（生物化学与分子生物学专业论文）抗虫基因cry2a对早粳稻的转化.pdf

中文摘要 中文摘要 黑龙江省是我国最大的优质粳稻产区，在我国的农业生产中占有举足轻重的 地位。自从1 9 9 8 年在黑龙江省哈尔滨地区的五常市稻f f j 首次发现二化螟以来，螟 虫有逐年加重危害和快速蔓延的势头，严重影响到水稻的产量。利用转基因技术 培育抗虫水稻可以有效解决水稻虫害问题。 本研究通过农杆菌介导的方法，利用可以进行转基因植物环境释放的6 a _ r 基因 作为选择标记，将经过密码子优化的、在单子叶u b i 高效启动子调控下的、抗螟虫 的研基因c 以a + 转入具有代表性的黑龙江粳稻品种中，通过基因工程技术改良黑 龙江粳稻对螟虫的抗性，创造适于寒区生态条件的抗虫转基因水稻材料，为黑龙 江水稻实现少投入、多产出、保护生态环境的生产目标进行技术储备。本研究得 到的主要结论如下： l 、对目的基因洲2 a 进行了酶切及p c r 验证，结果表明用于转化的抗虫基 因c 啦a 准确无误，可以用于农杆菌介导的黑龙江水稻遗传转化工作。 2 、对农杆菌介导的、6 口，基因为筛选标记的北方粳稻遗传转化体系进行了优 化。优化的遗传转化体系技术要点为成熟胚愈伤组织的诱导、愈伤组织继代1 次、 愈伤组织预培养、农杆菌侵染愈伤组织l0 m i n 、共培养、使用具有一定渗透势的清 菌液清菌、在含p p t1 5 m g l 的筛选培养基上筛选抗性愈伤组织、预分化、抗性愈 伤组织在含c n2 5 0 m l 的分化培养基上再生成苗、转化苗生根、炼苗和移栽到土 壤等。 3 、利用优化的农杆菌介导外源基因转化北方粳稻体系对空育1 3 1 、松粳9 号 和松粳6 号等黑龙江水稻品种进行了遗传转化工作。经过密码子优化的、u b i 调控 下的叫2 a + 基因转化空育1 3l ，获得了3 2 4 块独立抗性愈伤，移栽成活3 0 个抗性 愈伤，共1 7 l 棵转化苗；转化松粳9 号，获得了l l 块独立抗性愈伤及5 棵转化苗； 转化松粳6 号，获得了4 块独立抗性愈伤，1 4 棵转化苗。 4 、对水稻转化株t o 代进行目的基因c ，妮a 的p c r 检测，检测结果显示空育1 3l 黑龙江大学硕士学位论文 阳性率为9 8 2 ，松粳9 号和松粳6 号p c r 检测呈阳性率1 0 0 ，c 砂2 a 基因已经 整合到黑龙江水稻品种空育1 3 1 、松粳9 号和松粳6 号核基因组中。 5 、转c 啦a + 基因水稻空育1 3 1 的t l 代p p t 抗性筛选结果显示，大部分转基 因植株插入了1 个单拷贝的外源基因，或是多拷贝基因中只有1 个具有表达功能， 或多拷贝整合在1 个位点。对抗p p t 的转基因空育1 3 l 进行了i 弭p c r 检测，初 步证实了目的基因c 啦a 在转基因水稻中得到表达。 关键词： 粳稻；c 砂2 a ：转基因；p c r 检测；外源基因表达 a b s t r a c t a b s t r a c t a st h eb i g g e s ta r e ao f 。，q p d ，? j c 口r i c e i hc h i n a ，h e i l o n 卣i a n gp r o v i n c eh e l dt h e b a l a n c ef o ra g c u l t u r a ip r o d u c t i o no fo u rc o u n t r y s i n c el9 9 8 ，c 厶i 肠s 琊矽陀s s 口凰w a s 仃r s tf o u n di nt h e 行e l do fw u c h a n gc i t yo fh a r b i nr e g i o n ，i th a db e c a m em o r es e r i o u s y e a ra r e ry e a ra n ds p r e a dw i d e l yw h i c hs i g n i n c a n t l yr e d u c e dt h ey i e l do fr i c e t h e t r a n s g e n i ct e c h n i q u ec o u i db ea ne f k c t i v ew a y t os o l v et h ep e s tp r o b l e m s i nt h i ss t u d y ，b ，g e n ec 砂2 a u n d e rt h er e g u l a t i o no fu b ip r o m o t e rw i t ht h e s e l e c t i v eg e n e6 讲w a st r a n s f e r r e di n t ot y p i c a lv a r i e t i e so f ，印d ，7 f c 口r i c ei nh e i l o n 西i a n g p r o v i n c ev i a 爿g 加6 口c f 盯i “小- m e d i a t e dt m 】临f o r m a t i o n ，i no r d e rt oi m p m v et h e i rs t e m b o r e rr e s i s 拓m c e t h em a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 e n z y m ed i g e s t i o na n a l y s i sa n dp c r d e t e c t i o ni n d i c a t e dt h a tc ，y 2 a g e n ec o u l d b et r a m s f e r r e di n t ot h er i c eo fh e i l o n 由i a n gv i a 爿伊幻6 口c f p ，f “研一m e d i a t e dt r a n s f o 咖a t i o n 2 t h e 却d 胛i c 口r i c et r a n s g e l l i cs y s t e mo f 彳d 6 口c ，p ，j “肌一m e d i a t e dm m s f o 肌a t i o n h a db e e ne s t a b l i s h e db yo p t i m i z i n gm a n yf a c t o r si n v o l v i n gi nt r a n s f o 肿a t i o ne h e c t ， w h i c hw e r ec a l l u si n d u c t i o n ，c a l l u ss u b c u l t u r e ，c a l l u s p r e c u l t m e ， i n f e c t i o nt i m e ， c o c u l m r e ，u s i n gw a s h i n gs o l u t i o nw i t ho s m o t i cp o t e n t i a l ，a d d i n g 15 m lp p ti n s c r e e n i n gm e d i u m ，p r e r e g e n e r a t i o n ，a d d i n g2 5 0 m g lc ni ns c r e e n i n gm e d i u m ，m o t i n g ， a c c l i m a t i o na n dt m s f e r 3 c 昵a + g e n ew a st r a n s f e r r e di n t ot h eg e n o m eo fh e il o n 西i a n gr i c ev a r i e t i e ss u c h a sk o n g y u l 3 l ，s o n j i n 9 9a n ds o n j i n 9 6w i t ht h eo p t i m i z e d 。，q p d 玎j c 口r i c et 啪s g e n i c s y s t e mo f 爿g _ 厂d 6 口c ，p ，一f “，珂- m e d i a t e dt r a n s f o n n a t i o n 4 p c rw a sc a r r i e do u tt od e t e c tt h ei n t e g r a t i o no fc ，y 2 a g e n ei nt or e g e n e r a t i o n p l a n t s ，s h o w i n gt h a tt h em t i oo fp o s i t i v ep l a n t sw e r e9 8 2 i nk o n g y u l3 l ，l0 0 i n b o t hs o n ji n 9 9a n ds o n ji n 9 6 5 r e s i s 协n c et op p ta n a l y z i n gi nt lr e g e n e r a t i o np l a n t so fk o n g y ul3ls u g g e s t e d 黑龙江大学硕士学位论文 t h a tm o s t o ft r a n s g e n i cl i n e sf o l l o wm e n d a i i n h e r i t a n c ei a w3 ：l ， i n d i c a t i n g t h a t t r a n s g e n i cg e n ew a si n t e g r a t e di no n ei o c u so fp l a n tg e n o m e r p c ra s s a yi n d i c a t e d t h a tt h ec 啦a g e n ee x p r e s s e di nt h et i i a n s g e n i cp l a n t s k e yw o r d s ：却d 刀三c 口r i c e ；c 2 a ；t r a n s f o 肿a t i o n ；p c rd e t e c t i o n ；t r a n s g e n i cg e n e e x p r e s s l o n i v 黑龙江大学硕士学位论文 符号说明 2 ，4 一d ( 2 ，4 - d i c h l o r op h e n o x y a c e t i ca c i d ) 6 一b a ( 6 一b e n z y i a m i n o p u r i n e ) a s ( a c e t o s y r i n g o n e ) b t 幔n c i l l m sl h u r i n g i e n s b a r ( p h o s p h i n o t h r i c i na c e t y l t r a u l s f e r a s e ) c a m v ( c a u l f l o w e rm o s a i cv i r u s ) c ，y ( c 巧s t a lp r o t e i ng e n e ) c h ( c a s e i ne n z y m a t i ch y d r o l y s a t e ) c n ( c a r b e n i c i l l i n ) 2 ，4 一二氯苯氧乙酸 6 一苄基腺嘌呤 乙酰丁香酮 苏云金芽孢杆菌 膦丝菌素乙酰转移酶 花椰菜花叶病毒 晶体蛋白基因 水解酪蛋白 羧苄青霉素 c t a b ( h e x a d e c y l t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e )十六烷基三甲基溴化胺 d m s o ( d i m e t h y ls u l f o x i d e ) e d t a ( e t h y i e n ed i 锄i n et e t r a a c e t i ca c i d ) h p t ( h y g r o m y c i np h o s p h o t m s f e r a s e ) i a a ( i n d o l e - 3 a c e t i ca c i d ) i c p ( i n s e c t i c i d a lc 叫s t a lp r o t e i n ) k a n ( k a n a m y c i n ) k t ( k i n e t i n ) n a a ( n a p h t h a l e n ea c e t i ca c i d ) n p tii ( n e o m y c i np h o s p h o t r a n s f e r a s e i i ) p p t ( l - p h o s p h i n o t h r i c i n ) u b i ( m a i z eu b i q u i t i np r o m o t e r ) v l i i 一 二甲基亚砜 乙二胺四乙酸 潮霉素磷酸转移酶 吲哚乙酸 杀虫晶体蛋白 卡那霉素 激动素 萘乙酸 新霉素磷酸转移酶 左旋膦丝菌素 玉米泛素启动子 独创性声明 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得酌研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨蕉堑太堂或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。 学位论文作者签名： j 锄 签字日删年j 月，夕日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解黑龙江大学有关保留、使用学位论文的规定，有权 保留并向国家有关部门或机构交送论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权墨蕉江盔堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 学位论文作者签名：力誓 导 签字日疬沙辟y 月( 口同签字同唧年夕月。日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 第1 章前言 第1 章前言 1 1 苏云金芽孢杆菌及其杀虫晶体蛋白 1 1 1 苏云金芽孢杆菌简介 苏云金芽孢杆菌( 肋c ，淞，向厂i 馏把，? s 括，简称研) 广泛分布于土壤中，在伯 杰氏细菌鉴定手册第九版中归属为第二类第十八群，属革兰氏阳性，是芽孢杆 菌属的一个种。1 9 0 1 年，日本学者l s h i w a t a 首先发现在日本的蚕场，这种杆菌能 杀死家蚕，曾被命名为猝倒杆菌( 肋c j ，s5 d ，d ) 。1 9 1 1 年，b e r l i n e r 在德国苏云金 省( 乃，f 馏p ) 的谷仓里发现这种细菌能杀死地中海粉螟( 彳，7 臼即s 砌七甜砌沱，肠 z e l l e r ) ，故称苏云金芽孢杆菌l 2 1 。 研菌的突出特点是在其芽孢形成过程中可产生伴孢晶体，它由一种或多种蛋白 组成，具有高度特异的杀虫特性，这种蛋白通常被称作6 内毒素( 6 e n d o t o x i n s ) 或杀虫晶体蛋白( i n s e c t i c i d a lc 巧s t a lp r o t e i n ，i c p ) 。随着人们对研菌及其所产生的 杀虫晶体蛋白研究的逐步深入，研已成为一种生物杀虫剂，可以用来防治鳞翅目、 双翅目和鞘翅目某些种类的害虫。近年来，又发现研对其它目( 如膜翅目、同翅目、 直翅目和食毛目) 昆虫以及线虫、蜱螨、原生动物有毒杀活性。励可直接或配合化 学农药应用于农业、林业、卫生( 蚊子) 等害虫防治，对人畜和环境无害。同时， b f 也是抗虫转基因植物的重要基因来源i 引。 1 1 2b t 杀虫晶体蛋白及其基因的分类 1 9 8 9 年，h o n e 和w h i t e l e y 根据杀虫晶体蛋白的杀虫特异性及其氨基酸序列 的同源性，将当时发现的约4 2 种杀虫蛋白基因分为5 大类，1 4 个亚类。类型1 ( c r yi ) 抗鳞翅目昆虫( 印埘印，p 阳) ，类型1 1 ( c d ，1 i ) 抗鳞翅目和双翅目( d 驴，p 阳) 昆虫，类型i i i ( c w i i i ) 抗鞘翅目( c d 彪印，p 阳) 昆虫，类型( c r y ) 抗双翅目 昆虫，这4 类统称为晶体蛋白基因家族( c r y s t a lp r o t e i ng e n e ，c r ) ，) ；类型v 称为溶 胞蛋白基因( c ”o l 州cp r o t e i ng e n e ，c ”) 。这个分类标准的特点，就是采用了杀虫 黑龙江大学硕士学位论文 蛋白氨基酸序列和杀虫特异性的双重标准。f 随着新的杀虫璀冈的不断分离鉴定， 人们发现原有的分类系统出现了许多问题：有的杀虫蛋白高度同源，但杀虫性不 同，即杀虫蛋f 1 氨基酸序列同源性j 口杀虫特异性并不相关。这就迫切需要一个更 好的分类系统。 1 9 9 5 年，c r i c l 锄o r e 等在国际无脊椎动物病理学会年会( s i p ) 上提出了以杀 虫品体蛋白氨基酸序列的同源性为唯一依据区别b ，基冈的新分类系统，现己被各 国广泛采纳。同源性在4 5 以下，为第一等级，用阿拉伯数字表示；同源性在 4 5 7 8 之间，为第二等级，用大写英文字母表示；h 源性在7 8 一9 5 之间，为 第三等级，用小写英文字母表示；同源性在9 5 以上，为第四等级，也是最终等 级，用阿拉伯数字表示，该等级在一般情况下不用。只要满足来自b ，的伴孢晶体， 与已知的c 叫或倒，具有高的同源性，就可以纳入这个系统。目前，b ，基因己增至 5 6 群，其中c w 基因5 3 群，c ) ，基因3 群。 1 1 3b t 杀虫晶体蛋白杀虫机理 一般认为6 一内毒素的作用过程要经溶解、酶解活化、与受体结合、插入和孔 洞或离子通道形成5 个环节。当目标昆虫取食转b ，基因植物后，研杀虫晶体蛋白 随着摄食进入昆虫消化道，在碱性条件下，晶体蛋白溶解，释放出分子量为6 5 1 6 0 k d 的原毒素，原毒素无杀虫活性。在昆虫肠道碱性环境下，原毒素被胃蛋白酶水 解，c 末端被切除，水解后形成分子量为6 0 一7 0 的活性多肽，这种活性多肽就 可以与敏感昆虫肠道上皮细胞表面的特异受体相瓦作用，引起细胞膜穿孔，扰乱 细胞的渗透平衡，细胞因此肿胀甚至裂解，昆虫因拒食而饿死1 4 1 。另外一些研究表 明：b t 杀虫晶体蛋白还能麻痹昆虫的神经系统，导致昆虫死亡1 5j ：现在己证明受 体为氨肽酶n 和钙粘着蛋白( c a d h e r i n ) 类似物1 6 1 。 1 1 4 转曰，基因水稻研究概况 1 9 8 9 年，杨虹等首次报道了用原生质体电融合技术，将b ，基因导入水稻“台 粳2 0 9 ”，虽然获得的转基因植株具有一定的抗虫性，但其抗虫性很弱。这是因为 第l 章前言 研基因直接在真核生物中表达量不高，需要对其进行修饰改造，才能表现出较强 的杀虫活性l ”。1 9 9 3 年，f u i i m o t o 用原生质体电融合法获得转b f 基因粳稻植株， 研究证明经修饰的c 1 ( a ) b 基因能在转基因植株中高效表达，拼能稳定地遗传到 t 2 代，并首次提出了昆虫对b ，基因产生抗性的预防策略吲。1 9 9 4 年，h i e i 等建立 了成熟的农杆菌介导水稻成熟胚愈伤遗传转化体系，大大促进了转研基因水稻的 发展l 圳。1 9 9 6 年，w u t u l 报道了用基因枪法将c 厂) ，1 ( a ) b 基因导入籼稻“1 r 5 8 ”，指 出b t 蛋白表达量随着水稻的生长发育而呈逐渐增加的趋势1 1 0 】。1 9 9 7 年，n a y a k 报 道了用基因枪法将f 砂1 ( a ) c 基因导入籼稻“i r 6 4 ”，同时选择了玉米甜6 i 基因( 玉 米泛素转移蛋白基因) 启动子作为c 1 ( a ) c 的启动子l l l 】。1 9 9 9 年，m a q b o o l 和 c h r i s t o u 报道了用基因枪法获得了转双价b f 基因的水稻，使用的2 个b ，基因为 c 砂1 a c + c 叩a ，证实了共转化法获得转多价抗虫基因水稻的技术路线是切实可行 的f 12 1 。2 0 0 4 年，b a s h i r 将c 秽1 a c 和洲2 a 转入水稻中，并证明在转基因水稻中 u b i 启动子要优于3 5 s 启动子【13 1 。2 0 0 5 年，陈浩将咧l a c ，叫2 a 和c 垆c 分别 转入优良的水稻恢复系明恢6 3 中，利用转研基因的明恢6 3 配制的杂交稻汕优6 3 田间高度抗虫，基本不用药剂防治水稻螟虫危害1 1 4 】。 目前为止，已经有大量的转研水稻实验被报道，利用转研基因水稻防治水稻 虫害是可行的。使用的b ，基因主要为c l a 类基因，也有部分实验使用了咧l b 基因和c 以a 基因。 1 2 植物基因工程常用启动子 启动子是r n a 聚合酶能够识别并与之结合，从而起始基因转录的一段d n a 序列，通常位于基因上游。一个典型的启动子包括c a a - t - 盒和t a t a 盒，它们是 依赖d n a 的r n a 聚合酶的识别和结合位点，一般位于转录起始位点上游几十个 碱基处i l5 。在核心启动子上游通常会有一些特殊的d n a 序列，即顺式作用元件， 转录因子与之结合从而激活或抑制基因的转录1 1 。一旦i a 聚合酶定位并结合 在启动子上即可启动基因转录，因此启动子是基因表达调控的重要元件i l 引，它与 黑龙江大学硕士学位论文 r n a 聚合酶及其他蛋白辅助因子等反式作用因子的相瓦作用是启动f 调控基因转 录的实质。根据启动予的转录模式可将其分为3 类：组成型启动了、组织或器官 特异性启动子和诱导型启动子。 1 2 1 组成型启动子 组成型启动子是指在该类型启动子控制下，结构基因的表达在不同组织器官 和发育阶段没有明显差异，因而称之组成型启动子。其特点是表达具有持续性； r n a 和蛋白质表达量相对恒定；不表现时空特异性；不受外界因素的诱导；从结 构上看，大多数组成型启动子转录起始位点上游几百个核苷酸处，存在有6 聚体 回文序列t g a c t g g t i l 9 】。该序列以重复形式出现并被5 8 个核肾酸隔丌。缺失 和突变实验证明6 聚体回文序列的存在对维持c a m v 3 5 s 启动子、n o s 启动子和 o c s 启动子的活性至关重要1 2 0 1 。 在转基冈研究中，组成型启动子主要来源于病毒、植物和根瘤农杆菌。以下 仅选择在植物基因工程中得到成功应用的组成型启动子进行进一步的说明。 c a m v 3 5 s 启动子。对许多双子叶植物转基因： 作而言，最常用的一种启动子 是来自花椰菜花叶病毒( c a m v ) 的3 5 s 启动子，它具多种顺式作用元件。这种启 动子在植株被c 州v 感染期间指导3 5 sl a 合成，并且使之在许多双子叶植物的 组织中高效表达，但它是单子叶植物的一种较弱的启动子。该启动子包括t a l a 盒、 c a a t 盒、倒转重复序列和增强子核心序列4 个部分1 2 1 】。最近发现3 5 s 启动子可 以划分为2 个区域：从( 一9 0 b p 至+ 8 b p ) 为a 区域，主要负责在胚根、胚乳及根组 织内表达；区域b ( 3 4 3 b p 至9 0 b p ) 主要控制在胚的子叶及成熟植株的叶组织及 维管组织内表达。在b 区域内的增强予序列叮以提高表达水平，如果3 5 s 启动子 中存在2 个b 区将能使3 5 s 启动子的活性提高l o 倍，并对异源启动子也有作用。 值得注意的是对某些启动子，b 区起到表达的阻遏因子作用。 u b i q u i t i n 启动子。泛素( u b i q u i t i n ) 是。一种广泛存在于动物、植物和细菌中 的高度保守的蛋白。玉米泛素蛋白基因( 甜6 研“i ，砌) 启动子也是一个在植物基因工 程中广泛使用的组成型强启动子。1 9 9 2 年，c “s t e n s e n 等人从玉米中分离到了两 第1 章前言 个玉米泛素蛋自基因甜6 j 一1 和甜6 i 一2 。其中，“6 i 1 的含量比较高，因而对它的启动 子进行了深入的研究，研究证明u b i 1 启动子包含了真核基因启动子所共有的一些 一顺式作用元件1 2 引。将u b i 一1 启动二f 应用到单子叶植物中，驱动目的基因表达，发现 具有很高的表达活性。有研究表明u b i 1 启动子在转基因玉米细胞和小麦悬浮细胞 中都有较高的启动活性1 2 2 彩】。在转基因单子叶植物中，u b i 1 启动子的活性有时可 以比c a m v3 5 s 启动子的活性高1 0 倍左右。不过，在双子叶植物中，其活性又远 不如c a m v3 5 s 启动子i z 4 j 。对u b i 一1 启动子的结构进行分析，在3 0 b p 处有一个典 型的t a t a 盒，在u b i l 启动子中没有发现典型的c a a t 盒。在u b i 一1 启动子的1 1 0 至9 6 区域有一个1 5 b p 的富含嘧啶的序列( c c t c c t c c t c c t c t c ) ，而在1 至3 9 区域也有一个富含嘧啶的序列( c t t t c c c t t c c t c ) 。这些c t 交替排列的区域究 竟是否有功能或具有何种功能，目前还在研究之中。 n o s 和o c s 启动子。来源于根癌农杆菌t j 质粒t - d n a 区域的胭脂碱合成酶 基因( 胛) 和来自章鱼碱合成酶基因( o 铅) 的启动子分别简称为n o s 和o c s 启动 子。虽然n o s 和0 c s 启动子来自细菌，但都具有与植物基因相似的共有序列。在 转录起点上游3 0 4 0 b p 处它们都含有与t a t a 盒同源的序列；位于5 末端上游 6 0 8 0 b p 处也有类似的c 丸盯盒的序列，因此具有植物启动子的特性【1 5 】。值得注意 的是，n o s 和o c s 启动子也具有一定的损伤诱导和激活诱导活性。另外还发现， n o s 启动子的强度依组织部位及器官位置不同而变化，在老组织内通常比新生组织 中强。 1 2 2 组织特异性启动子 组织特异性启动子也称之为器官特异性启动子，其调控基因只在某些特定的 部位或器官中表达，并往往表现出发育调节的特性。这种特异性通常以特定的组 织细胞结构和化学、物理信号为基础。因此，这类转录调控序列与诱导型启动子 有一定的共性。 在植物抗虫基因工程研究中，为了使外源基因在受体生物中高效表达，必须 借助于高活性的启动子。但在许多情况下，外源基因在受体植物中非特异性地持 黑龙江大学硕士学位论文 续、高效表达不但造成物质能量浪费，而且也为耐受害虫种群的产生提供了持续 的选择压力。为了更经济有效地发挥外源基因的作用，避免綦因产物对受体生物 及环境产生副作用，针对害虫侵害部位的不礼选择组织或器官特异。陀启动子， 如韧皮部特异、块茎特异、叶特异、种子特异和根特异等启动：f ，使抗虫基因只 在特定的组织或器官中表达，可以更为有效地达到抗虫的目的。研究基因表达的 特殊形式，以最终实现按人们的意愿，定时、定位乃至定量地在生物体中表达外 源基因的研究，j f 成为现代分子生物学研究的热点之。所以，在今后的植物抗 虫、抗病基凶工程研究中，这类启动子将会越来越广泛地得到应用。 对组织特异性启动子的结构已进行了较为深入的研究，发现它们除了具备一 般启动子的结构特点之外，还具有一些特殊的结构，如a t 富含序列、组织特异性 序列和沉默区。a t 富含序列一般都有核心基序a t t a ( t ) a a t ，且它一般都与转录 活性有关。在大多数启动子中，a t 富含序列都和基因表达的正调控有关，但也有 的是作为负调控因子。 1 2 3 诱导型启动子 所谓诱导型启动子就是在某些特定的物理或化学信号的刺激下，此种类型的 启动子可以大幅度提高基因的转录水平。它们有以下共同特点：启动子的活化受 物理或化学信号的诱导；具增强子、沉默子或类似功能的序列结构；感受特异性 诱导的序列都有明显的专一性；一部分该类型的启动子同时具有组织特异性表达 的特点；该类启动子常以诱导信号命名，可分为光诱导表达基凶启动子、热诱导 表达基因启动| 子【2 5 】、创伤诱导表达基冈启动子、激素诱导表达基因启动予、真菌 诱导表达基凼启动子和共生细菌诱导表达基因启动子等1 2 引。 根据目前的资料，诱导型启动子可分为3 种类型：a 型启动子，可以被生长 素、脱落酸等植物生长物质及创伤诱发所产生的系统素所诱发1 27 j ；b 型启动子， 由高温、低温、高盐、重金属等环境因子诱导1 2 剐；c 型启动子，是指能够对人工 合成的化学诱导物如四环素、b e n z o t h i a c l i a z 0 1 e 等发生反应1 2 9 j 。迄今为止，利用上 述启动子获得的转基因植株能应用于生产实际的还比较少。 第1 章前言 1 3 水稻转化常用筛选标记基因 筛选标记基因的主要功能是其编码的产物可以使转化体对某些选择剂产生抗 一 一 一 一 性，使其在特定的培养基中具有生长优势，从而被选择出来。目前用于水稻转化 的筛选标记基因实际上可以分为2 类，一类是以新霉素磷酸转移酶基因印，l l 和潮 霉素磷酸转移酶印，基冈为主的编码抗生素抗性的基因，另一类是以来源于吸水链 霉菌的6 口，基因为主的编码除草剂抗性的基因。 1 3 1 叩，i i 早期的水稻遗传转化工作均采用印，l l 作为筛选标记1 3 0 圳】，其表达产物可以拮 抗卡那霉素。卡那霉素在原生质体再生中可用作筛选剂，但对转基因愈伤组织的 筛选却不甚有效，而且卡那霉素筛选得到的愈伤组织很多不能再生出绿色植株1 3 2 1 。 1 3 2 卸， 幼，能表达对氨基糖苷类抗生素潮霉素b ( h y g ) 的抗性，是转基因水稻 实验中广泛使用的一种筛选标记。潮霉素能更有效的区别转化与未转化的组织， 并且不会导致白化和不育等问题，因此潮霉素是一种非常有效的筛选剂1 9 1 。 1 3 36 口， 在基因工程研究中，抗生素一直被用来作为筛选标记系统。但是，以抗生素 做选择标记时，往往存在着一些不足。比如，由于植物对抗生素不够敏感而导致 假阳性体的比例较大；抗生素抗性基因还存在着可在土壤微生物乃至动植物中扩 散的危险。正因为抗生素抗性基因潜在的生态危险，转基因食品安全性受到了广 泛关注。 6 口厂基因编码膦丝菌素乙酰转移酶，该酶能使膦丝菌素p p t 等草丁膦类除草剂 乙酰化而失活，从而使转基因植株获得对除草剂的抗性。6 口，基因是植物尤其是禾 谷类植物转化中一个非常有效的筛选标记基因，已经成功应用于多种转化研究中 【3 3 1 。以6 口厂基因作为选择性标记有以下优点：6 口，基因不会污染农业生态环境，比 黑龙江大掌硕士掌位论文 较安全、可靠；与6 口r 基因标记配套的筛选凶子除草剂农药已在我国批量，- 产， 多 儿价格低廉；已克隆的6 卯基因较多，可直接 j 于选择标记的丌发，丌发费用低： d i 于卡i i 物对除草剂极其敏感，用6 日- r 基因做选择标记，并以相应的除草剂进行带有 f 1 的基凶的植物转化体的筛选，比现有的抗生素标记的筛选更为直接、有效，不 会产生过多的假阳性结果1 3 4 】。 1 4 密码子偏爱性及b ，基因密码子优化 1 4 1 密码子偏爱性 密码子是核酸携带信息和蛋白质携带信息问对应的基本规则，是生物体内信 息传递的基本环节。遗传密码有6 4 种。在组成蛋白质的2 0 种氨基酸中，只有甲 硫氨酸和色氨酸仅对应唯一的密码子( 分别为a u g 和u g g ) ，其余18 种氨基酸 均拥有2 至6 种不同的密码子，这些编码相同氨基酸的不同密码子称为简并密码 子。密码子的简并性使得一种蛋白可以采用多种不同的核苷酸序列编码，不同的 生物甚至同种生物不同的蛋白编码基因，对于同一氨基酸所对应的简并密码子， 使用频率也不相同f 3 5 】。那些利用率最高的称为最佳密码子( o p t i m a lc o d o n s ) ，利用 率低或不被经常利用的称为稀有密码子( m r ec o d o n s ) ，这种现象称作遗传密码偏 爱性( c o d o nu s a g eb i a s ) 。 密码子的偏爱使用广泛存在于原核和真核生物的编码基因中，并随物种、细 胞器、基因的不同而不同，甚至在同一基凶的不同区域中也有差别。研究发现影 响密码予偏爱性的因素有很多，如碱基组成的差异3 6 1 、自然选择( 体现在基因表 达水平上) | 3 7 j 、t r n a 丰度1 3 8 l 、基因长度| 3 9 1 、m r n a 二级结卡勾1 40 1 ，每个蛋白的疏 水性水平以及氨基酸保： 性1 3 6 】等等。由于密码子使用的偏爱性，选择宿主所偏爱 的密码子对基因进行点突变或重新合成基冈，是基因表达研究者常常采用的一种 策略。 第1 章前言 1 4 2 男，基因密码子优化 野生型b ，基因在植物中的表达量偏低，难以或几乎检测不到晶体蛋白的表达， 主要是因为留门来自微生物，与植物基因结构有显著差异。野生型b ，基因的m r n a 一 含有大量的a t 序列，类似于植物的内含子可能引起m r n a 的剪切；并隐含一些 特殊的序列，如a t l v r a 序列( 在真核系统内可能引起转录产物的不稳定) 、植物 p o l y ( a ) 信号序列( 可能引起外源基因在其转基因植物中转录提前终止) 、内含子切 割序列c a l l g 、修饰序列、终止序列等，以上因素都可能造成b t 杀虫蛋白m r n a 在不适当的位置上断裂，引起b t 杀虫蛋白m r n a 代谢速度过快；另外，b t 杀虫 蛋白m r n a 的二级结构、m r n a 转译起始位点周边序列等也与植物不同，这也可 能造成b t 杀虫蛋白表达水平低下：此外野生型b ，基因是微生物基因，在蛋白质编 码过程中相应的一些t r n a 含量过少，也显著降低其翻译效率。将研基因在不改 变氨基酸序列的前提下，用植物偏爱密码子进行优化设计，增加基因的g c 含量， 去除不合适的拼接位点及会导致m r n a 降解的不稳定元件【4 1 1 ，并尽量减少在高等 植物中罕见的x c g 及x t a 密码子1 4 2 1 ，重新进行化学拼接合成，然后将其导入植 物中，其表达量能够大大增加。 c 川a 可以作用于鳞翅目和双翅目的昆虫，目前在农业生产上使用较少，在水 稻的转化育种中更是少见。咧2 a 以原始的明尼a 为蓝本，在不改变氨基酸序列的 前提下对密码子进行优化，优先使用水稻偏爱密码子，一般是将密码子的第三位 a t 变为g c ，尽量减少在高等植物中罕见的x c g 及x t a 密码子，消除了原始 d n a 序列中的富含a t 序列和存在的反向重复序列以及不明确的真核d n a 内含子 序列，并在编码序列的5 端添加有引导序列和3 端添加加尾识别信号序列，然后用 化学合成法合成1 4 3 1 。 1 5 本研究的目的及意义 黑龙江省是我国最大的优质粳稻产区，也是国家绿色商品粮生产基地，在我 国的农业生产中占有举足轻重的地位。自从19 9 8 年在黑龙江省哈尔滨地区的五常 黑龙江大学硕士学位论文 市稻兀1 首次发现一一化螟以来，螟虫有逐年加重危害和快速蔓延的势头，已成为黑 龙江省水稻生产中的重要害虫。2 0 0 7 年，黑龙省水稻播种面积达2 2 0 多万h m 2 ， 其中受虫害i 葡积达2 7 多万h m 2 ，受害株被害损失率高达_ 5 0 1 0 0 ，严重影响到 水稻的产量。凶此，有效地控制螟虫对我省水稻增产有着十分重要的意义。 传统化学防治方法的长期使用，不但增加生产成本，造成环境污染，破坏生 态平衡，而上上还埘人、畜健康危害严重，害虫也产生了抗药性。因此在我省提侣 绿色水稻的背景下，通过育种的手段增强水稻自身的抗虫性从而选育出抗螟虫水 稻是防治螟虫最经济、有效的方法。但是，水稻及其近缘种中不存在对螟虫的抗 性基因资源，通过传统的育种方法不可能培育出对螟虫高抗的品种。因此，发展 转基因水稻势在必行。 本研究通过农杆菌介导的方法，利用可以进行转基因植物环境释放的6 口r 基因 作为选择标记，将经过密码子优化的、在单子叶u b i 高效启动子调控下的、抗螟虫 的8 f 基因f 啦a 转入具有代表性的黑龙江粳稻品种中，通过基因工程技术改良黑 龙江粳稻对螟虫的抗性，创造适于寒区生态条件的抗虫转基因水稻材料，为黑龙 江水稻实现少投入、多产出、保护生态环境的生产目标进行技术储备。 第2 章材料与方法 2 1 植物材料 第2 章材料与方法 遗传转化受体植物材料为典型的黑龙江省水稻主栽品种或超级稻品种，具体 包括空育1 3 1 ( d 垆日s 口，阳l s u b s p 却d ，? j c 口) 、五优稻1 号( 铆加s 口，i v 口 l s u b s p ，( 矽d ，? f c 口) 、松粳9 号( c ) ，) ，z 口s 日，i v 口l s u b s p ：印o ，7 f c 口) 、松粳6 号( 1 二 ，) z 口s 口，i v 口 l s u b s p ：，印d ，? f f 口) 和龙粳1 4 ( d 叼眩口s 口，i v 口l s u b s p ：，印。胛i c 口) 等，所有实验用水稻 材料成熟种子由黑龙江省普通高等学校分子生物学重点实验室提供。 2 2 细菌菌株 大肠杆菌( e ，i ) 菌株d h 5 0 【，由中国科学院遗传与发育生物学研究所吴乃 虎教授惠赠。 农杆菌( 彳g r 0 6 口c ，p ，i 甜坍，材脚庙c 沱瑚) 菌株e h a l 0 5 ，为携带卸甲质粒p t i b 0 5 4 2 的农杆碱型菌株。e h a l 0 5 菌株由黑龙江省普通高等学校分子生物学重点实验室保 存。 2 3 基因、质粒和植物表达载体 用于转化的抗虫b ，基因c 叩a + 与原始卵应ad n a 序列比较，植物偏爱性密码 子的使用频率较高，消除了原始d n a 序列中的富含a t 序列和存在的反向重复序 列，以及不明确的真核d n a 内含子序列，在编码序列的5 端添加有引导序列和3 端添加加尾识别信号序列，c + g 含量为5 9 0 4 。c 啦a + 基因与c 啦a 基因d n a 同源性为6 9 4 5 ，编码蛋白的氨基酸组成不变。用化学合成法合成删2 a ，合成 的c w 2 a + 序列带有0 3 k b 的n o s 终止子。基因合成完毕后测序，结果证明d n a 序列与原始设计的序列1o o 一致1 4 1 。c 啦a + 构建于质粒载体p u c l8 上，形成 p u c l8 明应a ，c 啦a 两侧带有b 乜聊h i 位点。 质粒p b a r l3 是在质粒p c a m b i a l 3 0 0 基础上改造而成的。原始p c a m b i a l 3 0 0 1 1 黑龙江大学硕士学位论文 载体 ：的筛选标i 己为潮霉鬃抗性( 办p ，) 基因。用抗除草剂6 缈基冈，即膦丝菌素 乙酰转移酶鉴i 夭】箭换了细，基因作为筛选基凶，得到的新载体命名为p b a r l 3 。 采用，打门d i l l 和b 彻7 h l 双酶切，将u b i 启动子从p u b c 质粒上切下来( u b i 启 动子作用方向为所，7 d 川位点一肋所h i 位点) ，构建于p b a r l3 多克隆位点上，形成 p b a r l 3 u b i 中f u j 载体。载体p b a r l 3 u b i 质粒的t - d n a 区结构见图2 1 ( a ) 。 a b m c s 日f 州川 加d 1 1 1 图2 1p b a r l 3 u b i ( a ) 和p b a r l 3 一u b i c 秒2 a ( b ) 的t - d n a 区结构 f i g 2 1t d n ar e g i o n so fp b a r l 3 一u b i ( a ) a n dp b a r l 3 一u b i c j l ) ，2 a ( b ) m c s 示多克隆位点，l b 示左边界，r b 示右边界，u b i 示玉米泛素蛋白基因启动子，3 5 s 示花 椰菜花叶病毒3 5 s 蛋白基因启动子，t n o s 示朋脂碱合成酶基因终止子，6 口厂示膦丝菌素乙酰 转移酶基因，c 啦a 示密码子优化的苏云金芽孢杆菌毒蛋白基因c 彬a m c s ，m u l t i p l ec l o n es j t e ；l b ，l e rb o r d e r ；r b ，r i g h tb o r d e r ；u b i ，m a j z eu b i q u i t i np r o m o t e r ； 3 5 s ，c a u l n o w e rm o s a i cv i r u s3 5 sp m m o t e r ；t n o s ，n o p a l n es y n t h a s eg e n et e 硼i n a t o r ； 6 口_ r ，p h o s p h i n o t h r i c i na c e t y l t r a n s f e r a s e ；c 秒2 a ，b ，g e n ec 砂2 aw i t hc o n d o nb i a s 用肋册h 1 将c 砂2 a 基因从p u c l 8 c 秒2 a 质粒上切下来，构建于p b a r l 3 一u b i 中间载体肋m h l 位点上。通过测序挑选叫2 a 基因具有正确插入方向的克隆，构 建了植物表达载体p b a r l 3