（内科学专业论文）靶向smad3基因的sirna筛选及其慢病毒载体的构建.pdf

靶向s m a d 3 基因的s i r n a 筛选及其慢病毒载体的构建 摘要 转化生长因子1 3 ( t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o rp ，t g f p ) 和激活素 a ( a c t i v 烈a ) ，均为多功能的细胞因子，两者的信号途径及相关 功能也是近年来的研究热点。以往的研究表明，t g f d a c x i v i na 与细胞的增殖、分化、迁移及凋亡有关，在机体中参与了从炎症反应、 组织修复到胚胎发育等一系列重要的生物学过程，并与某些人类疾病 的发生密切相关。特别是在肝脏中，该信号通路的异常与肝炎、肝纤 维化、肝硬化肝癌以及肝再生都有密切关系。因此对于该通路的研究 具有十分重要的生物学意义，而对其各组分相互作用蛋白的研究将是 阐明其功能及调控机制的关键所在。本研究旨在构建以 t g f 1 3 a c t i v i na 下游蛋白s m a d 3 为靶点的短发夹r n a ( s h o r t h a i r p i nr n a ，s h r n a ) 慢病毒表达载体，为进一步探索肝再生机制提 供有力工具。目的：为研究阻断s m a d 3 信号传导、抑制肝细胞凋亡 和促进肝细胞再生，筛选出针对大鼠s m a d 3 基因的s i 对妊片段后， 构建靶向s m a d 3 基因的r n a i 慢病毒载体质粒，产生稳定转录大鼠 s m a d 3s h r n a 的慢病毒，并感染大鼠正常肝细胞b r l 3 a 。方法： 根据s m a d 3 基因设计并合成6 对s i r n a ，转染大鼠正常肝细胞株 ， b r l 3 a ，抽取总蛋白用w e s t e r nb l o t t i n g 方法筛选干扰效率较高的1 对s i r n a 。根据筛选的s i r n a 设计并合成可表达s h r n a 的s s d n a ， 经退火制备相应d s d n a ，连接入经x h o i 和h p a i 双酶切线性化的慢 病毒载体质粒p l l3 7 载体，经酶切鉴定，阳性克隆测序，质粒抽提， 与慢病毒包装质粒p r r e ，p r e v ，v s v g 四质粒由c a c l 2 导入人胚肾 细胞株2 9 3 f t 生成慢病毒。收集包含有病毒的上清，感染靶细胞， 荧光显微镜观察细胞荧光。结果：根据w b 结果分析，成功筛选出一 条具有较高效率靶向s m a d 3 基因的s i r n a 。经酶切、测序分析证实 目的序列成功连接到载体上，载体构建成功，包装成功。成功感染 b r l 3 a 细胞。结论：成功构建并筛选了携带有大鼠s m a d3 基因的 r n a i 慢病毒载体及有效靶点，为进一步研究s m a d 3 在肝再生中的 作用提供了实验平台。 关键词：r n a 干扰；s m a d 3 慢病毒载体；肝再生 p r e p a r a t i o nf o rr e c o m b i n a n tl e n t i v i r u se x p r e s s i n gs e l e c t e dr a t s m a d 3s i r n a a b s t r a c t ：t g f 一1 3 ( t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o rp ) a n da c t i v i n a r et w om u l t i p l ef u n c t i o nc y t o k i n e sa n dt h es t u d i e so ft h e i rs i g n a l i n g m e c h a n i s mb e c o m em o r ea n dm o r eh o t r e c e n tr e s e a r c hs u g g e s t e dt h a t t h ef u n c t i o n so ft g f - 1 3 a c t i v i na s i g n a l i n gp a t h w a y si n c l u d ec e l l p r o l i f e r a t i o n ，d i f f e r e n t i a t i o n ，c e l lm i g r a t i o na n da p o p t o s i s i nd i f f e r e n t o r g a n s ，t h i sc y t o k i n e ss e e m e dt ot a k ep a r ti nv a r i o u sp h y s i o l o g i c a la n d p a t h o l o g i c a lp r o c e s s e s a sw ek n o w , t h ei n f l a m m a t i o nr e a c t i o n ，t i s s u e r e p a i r i n ga n de m b r y o n i cd e v e l o p m e n ta r ea l lr e l a t e dt ot g f 1 3s i g n a l i n g i ns o m ec a s e s ，t h em u t a n to ft h i sp a t h w a y sc o m p o n e n tc o u l dr e s u l ti n c e r t a i nh u m a nd i s e a s e s ，e s p e c i a l l yi nl i v e r f o re x a m p l e ，h e p a t i t i s ，l i v e r 一 。 一一 一 t m r o s l s ，h e p a t o c i r r h o s i s ，l i v e rc a n c e ra n de v e nl i v e rr e g e n e r a t i o nw e r e a l r e a d yp r o v e dt ob ec o n c e m e dw i t ht g f - ps i g n a l i n gp a t h w a y a n do n e g o a lo ft h i sr e s e a r c hi st or e a l i z eh o wt h ep r o t e i n si nt h i sp a t h w a ya r e o r g a n i z e da n dw h a tk i n do fi n t e r a c t i o nn e t w o r kt h e yb u i l d t h ep u r p o s e o ft h i s s t u d yi st oc o n s t r u c ts h r n a ( s h o r th a i r p i nr n a ) e x p r e s s i o n l e n t i v i r a lp a r t i c l et a r g e t i n gt or a t s m a d 3p r o t e i n t h i ss t u d y p r o v i d e sa p o w e r f u lt o o lf o rf u r t h e re x p l o r i n gan e wg e n et h e r a p yw a yo fl i v e r r e g e n e r a t i o ni nt h ef u t u r e o b je c t i v e ：f o rt h er e s e a r c h i n go ft h eb l o c k a g e o fs m a d 3s i g n a lt r a n s d u c t i o na n di n h i b i tt h ea p o p t o s i so fh e p a t o c y t e s 3 t h a tb ec u t b yx h o l a n d h p a i t h e nt h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a s t r a n s f o r m e di n t o c o m p e t e n tc e l ld h 5 a a f t e rs e q u e n c ea n a l y s i s f o r v e r i f i c a t i o no ft h ep o s i t i v ec l o n e s ，t h ep l a s m i dp l l3 7s m a d 3 s h r n a w a se x t r a c t e da n dt r a n s f e c t e di n t oc a c l 2 t r e a t e dd h 5q c e l l st oo b t a i n t h ev i r a lv e c t o r sc o n t a i n i n gt h er n a is e q u e n c e b r l 3 ac e l l sw e r e i n f e c t e dw i t hl e n t i v i m sc a ne x p r e s ss m a d 3s h r n a t h el e n t i v i u sw a s u s e dt oi n f e c tt h er a t h e p a t o c y t el i n eb r l 3 a ，a n df l u o r e s c e n tw e r e o b s e r v e db yf l u o r e s o p y r e s u l t s ：t h s i r n agetingo b s e r v e db yi l u o r e s c e n c em i c r o s c o o y r e s u l t s eb e s ts ia ：i h s m a d 3m r n aw a sb es e l e c t e ds u c c e s s f u l l yb yw e s t e r n b l o t t i n ga n a l y s i s t h er e c o m b i n a n tv e c t o rw a ss u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e da sc o n f i r m e db y s e q u e n c ea n a l y s i s t h ev i r e sw a so b t a i n e d ，a n dt h e ni n f e c tb r l 3 ac e l l s s u c c e s s f u l l y c o n c l u s i o n ：t h er e c o m b i n a n tl e n t i v i r a lp l a s m i df o rr n a i o fs m a d 3g e n eh a sb e e ns u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e d ，w h i c hp r o v i d e st h e 4 5 上j l _ 一 月i j吾 在临床实践中，重型肝炎死亡率高。肝脏具有强大的再生能力， 然而肝再生过程常常被抑制，如何促进启动持久和强大的肝再生，对 于重型肝炎的自然康复有着重要意义。肝脏再生过程是一个非常复杂 而且被精确调控的过程，多种细胞因子参与启动、维持和终止肝再生。 阻断肝再生过程中的抑制性信号通路，从而促进肝再生是目前研究的 热点之一。 t g f p 和a c t i v i na 是重要的肝再生抑制性细胞因子，它们通 过s m a d 蛋白信号通路实现细胞内信号转导，起到抑制肝细胞增殖 和促进肝细胞凋亡的作用。其中s m a d 3 是t g f p 和a c t i v i na 在 s m a d 信号通路中共同的关键信号蛋白。通过特异性阻断s m a d 3 蛋 白表达，解除t g f p 和a c t i v i na 的抑制作用，从而可以起到促进 肝细胞增殖及肝再生，提供肝衰竭不需肝移植而自然康复的治疗方 法。本研究拟在构建靶向s m a d 3 的可内源性高效表达的短发卡状 r n a ( s h r n a ) 的慢病毒表达系统，为在体外培养的肝细胞和动物实 验中进一步探讨干扰s m a d 3 蛋白表达对t g f 1 3 a c t i v i na 信号的 阻断作用和对肝细胞增殖、肝再生的影响，从而为急性重型肝炎肝衰 竭治疗提供新的思路。 、 r n a 干扰( r n ai n t e r f e r e n c e ，r n a i ) 技术是近年来发展起来的 一种基因阻断技术，可以高效特异的阻断基因表达，较之单链反义寡 核苷酸、核酶和脱氧核酶具有独特的、高效的基因表达调控效果u - - 4 1 。 目前s i r n a 已应用于体内进行抗肝炎病毒或肝衰竭的治疗研究【5 ，6 1 。 慢病毒载体是由h i v 1 改建的复制缺陷型病毒，具有可感染分 裂细胞和非分裂细胞，免疫反应小等优点，适于体内基因研究。还可 以通过将其携带的基因片段整合到宿主细胞的基因组，实现目的基因 的稳定表达，而且感染效率高、免疫原性低，是具有广阔应用前景的 r n a i 载体7 1 。本实验构建重组大鼠s m a d 3s h r n a 的慢病毒载体， 完成了病毒颗粒的包装，为进一步研究阻断s m a d 3 基因对肝再生的 影响及对肝脏疾病的治疗奠定基础。 材料与方法 1实验材料与仪器 1 1 主要试剂及材料 载体质粒p l l 3 7 慢病毒包装质粒p r s v ，p r r e ，包膜质粒v s v g ( 水泡性口炎病毒g 糖蛋白，p c m v v s v g ) 由北京佑安医院人工肝 科实验室保存。大鼠肝细胞b r l 3 a 购自中国科学院。人胚肾细胞 2 9 3 f t 由中国科学院动物所林海燕教授惠赠。 慢病毒载体p l e n t l o x3 7 图1 慢病毒载体p l e n t i l o x3 7 结构示意图 f i g 1s t r u c t u r eo fl e n t i v i r u sv e c t o rp l e n t i l o x3 7 p l e n t i l o x3 7 ( p l l 3 7 ) 质粒是一种慢病毒载体质粒，由h w - 1 病毒改 建而成，全长7 6 5 0 b p ( 不含s h r n a 结构) 。在h p a i 和x h o i 两个酶切 位点之间，可插入发卡状s i r n a ( s h r n a ) ，以u 6 启动子启动s h r n a 的表达。 限制性核酸内切酶x h o l 和h p a l日本t a k a r a 公司 t 4 连接酶日本t a k a r a 公司 质粒中提试剂盒 美国o m e g a 公司 d n a 纯化回收试剂盒 胎牛血清 高糖d m e m 培养基 r i p a 1 6 4 0 培养基 青霉素钠 硫酸链霉素 胰蛋白酶 e d t a ( 乙二胺四乙酸) 琼脂糖 胰蛋白栋 兔抗大鼠a n t i s m a d 3 单克隆抗体 兔抗大鼠a n t i a c t i n 单克隆抗体 辣根过氧化酶标记羊抗兔二抗 大肠杆菌d h 5 a l i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 ，p v d f 膜 b c a 蛋白浓度测定试剂盒 2 主要实验仪器 电泳仪，转膜仪 双人单面垂直净化工作台 8 0 超低温冰箱 紫外分光光度计 德国q i a g e n 公司 美国i n v i t r o g e n 公司 美国i n v i t r o g e n 公司 美国i n v i t r o g e n 公司 华北制药股份有限公司 华北制药股份有限公司 美国i n v i g o g e n 公司 美国s i g m a 公司 英国o x o i d 公司 英国o x o i d 公司 美国p e p r o t e c h 公司 美国p e p r o t e c h 公司 北京中杉金桥公司 由本实验室保存 美国i n v i t r o g e n 公司 m i l l i p o r e 公司 北京博奥森生物技术有限公司 美国b i o r a d 公司 苏州净化仪器设备公司 日本三洋公司 美国b i o r a d 公司 二氧化碳培养箱 低温台式离心机 稳压稳流电泳仪( d y h i i i ) m i u i q 纯水仪 低温超速离心机 3 主要试剂的配制 美国t h e r m o 公司 美国b e c k m a n 公司 北京六一仪器厂 美国m i l i p o r e 公司 美国b e c k m a n 公司 3 1 磷酸盐缓冲液( p b s ) ：i 4 4 9n a 2 h p 0 4 ，0 2 4 9k h 2 p 0 4 ，8 9n a c l 和o 2 9k c l 溶于8 0 0 m l 新鲜制备的双蒸水中，用h c l 调节p h 至7 4 ， 定容至l l ，高压蒸汽灭菌2 0 分钟后室温保存； 3 20 2 5 胰酶0 5 3 m me d t a ：0 0 5 9 胰酶，0 0 1 5 9 e d t a ( 分子 量3 7 2 ) 溶于新鲜制备的三蒸水中，0 2 2 1 m a 滤膜过滤除菌，分装后- 2 0 。c 保存； 3 22 9 3 f t 细胞完全培养基的配制：无菌条件下，9 0 m l 高糖型 d m e m 培养液中，加入1 0 m l f b s ，同时加入青霉素、链霉素，使f b s 的终浓度为1 0 ，青霉素和链霉素的终浓度各为1 0 0 i u m l 。该培养 基使用前临时配； 3 2 o 1 m 氯化钙溶液：2 0 0 m l 去离子水中溶解5 4 9c a c l 2 6 h 2 0 ， 用孔径0 2 2 1 x i 的微孔滤膜过滤，2 0 m l 瓶分装后，4 c 保存备用； 3 5 琼脂糖凝胶电泳液( 5 0 x t a e ) ： i r i s 碱2 4 2 9 ，冰乙酸5 7 m l ， 0 5 m o l le d t a ( p h8 o ) l o m l ，加水至1 0 0 m l ，室温保存； 3 6 1 琼脂糖凝胶2 0 0 m g 琼脂糖加入2 0 m l1 t b e 电泳缓冲 液； l n 3 7l b 液体培养基 蛋白胨 酵母提取物 n a c l 1 0 9 5 9 1 0 9 溶于8 0 0 m l 去离子水中，用n a o h 调p h 至7 5 ，加去离子水至 总体积1 升，高压蒸汽灭菌2 0 分钟； 3 8 l b 固体培养基l b 液体培养基中每升加1 5 9 琼脂粉，高压 灭菌，待其冷却至5 0 c 左右时加入卡那霉素至终浓度为3 0 9 9 m l ，混匀 后铺板。 4 实验方法 4 1 体外培养大鼠正常肝细胞及人胚肾细胞2 9 3 f t 4 1 1 细胞复苏 ( 1 ) 打开恒温水浴箱，将水加热至3 8 ； ( 2 ) 从液氮罐中取出冻存管，立即投入水浴箱中并不时搅动令其尽 快融化( 约1 - 2 m i n ) ； ( 3 ) 冻存管中液体融化后取出，用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再 拿入超净台内，吸出细胞悬液，注入已消毒的无菌离心管中； ( 4 ) 向试管中缓慢滴加入高糖d m e m 培养基至8 m l ，摇动试管约2 分钟，混均后以1 , 0 0 0 r p m 的离心力离心5 分钟，弃上清； ( 5 ) 再加入8 m l 含1 0 胎牛血清高糖d m e m 培养液重新轻轻悬浮 细胞，置1 0 0 m l 培养瓶中，于3 7 。c 、5 c 0 2 孵箱中培养； ( 6 ) 次日观察，细胞已贴壁生长，更换培养液，继续培养。 4 1 2 大鼠正常肝细胞及人胚肾细胞2 9 3 f t 的培养 l l 弃去肝细胞及2 9 3 f t 细胞培养瓶中的上清液，加入适量含有 1 0 f b s + p s 的r p m i 1 6 4 0 培养基，放置于3 7 c 、5 c 0 2 孵箱中培 养，根据细胞生长情况1 2 天换液一次，2 3 天细胞铺满培养瓶底， 亚融合后进行传代。 4 1 3 大鼠正常肝细胞及人胚肾细胞2 9 3 f t 的传代( 胰酶消化法) ( 1 ) 3 7 预热培养基，p b s 和胰酶； ( 2 ) 细胞约达8 0 融合后，小心吸出旧培养液，用无菌的p b s 清 洗( 冲洗) ，以去除残余的血清； ( 3 ) 加入0 2 5 的胰蛋白酶液2 m l ，注意消化液的量以覆盖整个 瓶底为准，最佳消化温度是3 7 c ，静置约2 m i r a ( 4 ) 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回 缩，快变圆，边缘模糊时，细胞之间不再连接成片，表明此 时细胞消化适度； ( 5 ) 吸弃消化液加入培养液：将培养瓶倒置，吸弃胰蛋白酶液， ( 注意更换吸管) ，轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量 新鲜的培养液； ( 6 ) 吹打分散细胞：用吸管上下吸放数次以打散细胞团块，动作 要轻柔，将已经消化细胞吹打成细胞悬液，( 注意尽量不要有 气泡) ； ( 7 ) 分装稀释细胞：将细胞悬液吸出分装至2 3 个培养瓶中，加 入适量培养液至5 m l ，适当旋松瓶盖； ( 8 ) 置3 7 c 、饱和湿度、5 c 0 2 孵箱中培养，传代后的细胞在 约1 h ，使o d 6 0 0 达到o 3 o 4 ； ( 4 ) 冰浴2 0 m i n ，转移分装于预冷的5 0 m l 离心管，4 。c ，5 0 0 0 r p m 离心1 5 m i r a ( 5 ) 弃上清，每管加入2 0 m l 冰冷的o 1 m 氯化钙； ( 6 ) 冰浴2 0 3 0 m i n 后，4 。c ，5 0 0 0 r p m 离心1 0 m i r a ( 7 ) 弃上清，用o 1 mc a c l 2 2 4 m l 重悬细菌，轻轻混匀后，加入0 6 m l 无菌甘油，使甘油终浓度为2 0 ； ( 8 ) 1 0 0 9 l 管分装于1 5 m l 无菌e p 管，8 0 。c 保存或直接使用； ( 9 ) 1 0 0 9 l 的感受态d h 5 q t ，加入质粒l 山( 连接产物则需1 0 9 1 ) ，冰 浴3 0 m i r a ( 1 0 ) 4 2 。c 热休克9 0 秒后，冰浴2 m i r a ( 1 1 ) 每管加入l b 培养液8 0 0 1 d ，2 0 0 摇菌l h ； ( 1 2 ) 5 0 0 0 r p m 离心5 m i n 后，弃大部分上清液，留下约1 0 0 - 2 0 0 9 l 菌液，涂布于含a m p6 0 9 9 m l 的l b 平板，3 7 。c 倒置培养生长 1 2 1 6 h 后，挑取单个菌落扩增并抽提质粒。 4 3 大鼠s m a d 3 基因干扰靶位的设计 利用p u b m e d ( h t t p ：w w w p u b m e d o r g ) 在g e n e b a n k 获得大鼠 s m a d 3m r n a 序列( n m _ 0 1 3 0 9 5 ) ，结合下述靶位点设计原则：在 m r n a 的起始密码子a u g 的下游5 0 1 0 0 n t 处开始设计；以t t 加 1 9 个核苷酸作为潜在的s i r n a 靶位点，通过b l a s t 分析，去除与 其他基因同源的靶位点；g c 含量在3 5 5 5 之间；结合r n a s t r u c t u r e 软件计算每个s i r n a 序列的自 能( o v e r a l la g3 7 ) 。本研究 共设计6 条s m a d 3s i r n a 序列( 见表1 ) 。s i r n a 由广州锐博科技生 物有限公司合成。 设计阴性对照s i r n a ，本实验使用d h a r m a c o ns i r n a 设计软件 提供的c t r ls i r n a 序列( g c t t c a t a a g g c g c 筒r a g c ) 作为阴性对 照，该序列已被证实与大鼠和人基因组缺乏序列同源性。 含有e g f p 的空质粒及e g f p 干扰s i r n a 由广州锐博科技生物 有限公司提供。 表1 大鼠s m a d 3s i r n a 的设计 t a b 1d e s i g no fr a ts m a d 3s i r n a 4 4 将s i r n a 转染至b r l 3 a 细胞进行筛选 4 4 1 实验分组( 见表2 ) ： 1 5 表2s i r n a 转染分组 t b l 2g r o u p so fs i r n a 仃a n s f e c t i o n 分组 名称加入成分 4 4 2 转染( 按l i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 说明书进行) 转染前2 4 h ，取无菌六孔板，计数后超净台中按每孔1 5 x 1 0 5 b r l 3 a 细胞接种于2 m l 含1 0 胎牛血清的1 6 4 0 培养液中，常规培 养2 4 h ，倒置显微镜下观察细胞融合率7 0 8 0 ，且处于对数生长期， 开始转染。 a 4 - 1 1 组按r n a ：脂质体= 1 ：2 比例分子量( 1 m a 0 1 ) ：体积( p 1 ) 转染，用新鲜无血清无抗生素o p t i m e m 培养液稀释，使其终量 2 5 0 x l ，并轻轻混匀。 b 使用前轻轻混合l i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 ，除空白对照组外，其余 组均按5 此孔阳离子脂质体( 1 i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 ) 稀释到o p t i m e m 培养液中，使其终量2 5 0 皿，轻轻混匀后，在室温下孵育5 分钟。 c 混合稀释的s i r n a 或质粒和稀释的l i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 ，轻轻 混合，获得5 0 0 “1 转染复合物，在室温下孵育2 0 分钟。 d 转染前，去除六孔板中原培养液，并加入5 0 0 9 l 无血清无抗生 素o p t i m e m 培养液。空白对照组直接加入2 m lo p t i m e m 。 e 将c 中的混合液5 0 0 止孔随机滴加入六孔板中的细胞中，摇动 培养板，轻轻混匀。在3 7 。c ，5 的c 0 2 中保温。转染6 h 后，换成 16 4 0 完全培养液，继续培养至4 8 h 。 3 7 。c 培养转染细胞4 8 小时，各组分别在荧光显微镜下观察后， 收集细胞总蛋白。 4 4 3w e s t e r nb l o w i n g 检测基因蛋白质表达水平 ( 1 ) 细胞总蛋白的提取将制备的单细胞悬液置于离心管中一室 温，1 0 0 0 r m i n 离心4 m i n _ 弃上清_ o 0 1 m p b s 冲洗、吹打，室温， 1 0 0 0 r m i n 离心4 1 1 1 i n 一弃上清一加入预冷的细胞裂解液5 0 9 l ，冰浴中裂 解3 0 m i n 一超声震荡仪瞬时震荡_ 4 ，1 2 0 0 0 r m i n 离, b 2 0 m i n ，取上 清，7 0 。c 保存待测。 ( 2 ) b c a ( b i c i n c h o n i ca c i d ) 法测定蛋白含量( 依据说明书) 1 配制工作液：根据标准品和样品数量，按5 0 体积b c a 试剂a 加1 体积 b c a 试剂b ( 5 0 ：1 ) 配制适量b c a s e 作液，充分混匀。b c a 工作液室 温2 4 d , 时内稳定。2 稀释标准品( 5 m g m 1 ) ：取1 0 微升标准品用1 0 0 微 升( 标准品用p b s 稀释) ，使终浓度为0 5 m g m l 。将标准品按0 ，1 ，2 ， 4 ，8 ，1 2 ，1 6 ，2 0 微升加到9 6 孔板的蛋白标准品孔中，j j h p b s 牢b 足到2 0 微升。3 加适当体积样品到9 6 孔板的样品孔中，补加p b s 到2 0 微升。 4 各孑l 2 0 0 微升b c a 工作液，3 7 c 放置3 0 分钟。5 冷却到室温，用酶标 仪测定a 5 6 2 ，在计算机上用e x c e l 程序拟合曲线( 直线方程) 。计算出 蛋白浓度。 ( 3 ) s d s p a g e 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后电转移到p ) f 膜上 用b i o r a d 电泳装置，将两块干净玻璃插如槽内，置于注胶架上， 固定，构成一个夹心式的凝胶腔，准备灌胶。按下列顺序配制分离胶， 根据s m a d 3 和p a c t i n 的分子量，配$ 1 j 1 0 的分离胶( 成份见表3 ) 。将 所配制的分离胶溶液沿着凝胶腔的长玻璃板一面缓慢注入直至5 c m 高度为止，然后沿凝胶腔内壁缓慢注入蒸馏水进行水封，3 0 m i n 后水 封层和分离胶胶层面出现明显的界面，表明分离胶的聚合已经完成， 除去水封层。浓缩胶的注入和聚合，配制浓缩胶( 成份见表3 ) ，并立 即将所配制的浓缩胶注入已聚合的分离胶上，将凝胶液加至聚凝胶腔 短玻璃上沿约5 m m 处为止，立即将样品梳插入凝胶液顶部。3 0 m i n 后 凝胶液聚合完成，拔去样品梳，加入电极缓冲液，准备加样。蛋白样 品的处理：将待上样的蛋白质样品浓度调至8 r t g r t l ，取1 0 山蛋白样品， 加入l o 山2 xl o a d i n gb u f f e r ，混匀。在9 5 。c 水浴中加热4 m i n ，冷却至室 温。用微量加样器，依次在各个样品槽内加样，每个样品槽p 勺2 0 1 x l 。 打开电源，稳压在8 0 v ( 电泳过程中保持电压稳定) ，当样品中所含的溴 酚兰指示剂迁移至浓缩胶下缘时，将电压调至1 0 0 v ，继续电泳l d , 时， 当样品中所含的溴酚兰指示剂迁移至下沿边缘时，停止电泳。凝胶以 考马斯亮蓝染色，观察蛋白条带。 将p v d f 膜剪成凝胶大小，用甲醛浸湿l o 秒后，放入转膜缓冲液 中，将滤纸剪成凝胶大小，共1 2 张，用转印缓冲液浸湿。把海绵同样 浸湿后，按阴极海绵滤纸凝胶p v d f 膜( 阴极面为正面，正面朝上) 滤纸海绵阳极依次放好，用玻璃棒排除各层间的空气，组装好放入 转印槽内，1 0 0 伏恒流转膜1 小时。 取下转印好的p v d f 膜，5 脱脂奶粉溶液中，4 。c 封闭过夜。加 入稀释的兔抗人一抗，浓度1 ：5 0 0 0 ，取lm l 滴在p v d f 膜正面，3 7 孵育l h 。p b s t 洗膜，摇床1 0 0 r m p m i n ，5 m i n 次，冲洗3 次，加入稀释 的羊抗兔二抗，浓度1 ：5 0 0 0 ，3 7 。c 孵育l h ，p b s t 洗膜摇床1 0 0 r m p m i n ，5 m i n 次，冲洗3 次。荧光显色，在暗室中，9 0 0 9 lh 2 0 j j l l 入l u r r i g l o k e a g e u t 试剂a 、b 液各5 0 肛1 混匀，3 7 。c ，1 5 3 0 m i n 。将洗好的膜放入 塑料膜内，正面朝上，取液l m l 滴在上面，关闭塑料膜，暗室中可见 微弱荧光条带。将膜置于b i o r a dq u a n t i t i yo n e 凝胶成像分析 系统上拍照并分析处理。 以与1 3 - a c t i n 蛋白灰度灰度值之比( s m a d 3 1 3 a c t i n ) 作为反映 s m a d 3 蛋白水平的指标，计算抑制率。抑制率的计算为：以条带灰 度代表蛋白含量。s i r n a 对s m a d 3 蛋白表达的抑制率采用以下公式 计算：抑制率( ) = 1 - a l x a 2 s ( a l s x a 2 ) 】x 1 0 0 。a i ：转染s i r n a 细胞的s m a d 3 蛋白含量；a 2 转染s i r n a 细胞的p a c t i n 蛋白的含量。 a l s 空白对照组s m a d 3 蛋白的含量。a 2 s 空白对照组p a c t i n 蛋白的 含量。 统计学分析实验数据用s p s s 17 0 统计软件进行分析。测定值以均 数- 6 标准差( _ 4 - s ) 表示，组间比较采用单因素方差分析( a n o v a ) 。 p o 0 5 ) 。5 8 k b 的s m a d 3 蛋白和4 2 k b 的内参1 3 - a c t i n 如图2 。 翎0 四霉”蝴懒懒擀一* 锄桫黼懒，* ，锈 b e ：兰未斧n 自黼_ _ 一_ 簟_ _ _ 黼_ _ 嘲_ 麓期_ 酾- 赣 o 锯k ) ”1 4 一一 一 ”一_ 1 _ f _ 。- 铲 123456789 图2s m a d 3 蛋白表达的w e s t e r n b l o t t i n g 分析。( 1 空白对照组2 转染试剂对照组 3 无关序列对照组4 s i r n a 0 0 15 s i r n a 0 0 26 s i r n a 0 0 37 s i r n a 0 0 48 s i r n a 0 0 5 9 s i r n a 0 0 6 ) f i g 2 w e s t e r nb l o t t i n ga n a l y s i so fs m a d 3p r o t e i n ( 1 b l a n kc o n t r o lg r o u p 2 t r a n s f e c t i o n g r o u p3 r i o s c l l s es e q u e n c eg r o u p 4 s i r n a 0 0 15 s i r n a 0 0 2 6 s i r n a 0 0 37 s i r n a 0 0 48 s i r n a 0 0 59 s i r n a 0 0 6 ) 与空白对照组( a 组) 相比，脂质体对照组( b 组) 、无关序列对照 组( c 组) s m a d 3 1 3 a c t i n 蛋白表达比无明显差异( 尸 o 0 5 ) ，排除 了转染试剂、非特异性s i r n a 等对大鼠肝细胞s m a d 3 蛋白表达的影 响。与a 组相比，d 、e 、f 、h 组s m a d3 蛋白的表达能明显降低( p 0 0 5 ，擘：尸 o 0 1 2 慢病毒载体质粒p l l3 7 经双酶切后回收 慢病毒载质粒p l l 3 7 含有两个唯一的限制性酶切位点x h o i 和 h p a i ，两者相距1 4 b p 。经过x h o i 和h p a i 双酶切后的p l l3 7 分为 1 4 b p 和约7 k b p 两个片段，1 a g a r o s e 电泳中1 4 b p 的片段于电泳中 走出，纯化回收7 k b p 的大片段( 见图3 ) 。通过双酶切，使该载体质粒 线性化，胶回收纯化后以便于下一步重组反应进行。 图3p l l 3 7 质粒x h o i 和h p a i 双酶切电泳图谱 p ：未酶切质粒x ：x h o l 单酶切h - h p a i 单酶切x h x h o i 、h p a i 双酶切 f i g 3e l e c t r o p h e r o g r a mo fd i g e s t e dp l l 3 7w i t hx h o ia n dh p a i t h ee x t r a c t i o no ft h ep l a s m i d ( p l l3 7 ) w i t hx h o id i g e s t i o n 3 构建重组载体质粒的鉴定 3 1 重组载体质粒转化感受态大肠杆菌d h 5 a 重组载体质粒转化感受态大肠杆菌d h 5 a ，3 7 。c ，倒置培养过 夜。图4 ，5 分别为重组质粒p l l 3 7s m a d 3s h r n a ( 訇4 ) 和p l l 3 7c t r l s n a ( 图5 ) 转化感受态大肠杆菌d h 5 a 后长出的细菌菌落。 图4p l l 3 7s m a d 3s h r n a 转化感 受态大肠杆菌d h 5 a f i g 4p l l 3 7s m a d 3s h r n ap l a s m i d t r a n s f o r i i l a t i o no fd h 5 a 图5p l l 3 7c t r ls h r n a 转化感受念大 肠杆菌d h 5 a f i g 5p l l 3 7 c t r ls h r n ap l a s m i d t r a n s f o r m a t i o no fd h 5 a 3 2 重组载体质粒的x h o i 和h p a i 酶切鉴定 从培养的大肠杆菌提取重组质粒。重组质粒p l l 3 7s m a d 3 s h r n ax h o i 酶切后紫外线下观察，可见b 1 、b 3 、b 4 、b 5 、b 6 、b 9 、 b 1 0 、b l l 、b 1 2 被线性化，取上述质粒进行h p a l 酶切，可见其中b 1 、 b 3 、b 4 、b 5 、b 6 、b 9 不能被切开。将筛选所得6 质粒测序。 重组质粒p l l 3 7c t r ls h r n a 经x h o i 酶切后紫外线下观察，可见 n 1 、n 3 、n 4 、n 5 、n 6 、n 7 被线性化，取上述质粒进行h p a i 酶切， 可见其中n 3 、n 5 、n 6 不能被切开。将筛选所得3 质粒测序。 图6 重组质粒p l l3 7s m a d 3s h r n ax h o i 酶切鉴定结果 f i g 6x h o ii d e n t i f i c a t i o no f r e c o m b i n a n tp l a s m i dp l l3 7s m a d 3s h _ r n a 图7 重组质粒p l l3 7s m a d 3s h r n ah p a i 酶切鉴定结果 f i g 7h p a li d e n t i f i c a t i o no f r e c o m b i n a n tp l a s m i dp l l3 7s m a d 3s h r n a 图8p l l 3 7c t r ls h r n ax h o i 和h p a l 酶切鉴定结果 f i g 8x h o ia n dh p a ii d e n t i f i c a t i o no f r e c o m b i n a n tp l a s m i d p l l 3 7c t r ls h r n a n 1 n 7 ：单酶切c t r ls h r n ac ：未酶切质粒对照 3 3 重组载体质粒的鉴定测序 采用u 6 单项测序，测序结果显示2 种重组质粒s i r n a 编码序列 与设计片段完全一致，表明载体构建成功。测序结果如下： 3 l 4 0 1 砧扭3 ：a 了3 r4 愍既贮l 强饿= r r a f r c l - 越曙a 吼礴。曰口。c ga f c 酗焉c r 田阿羽芒溺“葛备：笛 一一： ，j j - j 池- j u “j 口o 。o u o - 。j n j “；h ：。- 川 1 d l + h - ，： ：_ t 1 ：! l 一! ：“，d e l p 电j - n z 疼嘉t i ； 4 0 g4 1 04 2 0 4 3 04 4 04 5 04 6 04 7 04 e 0 a g a a a a g c c 了工s 工r r c c g z a t g a g c t 工：g t c a a a t i c a a g 二s i l g k g 矗g ：t c a t g c g g 工i t t 了了c i c 豁g 前c g a z s s t a t e 图9 重组质粒p l l3 7s m a d 3s h r n a ( 蓝色部分为目的片段) 测序结果 f i g 9r e c o m b i n a n tp l a s m i dp l l3 7s m a d 3s h r n a ( b l u ep a r to ft h et a r g e t s e q u e n c e ) 舢 o la g a a a ；玎t 竹奠c r 比u 酗a 矗麓廿口i gi a a f i c t 1 c 暖眦能订r r 付若1 菡k ：3 a c ：釜a ；a a c q _ a a s ：二乞：* ：珏r ：一缸：站3 ：3 s 焱五：r ：s 二；珏 a ：= 0 ：二：一3 - 嘲j i 。一 - l 曩o 1