（生物化学与分子生物学专业论文）金钗石斛光温调控的生理生化基础研究.pdf

摘要+ 针对名贵中药金钗石斛繁殖率低、组培茁移栽至今未成功及缺乏生理生化研 究的现状，本文首次系统研究了光、温影响金钗石斛生长的生理生化基础。 通过“c 0 2 标记，发现石斛不同生长发育时期，光合产物分配中心与植株生长中心 相一致。分蘖发生期，以植株形态建成为生长中心。光合产物有鲫8 5 滞留于成长叶 中；此时植株同化的光合产物，在生长的中期，主要供给分蘖的生长，面在后期则主要运 转到茎中。 石斛分蘖期，于5 0 0 0 、1 0 0 0 0 、2 0 0 0 0 、4 0 0 0 0 l x 的不同光强下，各设置5 个温度梯度： 1 5 、2 0 、2 5 、3 0 、3 5 ，对石斛进行处理，并测定了多项生理生化指标。，结果表明， 石斛的生长与代谢随温度由低到高，表现出弱一强一弱的变化规律；5 0 0 0 矗 照度下，石 斛生长以2 5 3 0 较为适宜；1 0 0 0 0 l x 照度下，则以2 0 2 5 为适宜温度范围；2 0 0 0 0 l x 与4 0 0 0 0 l x 的中、强光照下，2 5 处理石斛的生长优势尤为明显。可见，在不同的光照条 件下，石斛生长的适宜温度均以2 5 为佳。此外，在石斛分蘖早期，给予短期平均温度 2 0 ( 1 7 2 3 ) 的较低温处理，更有利于石斛分蘖数的增加，r 在2 5 。c 下，设置4 个光照梯度，即5 0 0 0 、1 0 0 0 0 、2 0 0 0 0 、4 0 0 ( j 0 l x ，进一步研究同一温度 下光照强度的变化对石斛生长与代谢的影响。结果表明：随光照强度的提高，石斛的光 合能力递增，但呼吸消耗也随之加大。同时，4 0 b 0 0 k 的强光照破坏了石斛叶绿素的形 成，叶绿素含量降低；可溶性蛋白质含量与总糖含量显著下降；c a t 活性明显降低，m a d 含量与p o d 活性则显著提高，表明叶片衰老程度加大。因此石斛生长的光照强度以 2 0 0 0 0 l x 为宜。弘一， 光温处理引起石斛生理生化过程明显的相应变化表现出：石斛的生长与m d a 含量 呈显著负相关。与可溶性糖含量呈一定正相关，并且石斛的生长与可溶性蛋白质含量、 叶绿素含量、光合速率之问的变化趋势基本一致。f 低光照强度较有利于可溶性蛋白质 含量的提高，高光照强度有利于糖的合成。在石斛生长的适宜光、温( 2 0 0 0 0 t x 、2 5 。c ) 条 件下c a t 表现出较高的酶活性，而p o d 则表现出活性的最低点；c a t 活性与m d a 含量 呈显著负相关，而p o d 活性则与之呈显著正相关，表明p o d 话性与植株的衰老程度有 关。经c a t 、p o d 、e s t 的同工酶分析表明，不同光、温处理，引起了石斛同工酶谱带数目 的增减或强弱的改变，其变化与相应酶活性基本一致。表明光照强度与温度的改变影 响了植株体内酶的活性和合成。_ _ r 、。 根据以上研究结果，我们提出了加速金钗石斛繁殖的最适光温条件及措施。 、。y 关键词：金钗肴斛光照强度温度生理生化 本研究经费山广东古i 然科学基金课题( 项日编号9 9 4 2 1 i ) 和广东省重点攻羌课腰( 项目编号9 9 m 0 0 8 0 1 c - ) 提供。 t h es t u d yo nt h ep h y s i o l o g i c a la n d b i o c h e m i c a l f o u n d a t i o n so fd e n d r o b i u mn o b i l el i n d l r e g u l a t e dw i t hl i g h ta n dt e m p e r a t u r e c i i o u n 一a ( d e p a r t m e n to fa g r o n o m y ，s o u f l t w e s ta g r i c u l t u r a lu n i v e r s i t y ，c h o n g q i n g ，c h i n a ) a b s t r a c t t h ep h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a le f f e c t so fl i g h ta n dt e m p e r a t u r eo nd e n d r o b i u m n o b el i n d l w e r es t u e l i e d i tw a sf o u n dt h a tt h ed i s t r i b u t i o nc e n t r eo f p h o t o s y n t h a t ec o r r e s p o n d e dw i t ht h e g r o w t hc e n t r ei nt h ed i f f e r e n tg r o w t hp e r i o d so fd e n d r o b el a b e l e dw i t h1 d c 0 2 i nt h et i l l e r i n gs t a g e t h eg r o w t hc e n t r ew a sp l a n tf o r m i n ga n dt h ep h o t o s y n d l a t ed i s t r i b u t e dt ot h e m a t u r el e a v e sw a s8 0 8 5 t h ep h o t o s y n t h a t ea s s i m i l a t e di nt h i s s t a g es u p p l i e dr n a j n l y t h eg r o w t ho ff i l l e t i n gi nt h em i d t e r m g r o w t ha n dw a gc o n v e y e dt ot h em a t u r es t e m si n t h el a t t e rg r o w t ho fd e n d r o b e i r it h et i l l e f i n gs t a g e ，d e n d m b ew 8 5t r e a t e dw i t ht h ed i f f e r e n tt e m p e r a t u r e sa 81 5 。c 。 2 0 q c ，2 5 ，3 0 c ca n d3 5 。c i nt h ed i f f e r e n t h g h t i n t e n s i t i e sa s 5 0 0 0 l x ，1 0 0 0 0 l x ， 2 0 0 0 0 l xa n d4 0 0 0 0 l x t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eg r o w t ha n dm e t a b o l i s mo fd e n d r o b e s h o w e dt h e “w e b k n e 8 8 一s t r e n g t h w e f k n e 8 $ ”i e 到矗i i t ) ，w i t ht h ec h a n g e 丘咖l o w e rt o m - p e r a t u r et oh i g h e rt e m p e r a t u r e t h es u i t a b l er a n g eo ft e m p e r a t u r eo fd e n d r o b eg r o w t hw a s 2 5 3 0 i n5 0 0 0 l xl i g h ti n t e n s i t ya n d2 0 2 5 。ci n1 0 0 0 0 l x l i g h ti n t e n s i t y 。i nt h el i g h t o f2 0 0 0 0 l xa n d4 0 0 0 0 l xi n t e n s i t y ，t h eg r o w t hs u p e r i o r i t yo f p l a n t st r e a t e dw i t h2 5 。cw i t s d o m i n a n t t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h es u i t a b l eg r o w t ht e m p e r a t u r eo fd e n d r o b ew a s2 5 i nt h ev a r i e dl i g h ti n t e n s i f i e s t h es t u d i e so nt h et r e a t m e n t si nv a r i e d l i g h ti n t e n s i t i e s ( 5 0 0 0 l x 、1 0 0 0 0 l x 、 2 0 0 0 0 l x 、4 0 0 0 0 l x ) i nt h e u t i et e m p e r a t u r e ( 2 5 0 c ) i n d i c a t e dt h a tt h ep h o t o s y n t h e t i ca b i l i t yw a si r e p r o v e dw i t h t h ei n c r e a s eo fl i g h t i n t e n s i t y h o w e v e r ，t h er e s p i r a t o r ) c o n s u m p t i o nw a sa l s 0 r a i , , * dw i t hi t ，i tw a ss h o w nt h a tt h ee o n | e n l so fc h l o r o p h y l l s o l u b l e p r o t e i n ，t o t a l s u g a ra n d t h ec a ta c t i v i t i e sd e c r e a s e di n l i g h t o f h i s hi n t e n s i t y a s 4 0 0 0 0 h n em d ac o n t e n ta n dp o da c t i v i t i e si n e r e a s e dj nt h es u n et r e a t m e n t t h e s e i n d i c a t e dt h a tf i l es e n c f c r , e n c eo fd e n d r o l s ew a sa c c e l e r a l e di nt h el i g h to f4 0 0 0 0 l xi n t e n s i t y a n dt h es u i t a b l el i g h ti n t e n s i t yo ft h eg r o w t hw a s2 0 0 0 0 l x t h ed i s t i n c tp h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lc h a n g e si nd e n d r o b et r e a t e dw i t ht e m p e r - a t u m sa n du g h ti n t e n s i t i e si n c l u d e dt h a tt h eg r o w t hn l s sw a ss i g n i f i c a n t l yn e g a t i v ep r o p o r - t i o n a lt ot h ec o n t e n to fm d ab u tp r o p o r t i o n a lt ot h ec o n t e n to ft o t a ls u g a r t i l eg r o w t h n l a s sh a dc o r r e s p o n d i n gc h a n g e sw i t ht h ec o n t e n t so fs o l u b l ep r o t e i n ，e b _ l o r o p h y l la n dp h o t o s y n t h e t i er a t e t h el i g h to fl o w e ri n t e n s i t yw a sf i t t e r f o rr a i s i n gt h ec o n t e n to fs o l u b l e p r o t e i na n dt h el i g h to fh i g h e ri n t e o s i t yf o rt h es y n t h e s i so fs u g a r i nt h es u i t a b l e h e a t m e n t ( 2 0 0 c o l x ，2 5 。c ) ，c a th a dh i g h e ra c t i v i t i e sa n dp o dh a dl o w e ra c t i v i t i e s t h e c o n t e n to fm d a w a sn e g a t i v ep m p o i t i o n a lt ot h ec a ta c t i v i s i t i e sa n dp m p o r t l o n a lt ot h e p o da c t i v i t i e s t h ea n a l y s i so fz y m o g r a mo fi s o c n z y m e si n d i c a t e dt h a tt h ez y m o g r a m c h a n g e de i t h e rn u m t ) e r so ri n t e n s i t yi n t h et r e a t m e n t s t h ec h a n g e sw e r ei na g r e e m e n t w i t ht h ea c t i v i t i e so fc o r r e s p o n d i n ge n z y n l e s i tw a ss h o w nt h a tt h ea c t i v i t i e sa n ds y n t h e s i s o fe l l z y l n ei nd e n d m b ew e r ea f f e c t e db yt h ed i f f e r e n tt e m p e r a t u r e sa n dl i g h ti n t e n s i t i e s t h em 陇目】r c st h a ta c c e l e r a t et h er a t e so f 粤沁a n dr e p r o d u c t i o no fd e n d m b em r e r e m a d ea c c o r d i n gt ot h e s er e s u l t s k e y w o r d sd e n d r o b i u mn o b i l eh n d l 1 i g h ti n t e n s i t y t e m p e r a t u r ep h y s i o l o g y b i o c h e m i s t r y 缩写词 过氧化物酶 过氧化氢酶 酯酶 鲜重 丙二醛 磷酸缓冲液 三氯乙酸 聚乙烯吡咯烷酮 三羟甲基氨基甲烷 硫代巴比妥酸 勒克司 眦 咖 脚 晰 麟 姒 聊 陆 姒 k 文献综述 石斛属植物在我国有7 0 余种，能供药用的有2 0 余种，主要分布于华南及 西南地区。其中金钗石斛j 、长爪石斛、铁皮石斛、细茎石斛、钩状石斛、罗河石 斛、重唇石斛、广东石斛、细叶石斛、美花石斛等种类分布广、产量大，使用较多。 而常见的栽培品种主要有石斛、迭鞘石斛、铁皮石斛和霍山石斛。 石斛( d e 以r o b i u m 6 如b - 迎) 又名金钗石斛、吊兰花、扁草、黄草等。为兰科 石斛属多年生附生革本。主要分布予四川、贵州、云南、湖北、台湾、广东、广西 等省区。据本草纲目记载：“处处有之，以蜀中者为胜，今蜀人栽之，呼为金 钗花。”石斛以鲜或干茎入药【2 j ，具有益胃生津，滋阴清热的功能。本草纲目 中 早有记载：“石斛功能为强阴益精，久服厚肠胃平胃气，长肌肉有轻身延年之 功效。”石斛花形美观，花色艳丽，香气淡雅，因此它不仅是一种名贸的中药植 物，还是一种观赏价值很高的花卉植物。 迄今为止，许多学者已对石斛的化学成份、药理作用及临床应用等进行了 研究。1 9 3 2 年，铃木秀干于中药金钗石斛中首次获得生物碱，命名为石斛碱。 1 9 6 4 年，犬伏康夫等证明了石斛碱为倍半藉类生物碱。并确定了结构【1 6 】。7 0 年 代，欧洲学者相继于石斛届植物中，发现了一些新的生物碱【奠圳。对1 9 种石斛 属植物的化学成分研究结果表明【lo 1 j 这些植物所属的化学成分类型有较大 差异，其中只有5 种石斛属植物含石斛碱类生物藏，仅2 种含石斛碱而金钗石 斛( d ，硝玉) 是唯一含有石斛碱的中药石斛，其含量可达1 以上其总生物碱 含量也远较其他石斛为高。现已知道，金钗石斛茎中含有十多种生物碱。主要 有石斛碱、石斛酮碱、石斛胺、金钗碱、石斛高碱、石斛次碱、n 一甲基石斛碱、石 斛宁等。此外尚含有粘液质以及淀粉等【i 】。 石斛碱为石斛的主要有效成分，具止痛、解热作用，可降低心率、血压、减慢 呼吸，可产生中度的高血糖，具强壮作用并可解巴比妥中毒【i 】。药理试验表明 口服石斛煎剂能促进胃液分泌，帮助消化【7 1 ；石斛煎剂对孤儿病毒( e c h o , 1 ) 所 致的细胞病变有延缓作用，对小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能具有明显的促进作 用。具抑制大鼠肾脏微粒体n a + 一k + 一a t p 酶、逆转录酶、d n a 聚合酶等的作 用【7 - 8 】。石斛中提取的两种菲类化合物具有抗人体肺癌、卵巢腺癌和前髓细胞 白血病的作用 1 引，家兔实验表明，石斛能显著提高s o d 水平，从而起至降低l p o 的作用。大鼠试验表明【1 3 j ，石斛有明显的拮抗肾上腺素的收缩肠系膜血管作 用。 近年来，对石斛的另一重要成分一石斛多糖的研究越来越引起人们的重 视。石斛生理活性的强弱与其多糖的含量有一定的关系【9 j ，对2 5 种石斛3 6 个 样品的多糖含量测定结果表明，传统认为质重、嚼之粘牙、味甘、无渣者为优品， 其多糖含量较高。人体及动物实验均证明【l “。石斛多糖具有增强t 细胞及巨噬 细胞免疫活性的作用，同时它还是植物组培的一种重要调节剂。 临床应用表明，石斛对眼科疾病有明显疗效，对半乳糖性白内障不仅有延 缓作用，而且有一定的治疗作用【l “。由石斛、金银华等药材提取加工成的复方 冲剂脉络宁注射液【l 引有清热滋阴、活血化瘀等功效，临床治疗闭塞性周围血管 病3 5 0 例，疗效达9 0 以上。 石斛喜温暖湿润、半阴半阳的环境3 ，不耐霜冻、强光和暴雨，多附生于有苔 藓的树干和岩边石坎，用气生根吸收空气中的养分。主产区四川合江的年平均 气温1 8 2 。降水量1 0 5 0 m m ，相对湿度8 2 左右。贵州省生长在海拔1 0 0 0 m 以 下，年降雨量1 0 0 0 。1 4 0 0 r a m ，相对湿度8 0 左右的山区。石斛具根状茎b j ，2 3 年生地上茎节基部具有分蘖能力，可连续分蘖新茎茎枝，其下萌生须根。石斛 群体的新老更替主要通过分蘖新茎实现，其新茎经过两年的营养生长，才能开 花结实。石斛果实从开花授粉至果实成熟约需6 个月，由于借助昆虫异花传粉， 一般授粉不良。结果甚少。成熟种子微小如粉尘，种皮内只含有未分化的胚，几 乎不古有营养物质。在自然情况下，种子萌发时缺乏营养来源，要经过一个腐 生阶段，需与真菌共生，以获得养分的供给，才能完成萌发过程。实生幼苗的初 期生长也很慢，当年生苗高仅3 厘米左右。因此实际栽培中，多采用分株、扦插 育苗、腋芽繁殖等无性繁殖方式，尤以分株繁殖为主。 由于对生长条件的特殊要求，加上生长缓慢，生境曾遭大规模破坏。以及金 钗石斛具有上述重要功能所引起的过度采集，作为传统出口中药的石斛现已资 源枯竭，商品十分紧缺，被国家列为濒于绝灭的中药保护品种。因此近年来， 国内外的石斛研究已从过去的较集中于药用化学及资源学方面f 4 - 6 l ，转向资源 再生方面。资源再生以研究组培为主，已有获得试管苗的报道【i “2 3 l 。但移栽大 田却未成功，无法用于实际生产。这与对石斛生理生化特性缺乏研究有很大关 系。所以借助生理生化手段系统研究石斛生长发育规律，指导其驯化栽培，将 是挽救再生石斛资源、发展生产、满足药用及出口倒汇的可行途径。 2 引言 兰科石斛属多年生草本金钗石斛( 毗6 血肌，小泷u n c u ) 是强阴益籽的重 要中药( 1 引，也是唯一含有石斛碱的中药石斛品种，观赏价值亦很高。由于对生 长条件的特殊要求，生长缓慢，加上滥采滥拔，生境曾遭大规模破坏等原因，常 用中药金钗石魁已濒于绝灭。 长期以来，国内外的石斛研究较集中于药用化学方面，对石斛资源再生的 研究以组培为主。郭顺星等人【l b l 以原球茎为材料，建立了铁皮石触( d c n g l , - d e 一) 人工种子的初步制作流程，曾宋君等【1 9 j 则进行了几种石斛的种胚和茎尖 的离体培养及快速繁殖。唐雪梅等 2 0 】研究了激素对曲茎石斛试管苗生长的影 响。此外，还有霍t t t ：舀斛嫩枝茎尖离体培养成菌【2 、霍山石斛种子试管苗的培 养 2 2 1 等报道。关于金钗石斛组培研究则少有报道】。但上述组培虽已获得试 管苗，却难以移栽成活，不能用于生产实践。这与对石斛的生理生化特性缺乏 研究有很大关系。目前，人们已开始把目光转向了这方面的研究。只是报道甚 少。张明等人【2 4 1 曾对石解的生理及栽培方法进行了初步研究。对传统理论所认 为的石斛喜欢半阴半阳的光照条件提出异议，认为石斛能适应和喜欢强光照。 但徐云鹃等 2 7 1 人则认为。石斛要求低光强和散射光。杨业修等人汹】也认为石 斛需适当的荫蔽。周萍等人惜j 则进一步提出，影响石斛成活率的主要因素为栽 种方式和荫蔽度的大小，且以6 0 一的荫蔽度为宜。 尽管众说不一，但迄今为止尚无对石斛生理学的确切系统的研究。因此 本研究即旨在利用人工气候室，通过金钗石斛的驯化裁培生理的系统研究，弄 清石斛对光、温的需求规律探究生长发育的内在机制。找出石斛生长的适宜 光、温范围，为石斛的栽培驯化措施及管理手段提供理论和实践基础并为扩大 石斛繁殖，恢复资源提供一定的依据。 3 材料与方法 1 供试材料 1 1 金钗石斛由重庆市中药所提供，以锯木屑为盆栽基质。每盆2 5 株。 1 2 放射性同位素c 由中国厚子能研究院同位素研究所供给。 1 3 人工气候箱为日本产 2 方法 2 i 不同发育时期盒钗石斛对光合产物的分配试验 于生长初期( 4 月i o 日) 、第1 次分蘖生长勰( 8 月1 0 日) 、第2 次分蘖生长期( 1 1 月l o b ) ，j 9 昭年在本校同位索研究室。分别用整体植搪同化箱法饲艰“c 0 2 放射性比活皮为3 7 xl o s u q l 标记时间4 小时，4 8 小时后取样。样品烘干，磨成粉状，分别取l o o m g 用有机塑 料闪烁法在美国贝克曼公司l s 一9 8 0 0 型液闪诺仪上浏放曩| 话度。 2 2 金钗石斛周年对光合产物的运转 于生长初期( 4 月i 0 日) 整株饲喂”c 0 2 后分别于4 月1 2 日、6 月2 0i s 、8 月1 0 日、1 1 月l o 目取样。样品处理同上。 2 3 光、温处理 设置4 个光照强皮：5 0 0 0 l x 、l x 】o o i a 、7 o t 瑚1 , x 、4 0 ( o i , x 每个光照强度下设5 个平均温 度：1 5 、2 d 、2 5 、3 0 、3 5 ，分批于人工气候箱中进行试验找出不同照度下的适宜生 长温度范围，并初步确定适宜的光强范围。在此基础上。选定一个较适温度。下设4 个光照 强度：5 0 0 0 1 j 、1 0 0 0 0 1 a 、2 0 0 0 0 1 a 、4 0 ( ) 0 0 l a ，对石斛生长所需的适宜光照强度作进一步的试验。 试验设三个重复。 采用变温处理亦即屡绕平均温度上下浮动3 ，移j 如平均温度为1 5 时，每天的温度 变化为6 ：0 0 1 2 ：0 0 为1 5 ，1 2 ：0 0 一1 8 ：0 0 为1 8 ，1 8 ：0 0 0 ：为1 5 。c ，0 ：0 0 6 ：0 0 为 1 3 ，余类推。光照长度1 2 h 相对湿度舳。 2 4 形态及生理生化指标的测定项目与方法 2 4 1 石斛产量与株高的测定 处理l o 天后，将石斛拔出，除去根部基质后连根测定产量与处理前的产量相比较算 出其产量增值即增重。同时。测量每株高度。计算每个处理的平均高度与处理前的平均高 度相比较，算出株高增加值。 2 4 2 石斛分蘖率与腋芽数的测定 处理l o 天后。统计每个处理的有效分蘖数，与处理前所计臆芽效作对比，分蘖率为 4 直l l 曩墼。同时统计每个处理茎上的腋芽敬。 2 4 3 光舍速率、呼吸速率的测定 处理第5 天采用改良半叶法 3 9 1 测定。 2 4 4 叶绿素含量的测定 处理第8 天，采用乙醇一丙酮混合液法l 柏j 测定。 2 4 5m d a 含量的测定 处理第9 天进行测定。参照陈贵、李柏林【圳等的方法提取：取0 2 0 3 9 叶片，加 p h 7 8 、5 0 m m l l p u s5 h a ( 内含1 p v p ) 于冰浴中研磨提取。然后按d h i n d s a 等f 州的方法测 定m d a 含量，在提取液中加人0 5 1 卫c a 一2 0 t c a 溶液5 r i d 沸水浴中煮沸1 0 r a i n 冷却 3 0 0 0 9 离心1 5 岫1 量取上请液体积。并分另i j 测定伽h 和o n 2 4 6a 盯与p o d 活性的测定 2 4 6 1 酶液提取：处理第9 天进行涮定参照渡饮诺克【艟】、6 i d 明【圳等的方法。取 i 0 9 叶片，加0 2 9 c a c 0 3 和 b 02 m l 研磨定容至1 0 0 r a l 。静置提取，待过滤。上述操作均于 冰浴中进行。 2 4 6 2 1 0 1 3 活性测定：将酶液过滤前取2 5 l | d 悬浮渡以1 0 臼定容至5 0 r a l 定 期振动下于冰浴中放置3 0 一而n 挺取。过滤滤液即为酶挺取液。用愈创木酚法【枷进行测 定，反应体系包括酶液2 n d 、啦o6 m l 、0 3 禽刨术酚l m i 、0 n 啦ql d 。2 0 水浴作用 1 5 m l n ，加2 m l 丙酮中止反应测定o l x , n 以 州q 标准液绘制标准曲线。酶活性大小用氯 化斑创术酚删柙f m l n 表示。 2 4 6 3 c a t 活性测定：将。酶液提取”中的酶渡过滤滤液即为酶提取浪。参照 a l 一e e l 等的方法进行，反应体系包括2 m l 酶液，s i d1 k 0 2 。3 0 水浴保温1 0 m i n 加 5 n d l h 2 s 0 终止反应。用0 1 nk m j l 0 4 滴定剩余啦q ，根据啦0 2 的消失量计算c a t 活性。 酶活单位为h 2 0 2 矿w i i l i r i 。 2 4 7p o d 、a 幔、e s i 同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳及检测方法 处理5 天后，开始采样进行。三种电泳的制胶参照朱广廉【“、何忠效t e 】、张龙翔【删等 的方法，3 m o l lp h 8 。9 t r i s - h c l 分离胶缓冲液，0 5 m o l l p h 6 7 帖一h c i 浓缩腔缓冲液，n 。 n ，n ，n 一四甲基乙二胺原液4 0 蔗糖，0 5 6 过硫酸铵0 0 5 m d lp h 8 31 一甘氨酸 缓冲液，3 0 a c x o 8 b h 的分离胶贮液1 0 a c t 一2 5 b i s 的浓缩胶贮液，分离胶浓度为 7 5 ，浓缩胶浓度为4 。4 进行电泳约4 h 。 p o d 染色参照朱广廉i 训等的方法。f a t 染色参照董泗建【越】等的方法。i b - r 染色参照 谭维嘉 4 7 】等的方法。 2 4 8 可溶性蛋白质含量测定 处理第l o 天测定，根据b w l y 法旧】，以牛血清蛋白为标准。 2 4 9 可溶性总糖含量测定 处理第l o 天测定。用硫酸蒽酮比色法【4 0 4 a 测定，以葡萄糖为标准。 5 结果与分析 1 石斛光合产物的运转和分配 1 1 石艉不同生长发育时期对光合产物的分配 结果见表i 。生长初期时。光合产物绝大多数都滞留于成长叶中。供给成长叶的生长发 育，以促进檀株形态建成。8 月i o 日标记后光合产物主要分配到第1 次分蘩茎和第1 次分 蘖叶中，两耆合计分配6 8 1 3 ，此时植株处于第1 次分蘖生长期第1 次分蘖为生长中心 光合产物分配中心与植株生长中心相致。第3 次标记时。第2 次分蘖为生长中心，第2 次 分蘖叶中分配比例最高，占3 5 6 ，其次为第1 次分蘖叶3 2 6 9 表明第1 次分蘖此时也处 于旺盛生长期。 表i 石斛备器宫中光台产物的分配 t a b l e1 d l s t r l b u l l o ao fp i 附t 0 昭叫l _ t ei no r g a n so f 也m 山d * 测定部位 邮 标记日期l 丑b e u h 唔d a t e 4 月1 0 日 a p t ，1 0 b 月1 0 日 t l g 1 0 1 1 月1 0 日 n o v 1 0 放射性话度占总话度放射性活度占总活度放射性活度占总活度 r 董砌“竹t o u dp , a ( h d v i t y t o t a l r _ 击。眦6 v i q t o b d 【印m ) ( 呷m ) c p 1 1 ) - i 。一。哀示在囊弹时滚薜位 束形丑下襄嗣 。l 。一。h 酬“l h 叫r , d f o m w d - k _ 叫吣“s t i i “岫l 面i - 岫， 6 1 2 石斛周年对光合产物的运转 4 月1 0 日进行标记以后于不同时期测定各器官中“c 光合产物的分配，结果见表2 。4 月1 2 日取样对成长茎中仅分配1 5 4 8 。6 月2 0 日时成长叶中仅自留2 7 6 3 光合产物 有蟠4 9 运转到第1 次分蘖茎和叶中。供其生长发育成长茎中比铹上升至2 1 1 7 。8 月 i o 日时光合产物有4 4 4 i 运转列成长茎中。第1 趺分蘖中分配比例较6 月时下降。1 1 月m 目时成长茎中分配比例进一步增加达到5 i ，跖。表明生长初期植棣同他的光合产 物。在生长的中期主要供给分蘖的生长。而在后期则主要运转到成长茎中。 石堪为多年生摹本。每年2 3 月平均气温在l o 1 2 以上时恢复生长；4 一s 月逐渐旺 盛生长并进入分蘖期( 由2 3 年生茎基分蘖节萌发新茎) 。6 7 月为高生长盛期1 0 月以后 随气温降低逐渐进人体眠期u ，j 。从以上的分析可以看出。在石斛分蘖发生期( 4 5 月) 。 生长中心主要是植株的形态建成这一时期光合产物的同化积累直接关系到生长中期分蘖 的生长和后期成长茎中同化物的积累。石斛以茎人药。因此分蘖期如何促进石斛的生长特 别是茎上叶的生长对于石斛繁殖力的提高、茎的形成和产量的增加都具有重要意义。 因此在下面光、温对石斛生长代谢的调控研究中选择石斛的分蘖期进行。 囊2 光台产鞠在石斛各部位中的运转 呲2n 锄d 叫h d “啊m i 咄h m 嚣氆e l f 幽曲舶k 搏b 期- _ “q d _ 勰 扣r n 1 2 2 u k j l u t 。蛔r n o 旧1 3斯1 1 r o o m k l 簟尉性瞒虞& , g l lt 射性话墟占曩垢度放射性插应古且蕊眶t 射性话虞占总插鹰 黼掣訾警瞥掣帮掣 2 温度对石斛生长及代谢的调控 2 1 5 0 0 0 1 a 照度下不同温度对石斛生长及代谢的调控 2 1 1 不同温度对石斛生长的影响 2 1 1 1 对生长势的影呐 处理l o 天后，2 5 c 一3 0 e 下生长的石斛长势相对较好表现出茎杆较健壮叶片较长， 叶色较浓绿1 5 与2 0 次之；3 5 1 2 的处理则表现茎叶发黄茎杆纤弱。从表3 可以看出。 3 0 下生长的石斛鲜重增长较快。增重额为3 7 。6 4 9 ，其次为2 s ，增重额为3 1 7 魄；但从抹 高来看。则是3 0 e 与3 5 增高幅度最大，其次为2 5 。有研究报道【圳。高温( 极端温度 4 5 ) 和荫蔽条件有利于石斛的株高生长但会使石斛茎杆相对瘦弱纤细不利于产量和质 量提高。本研究3 5 处理石斛的生长状况也证实了这一点。 2 1 1 2 对繁殖力的影响 石斛的群体增殖主要依靠地上茎节基部的自然分蘖特性其次是其3 年生茎上端的腋 芽后者可萌发为新株作繁殖材料”j 。可见，分蘖率与腋芽敷的多少直接反映了石刺的繁殖 能力。 从我们的测定结果来看2 0 与2 s 处理的石斛其分蘖事分别为7 4 拍和6 2 2 6 腋芽数也较其它处理多表现 b 较高的繁殖力。3 0 处理灰之。3 5 处理下的石斛其隐芽 全部死亡。亦即有效分蕻数为0 繁殖力最低。 裹35 0 0 0 l a 照度下暑度对石斛生长的影响 埘e3l 隐e e l se l i l m q l e m t u r e t h e 舢o rd m d m b et n $ 0 0 0 l su g h tt n t e n a t y 2 1 1 3 对m d a 台量的影响及其与石斛生长的关系 测定结果表明( 表4 、图1 ) ，2 5 处理石斛的m n a 含量最低，其次为2 0 与3 0 处理，其 含量稿商于2 5 处理。但三者阊无显著差异。1 5 与3 5 处理远远高出其它处理，方差分 8 析表明，其差异达显著水平。 植物器官衰老或在逆境下遭受伤害。往往发生膜脂质的过氧化作用m d a 即是植物脂 质过氧化作用的产物它常被作为植物脂质过氧化的一个重要指标来研究【捌。从图1 可以 看出，石斛m d a 含量的变化与鲜重增加量的变化趋势相反。它们之问的相关系数为 一0 9 0 8 2 。 ) , k i l t 1 及上述分析可以看出y , 0 0 0 1 口照度下就石斛繁殖力的提高而言，2 0 2 5 较为 理想但从产量的角度来看，她以2 5 3 0 较适宜。 至 薯 l 基 本 塾 薹 撕 ，一嘲台- ，k 。瞰。 羞分睾l l - d 舢“ 薹 o 增量l i - 啊t 即_ k 妇i 下 m 蓍 沮鹰k 叩_ l t ( ) 髓l 卯叩h _ l ! 最度下不同强度处理的石辩中眦墟古量与其生长的关蕞 f i l l i r e l s m n s h i pb c h l t j i em d a _ - n d f m hd d e n d m b e - i h d i f f m _ m l 哪即呲u 瞄i n 卯h l 讪枷呻 强度n 舛m h m ( ) 田2 5 0 h 照度下不同温度处理的石斛中可溶性置自质古量和m d 舍量的关系 啦2 枞p h t h e o f l u b e 呻i nb n d m d aa f 蛐d b e 如峨州 愀n p 啊h i l 啊i n5 0 0 0 bl i 曲ti i i i a 匈牡 1 七0 d u b k 同s mi n 9 一1)5鼍噌置ij尊 2 。i 2 不同温度对石斛生理代谢的影响 2 1 2 1 对可溶性蛋白质含量的影响及其与x t d a 含量的关系 表4 、图2 表明，可溶性蛋白质古量随温度升高呈现先升后降的趋势，3 0 处理吉量最 高与其它各处理差异显著笛次之。这与硼) a 古最的变化相反。二者问的相关系敷为 一0 9 6 8 1 。 蛋白质的降解。可溶性蛋白含量的减少是植物组织和细胞衰老的重要指标【母t 蚓。本 研究中可溶性蛋白含量与m d a 含量的负榴关往也正说明了这一点。 2 i 2 2 时可洛性总糖含量的影响及其与生长的关系 酒定结果表髋( 表4 图3 ) 各处理石斛的总糖含蜃l ：2 0 和2 5 较高显著高于其它 处理次之呈现出随温度升高丽先升后降的趋势。 承溶性多糖是石蝌的药甩成份之一。同时也与石辩的生理活性的强弱有一定关系( 1 。 从图3 可以看出可溶性总塘台量与石斛的生长之问的变化趋势基本上一致呈正相关( r = 0 7 6 7 3 ) 。 ” 葛撕 格 趋 2 0 i b o 一总培音量t h e m “峰 下圈同。s - | mt h e f o h i o 咖f i g l i m 量度k 口h ) 田，弼h 照度下不同沮虞处理的石斛中总糖古t 与其产量的关系 - 3 胁妇_ i i i pb e t h e 叫e 4 j d a r _ 一i t h 删w 妇o f d _ 由山i kd i 翩h 畔m i n ，0 hl i 咖i n t e m l t y 2 1 2 3 对叶绿紊含量的影响 嗣定结果表明( 表5 ) 1 5 一范围内叶绿索含量随温度升高而增加各处理闻差异 显著3 0 达蓟最大，峦次之。3 5 迅速下降。 2 1 2 4 对净先合速率与呼吸速率的影响 表5 表明各处理石斛的净光合速率呈现先升后降的趋势为与3 0 处理的光台速率 明显高于其它处理这与叶绿素含量的变化基本一致。 呼吸速率随温度升高而增大。 l o 辛h量r一着薯e口-，1，仁一如一曲 |一j謦曩量t1日_i 一卑 表45 0 ( d l x 照度下温度对石斛m d a 含量、可溶性蛋白含量及总糖含量的影响 t a b l e4e f f e c t so ft m 单e r a t a r e so i lt h ec o n t e n t s0 im d a s o l u b l ep r o t e i n a n dt o t a ls u g a ro fd e n d r o b ei n5 0 0 0 l xl 讪t i n t e n s i t y 洼；此袭中同一行的救据中有相同字母者表示差异不显著( p = 0 0 5 ) 。下同。 n e t e ：t h es a m e 蛔hl i _ 僻l i n ei n d i t e dt h a tt h e 击邺时k “洲i h e 晒h 咖憎嘲n o 山l e ( p 。0 ) s a n e 洫t h ef o l l o w i n gt 蜘 裹5 5 0 g o l a 照度下温度对石斛叶绿素含量、净光台速率、呼吸速率的影响 t a b l e5e f f e c t so ft e m p e r a t m r m t h ec o n t e n to fd d o m p h y u n e t p h o l a s y n t h e t i c r a t ea n dr s p i n 幻r yr a t ee fd e n d m b ei n5 0 0 0 l xu g h tf m t e a s l t y 2 1 3 不同温度对石斛中酶的影响 2 1 3 1 对p o d 、c a t 活性的影响及其与m d a 含量的关系 表6 、图4 表明不同温度处理下的石斛其c a t 活性随温度升高呈现先增后减的趋势， 各处理间有显著差异，2 5 为其活性最高点。其次为3 0 这与m d a 含量的变化正好相反 二者问呈显著负相关( r = 一0 9 4 髓) 。 寰65 0 吣l 工照度下温度对石斟f o d 、c 下蓿性的影嫡 撕6 衄b m i n u s 佃妇啪i h 墨o r h m a n d c a t o f 山脚岫k h 卯h 墨水蜘岫 j 警 量 言 耋 i 口c a t 活性c a t 商订妇，一p o d 活性 p o d | c t i “；e b 下图同。 s b m i n t h e 唱孕l m 温度t c 唧m d 图4 5 0 i 丑照度下不同温度处理的石斛中f o d 、c a t 活性和m i ) a 音量的关系 魄4r c l a t i o a s h pb e t w e e n t h ep o d 、c a td t i v i t i e sa n d