，分析遗传物质d n a 在不同生物个体 的差异来鉴别生物的新技术被提出与应用。遗传标记概念的发展建立在核酸分子 水平上存在具有相对差异的等位基因的基础上。他们广泛存在于高等生物d n a 编 码区及非编码区，因此被称为d n a 分子标记。与前3 种标记( 形态、细胞、生化标记) 不同，d n a 分子标记是d n a 水平上遗传变异的直接反应。近1 0 年来，d n a 分子标记的 研究和应用飞速发展，一系列d n a 分子标记系统相继形成。与其他3 种遗传标记相 比，d n a 分子标记具有下列优越性：直接以d n a 形式表现，不受发育时期、季节、环 境限制；数量多，遍及整个基因组；多态性高，自然界存在许多等位变异；样品需 求量少；很多分子标记表现为共显性，能鉴别出纯合基因型和杂合基因型，能提 供完整的遗传信息。d n a 分子标记技术目前已出现了几十种，新的分子标记还会 不断涌现，常用的分子标记方法包括：限制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o n f r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，简称r f l p ) ，随机扩增多态性( r a n d o ma m p l i f i e d p o l y m o r p h i cd n a ，简称r a p d ) ，扩增片段长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ，简称a f l p ) ，简单重复序列( s i m p l es e q u e n c er e p e a t s ，简称s s r ) ， 简单序列重复区间扩增多态性( i n t e r - s i m p l es e q u e n c er e p e a t s ，简称i s s r ) ， 单核苷酸多态性( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ，简称s n p ) 等。 第二节d n a 分子遗传标记在桡足类研究中的应用 2 1 分类学研究 桡足类是浮游动物的重要组成部分，不但种类多、数量大，并且分布广，遍 及世界各大海洋。为了研究桡足类的种类组成、数量变动以及时空分布，首先必 须正确鉴定种类，从而获得准确可靠的资料。分子分类学诞生以前，桡足类几乎 完全依靠外部形态特征、并参考其地理分布和季节分布等生态特征作为分类的依 据。然而海洋桡足类一些种属形态标记少、近缘种和同属种同域分布普遍存在， 4 中国东南沿海两种常见纺锤水蚤的分子系统学研究第一章前言 但遗传特征却非常不同，这给以形态和生理特征为主的分类鉴定研究带来了较大 困难。并且，浮游动物群落中，繁殖盛期桡足类幼体占组成的绝对优势，但是由 于其形态难以鉴定，也对种类鉴定造成很大困难。分子分类学从遗传物质d n a 水 平上进行研究，为桡足类的种类鉴定提供了有效的研究方法。例如，长期以来， 长腹水蚤属( m e t r i d i a ) 以形态标准分为2 个种，如雌性以头部形态和第5 胸足的刚 毛长度，雄性以尾肢长度和第5 对胸足左肢的刺的多少来区分，但存在争议。 b u c k l i n 等( 1 9 9 5 ) 对其线粒体d n a ( m t d n a ) 的1 6 sr r n a 基因测序表明：m e t r i d i a ，u c 鲫瘌胎川讹p a c i f i c a 的序列差异为1 3 ，达到种间差异的水平，从分子水 平上支持形态分类标准，将彪l u c e n s 籼p a c i f i c a 定为两个种，解决了长期的争 议。b u c k l i n 等( 1 9 9 9 ) 以通用引物对线粒体d n a 的细胞色素氧化酶i 亚基( m t c 0 1 ) 基因扩增产物测序，对哲水蚤目3 个属( c a l a n u s , n e o c a a n u s , p s e u d o c a l a n u s ) 的8 个种进行了分类鉴定和系统评价研究，得出同属种序列差异在1 3 - - , 2 2 之间， 可确定同属种的进化关系，但不能确定属间关系。再据此序列，设计了哲水蚤种 的特异寡核苷酸引物，进行多元种类特异性聚合酶链式反应( s s - p c r ， m u l t i p l e x e ds p e c i e s s p e c i f i cp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) ，可对3 种哲水蚤 进行快速鉴定。之后又利用m t c o i 基因片段序列对哲水蚤1 0 个属3 4 个种进行了序 列分析，结果发现种内差异( 1 4 ) 明显小于种间差异( 9 2 5 ) ( b u c k l i n ，2 0 0 3 ) 。l i n d e q u e 等( 1 9 9 9 ) 建立了另一种快速、低成本的鉴定4 种哲水 蚤( f i n m a r c h i c u s ，cg a c i a l i s ，ch e l g o l a n d i c u s ，ch y p e r b o r e u s ) 的 方法，据1 6 sr r n a 基因扩增产物序列，对产物进行r f l p 分析，各个种都可产生唯 一的限制性酶切图谱。该方法可对亲缘种、同属种进行有效鉴定，并可研究环境 因素( 海流、温度、营养盐等) 对种类组成和种群分布、迁移等的影响。在大量种 类的m t d n a 基因序列被测定和建立其基因序列库的基础上，可进行种类鉴定和进 化关系研究。如s u n d t 等( 1 9 9 8 ) 以1 6 sr r n a 基因片段序列数据和以前的序列比较， 鉴定了巴伦支海马歇尔哲水蚤( c a l a n u sm a r s h a l l a 由的存在。 2 2 遗传多样性与群体遗传学研究 分子遗传标记在揭示物种的遗传多样性方面发挥着重大的作用，如果没有这 类标记技术，就无法很好地在分子水平上研究遗传多样性问题。m t d n a 的分子数据 能够通过调查桡足类的群体遗传多样性水平，进而推测物种形成过程中的进化历 中国东南沿海两种常见纺锤水蚤的分子系统学研究第一章前言 史、地理隔离、遗传分化的原因。分子遗传标记技术在国内已经成功运用于多种 生物群体遗传多样性研究( 汪永庆等，2 0 0 2 ；张全启等，2 0 0 4 ；朱新平等，2 0 0 5 ) 杜合军等，2 0 0 6 ) ，在桡足类遗传多样性研究方面主要集中在国外。b u c k l i n 等 ( 1 9 9 8 ) 对近北极的飞马哲水蚤( cf i n m a r c h i c u s ) 和小哲水蚤( n a n n o c a a n u s m i n o r ) 的1 6 sr r n a 基因序列测定表明，cf i n m a r c h i c u s 的遗传多样性较低，其单 倍型多样性h 值为0 3 6 8 ，核苷酸多样性指数p i 仅为0 0 0 3 7 ，2 个种的有效群体和有 效雌性群体都较小，并对其原因进行了推测。然而，m t d n a 数据产生大量相同和 单一单倍型时，则不能提供群体遗传结构分析的有用信息，会削弱m t d n h 分析群体 遗传结构的能力。海洋桡足类群体遗传结构及其分化是一项重要内容，也是目前 较薄弱的环节。m t d n a 的分子标记和序列测定均可准确反映群体的遗传状况，并对 基因流模式、有效群体大小、补充机制和环境影响等做出分析。b u c k l i n 等( 1 9 9 4 ) 以m t d n h1 6 sr r n a 基因序列数据分析2 个地理种群( c a l a n u sp a c i f i c u so c e a n i c u s 和c a l a n u sp a c i f i c u sc a l i f o r n i c u s ) 序列差异为0 9 1 0 ，而不同地区 口c a l i f o r n i c u s 个体间则为0 2 - - 0 5 ，从而提供了p a c i f i c 晒存在亚种分 化的分子证据。c a u d i l l 等( 2 0 0 4 ) 分析了西北太平洋沿岸4 个河口的汤氏纺锤水 蚤( a c a r t i at o n s a ) m t d n a1 6 sr r n a 基因片段序列，发现该4 个地理种群具有明显 的遗传差异和地理隔离，并推测这种现象是由于历史上的气候变化和河口与沿岸 环境变异引起的。h a r r i s o n 等( 2 0 0 4 ) 通过对加利福尼亚虎斑猛水蚤 ( zc a i f o r n i c u s ) 2 个分支种群的m t d n a 细胞色素氧化酶i 亚基的1 1 个微卫星位点 进行分析，发现二者遗传距离达到1 8 。另外，核d n a 中的r d n a 基因序列间隔区 ( i t s 2 1 ，i t s 2 2 ) 进化速度较快，适合属内种间或种内群体间遗传结构及遗传分化 的研究。r o c h a - 0 1 i v a r e s 等( 2 0 0 1 ) 以5 8 sr r n a 基因、i t s 2 1 和i t s 2 2 研究了猛 水蚤( c e t o c a m p t u sd e i t e r s d 的地理种群分化，认为至少存在4 个种。b u c k l i n 等( 2 0 0 0 ) 利用核d n a 的p s e u d o - c o i 基因和磷酸葡萄糖异构酶( p g i ) 基因序列和特 异位点频率( s i t e s p e c i f i cf r e q u e n c i e s ) 分析研究了冰岛水域飞马哲水蚤 ( ef i n m a r c h i c u s ) 的遗传分化，认为这2 个基因对于该种的地理隔离研究是有用 的标记。 6 中国东南沿海两种常见纺锤水蚤的分子系统学研究第一章前言 2 3 系统发育和分子进化学研究 系统发育数据一般来自形态、化石和分子技术几个方面，但桡足类几乎没有 可以利用的化石，形态数据也极其有限。核d n a 中r d n a 基因组的5 8 sr r n a 、1 8 s r r n a 、2 8 sr r n a 基因进化很慢，是目前目间或更高阶元系统发育研究的主要分子 标记，甚至适合于真核生物和原核生物间同源关系的比较。m t d n a 在浮游甲壳类的 系统演化研究中主要用于近缘种间或较高阶元( 一般科以下) 的系统发育关系研 究( p a l a u m b i ，1 9 9 6 ) 。b r a g a 等( 1 9 9 9 ) 以核d n a 中的2 8 sr r n a 基因的d 9 d i o 区研究 了桡足类的3 个目( c a l a n o i d a , h a r p a c t i c o d i a , p o e c i l o s t o m a t o i d a ) ，5 个总科 ( c a u s o c a l a n o i d e a ,e u c a l a n o i d e & ( f e nt r o p a g o i d e &m e g a c a a n o i d e a , a r i e t o l l o i d o a ) 的系统发育关系，认为3 个目均为单系，支持p o e c i l o s t o m a t o i d a 为c a l a n o i d a 与h a r p a c t i c o d i a 的基础，但形态分析则认为c a l a n o i d a 为其他二者 的基础。m t d n a 中1 6 sr r n a 基因常被用来构建种间的系统发生关系。b u c k l i n 等 ( 1 9 9 5 ：1 9 9 2 ) 以m t d n a 的1 6 sr r n a 基因序列数据，比较了3 种哲水蚤 ( cf i n m a r c h i c u s , cm a r s h a a b p a c i f i c u 曲的遗传关系，聚类分析表明 f i n m a r c h i c u s 与em a r s h a l a e 相似度更高，并推测这3 个种在几百万年前即已 发生分化。另外还研究了6 种哲水蚤和3 种长腹水蚤( m e t r i d i a ) 的系统发育，并以 n j 聚类构建了系统发生树，以分子钟推算哲水蚤属( c a l a n u 5 ) 在8 0 0 0 万年前开始 分化，亲缘种群间和亲缘种分别在4 0 0 0 万年和2 0 0 0 万年前开始分化，推测是受更 新纪晚期辐射的结果。h 订1 等( 2 0 0 1 ) 以m t d n a 的c o i 基因序列对1 0 种哲水蚤进行了 系统树的构建，结果与1 6 sr r n a 基因和形态基础上的种系发生关系相吻合，但还 不能确定中华哲水蚤( cs i n i c u s ) 的系统地位。在上述b r a g a 等( 1 9 9 9 ) 的研究中也 发现，真刺水蚤属( e u c h a e t a ) 中有部分种类的进化关系通过1 6 sr r n a 基因序列分 析难以确定。因此，由于海洋桡足类种属较多，在分析的种属不够全面时，确定 它们的分类地位、进化关系是比较困难的，有时需要多种分子数据的互相补充。 如上所述，在海洋桡足类分子标记研究方面已建立了一些较成熟的方法，一 些优势种的m t d n a 和核d n a 特定片段序列已被测定。桡足类的分子标记研究在国内 尚属起步阶段，与国外还有较大差距。随着分子生物学的发展和分子标记技术的 完善，利用分子遗传标记技术必将对海洋桡足类各方面的研究起到重要的促进作 用。 7 中国东南沿海两种常见纺锤水蚤的分子系统学研究第一章前言 第三节线粒体d n a 作为桡足类遗传标记的优势 绝大多数的真核生物中都含有线粒体( m i t o c h o n d r i o n ) 这种细胞器，它自 身携带d n a ，可自我复制、表达，并有核基因编码的蛋白质和酶从细胞质输入线 粒体，共同完成生物氧化的生理功能。线粒体d n a ( m t d n a ) 是一种核外遗传物质， 人及大多数动物细胞的m t d n a 的分子量大小为1 6 5 k b 左右；酵母约为7 8 k b 。呈环 状共价双链结构，根据碱性氯化铯密度梯度离心中双链密度不同分为重链( h 一 链) 和轻链( l 一链) ，由1 3 个蛋白质基因，2 个r r n a 基因，2 2 个t r n a 基因，控 制区( d 一环区) 和轻链复制起始区组成。其中1 3 个蛋白质基因，包括细胞色素b 基因( c y tb ) 、细胞色素c 氧化酶三个亚基的基因( c o i 、c o i i 、c o i i i ) ，n a d h 氧化还原酶七个亚基的基因和a t p 酶两个亚基的基因。 绝大多数动物的线粒体d n a 表现为母系遗传，这种遗传特性便于进行群体分 析，一个个体就能代表一个母性集团，因此只需少量个体样本便能反映一个群体 的遗传结构。在一级结构上，其进化速率为核d n a 的5 1 0 倍。由于其分子较小， 呈环状，容易分离纯化；而且基因组结构相对简单、稳定、无组织特异性，便于 分析，它已成为研究动物起源进化及群体遗传分析的理想研究对象。 m t d n a 进化速度快的原因有以下几种( 徐其放等，2 0 0 5 ) ：( 1 ) 选择压力小。 核d n a 承担了绝大部分的选择压力，因此突变容易固定下来；( 2 ) 错误的复制和不 完善的修复加剧了突变速率。聚合酶不能有效地对新合成d n a 链的编辑整理，且 易于形成较高的核苷酸错配率；( 3 ) m t d n a 的代谢增补时间短，这在一定程度上增 加了单位时间内突变及错误复制的数目，使突变能不断传递下去；( 4 ) 线粒体内 具有较高浓