（园林植物与观赏园艺专业论文）杨树CCR基因RNAi表达载体的构建及其转化研究.pdf

摘要木质素是地球上数量仅次于纤维素的有机物，林木中木质素占木材干重的1 53 6 ，木质素生物合成及调节在植物生长和发育中发挥重要作用，另一方面，木质素是制浆造纸业的不利因素，脱除纤维素中的木质素，需要消耗大量能源和使用有毒化学物质，提高了造纸成本并污染环境。近十几年来，随着人们对木质素生物合成研究的深入，木质素生物合成途径许多酶的编码基因被不断分离克隆出来，调控木质素生物合成途径中重要酶基因的表达，通过抑制酶的活性，从而阻断木质素生物合成途径，降低木质素的合成量或单体组成，己经在烟草和杨树等植株上取得了成功。因此，利用生物技术手段降低木质素含量或改变其组成，提高杨树的制浆性能，创造出符合造纸原料要求的林木品种，对于降低制浆造纸的经济成本和保护环境等都具有重要意义。c c r 是木质素生物合成途径的关键酶之一，在木质素生物合成途径中处于终端位置。r n a i ( r n ai n t e r f e r e n c e ) 是一种重要的基因沉默方式，在植物基因功能和遗传改良研究中广泛应用。为优化和建立杨树遗传转化体系，探讨r n a i 技术在杨树木质素改良中的应用效果，建立杨树r n a i 的分子育种新方法，本文以南林9 5 叶片为外植体，对农杆菌介导的遗传转化体系进行较系统地研究，构建了肉桂酰辅酶a 还原酶基因c c r 干涉表达载体p b l l 2 1 + 2 f ，开展了农杆菌介导的杨树遗传转化，并对转化植株进行了筛选、p c r 检测和木质素含量检测，获得了如下主要结果：1 、采用改良的c t a b 法提取南林9 5 的基因组d n a ，利用p c r 技术克隆得到c c r 基因的第4 个外显子部分序列，并将其正向和反向克隆到p u c c r n a i 载体上，通过酶切、纯化、连接、转化等一系列基因工程操作方法构建了含c a m v 3 5 s 组成型启动子和卡那霉素筛选基因的r n a i 表达载体p b l l 2 1 + 2 f ，并将其成功的导入农杆菌l b a 4 4 0 4 中。2 、以南林9 5 为试材，对其叶片再生体系进行了优化，建立了高效的叶盘法农杆菌遗传转化体系，并获得了经抗k a n 筛选的r n a i 片段的转基因植株。( 1 ) 以m s 为基本培养基附加不同浓度的6 _ b a 和n a _ a ，优化了南林9 5 的组织培养扩繁体系，外植体培养基( m s + 6 _ b a1 0m e j l + n a a0 2m g l + 蔗糖2 0 l +琼脂8e l ) 诱导芽增殖，生根培养基为 1 2 m s + n a ao 0 1m g l + i b a0 2m g l + 蔗糖1 5g l + 琼脂8 l 1 。( 2 ) 用导入p b l l 2 1 质粒的农杆菌液转化南林9 5 叶片，通过正交试验设计，建立了最佳遗传转化体系，即外植体预培养7d ，在含a s2 0 01 t m o l l 的菌液浓度为0 6的农杆菌液中侵染2 0m i n ，共培养3d ，其中适宜的k a r l 分化筛选浓度为5 0m e r l e ，生根筛选浓度为3 0m e d l 。( 3 ) 利用筛选出来的最佳遗传转化体系转化目的片段，获得了具有r n a i 片段的转基因植株。3 、对获得的转基因植株进行p c r 检测，获得了r n a i 片段的转基因植株。对培养3 个月的转基因植株进行k l a s o n 木质素分析，与对照植株相比，木质素含量降低2 0 3 0 ，且转基因植株的形态和生长发育未见异常。结果表明，利用r n a i技术抑制c c r 基因表达，能有效降低植株的木质素含量。综上所述，通过构建c c r 基因r n a i 表达载体，建立杨树优良无性系叶片遗传转化体系，培育出速生、优质的杨树新品种，为进一步深入了解木质素生物合成提供了研究材料，也为其他树种的木质素基因工程改良奠定理论基础。关键词：杨树，r n a i ，c c r ，农杆菌介导遗传转化，木质素i ia b s t r a c tl i g n i ni s ，s e c o n dt oc e l l u l o s e ，t h em o s ta b u n d a n to r g a n i cc o m p o u n di nt h et e r r e s t r i a lb i o s p h e r e i nd i f f e r e n tt r e es p e c i e s ，l i g n i nc o n t e n tv a r i e sb e t w e e n15a n d36 o ft h ed r yw e i g h to fw o o d l i g n i ni sam a jo rc o n s t i t u e n to fc e l lw a l l so ff i b e r sa n dt r a c h e a r ye l e m e n t sa n dp r o v i d e st h e s ec e l l sr i g i d i t yf o rs t r u c t u r a ls u p p o r ta n di m p e r m e a b i l i t yf o rw a t e rt r a n s p o r t f o rt h ep r o d u c t i o no fh i g h _ q u a l i t yp a p e r , l i g n i ni sc o n s i d e r e da san e g a t i v ef a c t o rb e c a u s ei tm u s tb ee x t r a c t e df r o mt h ec e l l u l o s ef r a c t i o nb ye n e r g y - r e q u i r i n ga n dp o l l u t i n gm e t h o d s f o rt h i sr e a s o n ，t h e r ei sc o n s i d e r a b l ei n t e r e s ti nm o d i f y i n gl i g n i nb yg e n e t i ce n g i n e e r i n gt oi m p r o v ei t se x t r a c t a b i l i t yf r o mw o o d c c r ：c i n n a m o y l - c o ar e d u c t a s ei sak e ye n z y m e ，w h i c hd e c i d e dt h el a s ts t e po fl i g n i nb i o s y n t h e s i s r n a i ，a sa l li m p o r t a n tg e n es i l e n c i n gm e t h o d s ，h a sas i g n i f i c a n ta p p l i c a t i o nt ot h er e s e a r c ho fg e n ef u n c t i o na n dg e n e t i cm e l i o r a t i o n i no r d e rt os e l e c ta n de s t a b l i s ht h er e g e n e r a t i o na n dt r a n s f o r m a t i o ns y s t e mo fp o p l a r ，t oi n v e s t i g a t ee f f e c t so fr n a ii np o p l a rl i g n i ni m p r o v e m e n ta n dt of o u n dan e wm o l e c u l a rb r e e d i n gm e t h o di np o p l a r ，w es y s t e m a t i c a l l ye x p l o r e dt h ec h a r a c t e r i s t i c sa n dp a r a m e t e r si ni n h e r i t a b l et r a n s f o r m a t i o ns y s t e mb ya g r o b a c t e r i u m ，a n dc o n s t r u c t e dt h ee x p r e s s i o nv e c t o ro fp b l l 2 1 + 2 ft h e na g r o b a c t i r i u mm e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n 。t h ei n t e g r a t i o no ft a r g e t e dg e n ew a sp r o v e db yp c ra n a l y s i s f i n a l l y , t h el i g n i nc o n t e n tw a st e s t e d t h em a i nr e s u l t sa r es u m m a r i z e da sf o l l o w ：1 、t h et o t a lp o p l a rd n aw e r ee x t r a c t e df o l l o w i n gam o d i f i c a t i o no fc t a bm e t h o dw i t hs o m ea d j u s t m e n t s ，f o u r t he x t r o n ( 3 4 0 b p ) f r a g m e n tf r o mg e n o m eo fc c rg e n eh a v eb e e na m p l i f i e db yp c ra m p l i f i c a t i o n t h ep o s i t i v eo r i e n t i o na n dn e g a t i v eo r i e n t i o no ft h ef r a g m e n ti sl i g a t e di n t op u c c r n a i ，e x p r e s s i o nv e c t o rp b i121 + 2 fh a v ec o n s t r u c t e db yg e n ee n g e n e e r i n gm e a s u r ew h i c hc o n t a i n i n gk a n a m y c i ns e l e c t i n gg e n e ，s u c ha sd i g e s t i o n 、p u r i f i c a t i o n 、l i g a t i o na n dt r a n s f o r m a t i o n t h e nt r a n s f o r m e di ti n t oa g r o b a c t i r i u mt u m e f a c i e n sl b a 4 4 0 4 2 、i nv i t r om i c r o p r o p a g a t i o na n dae f f i c i e n tl e a f d i s cr e g e n e r a t i o ns y s t e mh a v eb e e no p t i m i z e da n de s t a b l i s h e df o rn a n l i n 9 5 ，a n dt r a n s g e n i cp l a n t sw e r es c r e e n e du s i n gk a ni nr o o ti n d u c e d 埘e d i a ( 1 ) t a k em sa sb a s i cm e d i a t i o nw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no f 乒_ b a & n a a ，t h es y s t e mo fn a n l i n 9 5t i s s u ec u l t u r eh a sb e e no p t i m i z e d t h eo p t i m u mc u l t u r em e d i u mf o rd i f f e r e n t i a t i o nw a s ( m s + 6 - b a1 0m g l + n a a0 2m g l + s u c r o s e2 0g l + a g a r8i i il ) ，a n d 【1 2 m s + n a ao 0 1m e d l + i b a0 2m g l + s u c r o s e1 5g l + a g a r8g l w a so p t i m u mf o rr o o ti n d u c e d - m e d i a ( 2 ) t h r o u g ho r t h o g o n a ld e s i g n ，a ne f f i c i e n tt r a n s f o r m a t i o na n ds c r e e n i n gs y s t e mo fn a n l i n 9 5m e d i a t e db ya g r o b a t e r i u r nt u m e f a c i e n sw i t hp b l l21w a sd e v e l o p e d t h es y s t e mw a s7d a y sp r e c u l t u r a t i o n ，2 0m i na g r o b a c t e r i u mm m e f a c i e n s ( o d 6 0 0 = o 6 ) i n f e c t i o nw i t h2 0 0p m o l la c e t o s y r i n g o n e ，a n d2d a y s c o - i n f e c t i o n t h ec r i t i c a lk a n a m y c i ns e n s i t i v ec o n c e n t r a t i o n sf o ri n d u c i n gs h o o t sa n dr o o t so ft h ep o p l a rw e r e5 0m g la n d3 0m g lr e s p e c t l y ( 3 ) w i t ht h eo p t i m i z e ds y s t e mo f a g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n ，t h ea i m e df r a g m e n tw a st r a n s f o r m e da n dg e n e r a t e dt r a n s g e n i cp l a n t s 3 、t r a n s g e n i cp l a n t so fn a n l i n 9 5c u l t i v a rc o n f i r m e db yp c rw e r et r a n s f e r r e di n t os o i la n dg r o w nf o rf u r t h e rc h a r a c t e r i z a t i o n d e v e l o p i n gx y l e m sw e r ec o l l e c t e df r o mt h r e e - m o n t h - o l dt r a n s g e n i cp l a n t so fn a n l i n 9 5 t h el i g n i nc o n t e n to ft r a n s f o r m e dp l a n t sr e d u c e db y2 0 3 0 w i t h o u ta b n o r m a lm o r p h o g e n e s i sa n dg r o w t hc o m p a r e dt ot h a ti nt h ec o n t r o l s t r a n s g e n i cp l a n t sw i t l lr n a if r a g m e n to fc c rf o rp o p l a rc u l t i v a r sw i l ln o to n l yg i v en o v e li n s i g h ti n t or e g u l a t o r ya s p e c t so ft h ep a t h w a ya n do nt h es t r u c t u r ea n db i o l o g i c a lr o l e so fl i g n i n ，b u ta l s op r o v i d eap i c t u r eo fg e n e t i ce n g i n e e r i n gf o rm o d i f i e dl i g n i nc o m p o s i t i o na n dc o n t e n t ，k e yw o r d s ：p o p l a r , r n a i ，c i n n a m o y k o ar e d u c t a s e ，a g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n ，l i g n i ni v独创性声明本人声明所呈的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：魁签字日期：o 一8 年移月，日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文件，允许论文被查阅和借阅。本人授权安徽农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，收录到中国学位论文全文数据库，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，向社会公众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 。学位论文作者签名：牲签字日期：6 ) 吩8 年歹月f 7 日学位论文作者毕业后去向：工作单位：通信地址：指导教师签名：选翌丝签字日期：多甥年易月，j ；日电话：邮编：1文献综述纸是人们生活的必需品。目前，世界制浆造纸工业主要以木材为造纸纤维原料l l j ，其制浆造纸过程的基本原理是用化学、机械或兼用化学及机械的方法将植物原料中的纤维分离出来，再在浆、水混合的悬浮体中使纤维重新交织成均匀丽致密的纸张，而纤维的分离实质上是使纤维中所含木质素取得塑化或溶解的过程【2 】。随着经济快速发展和人们生活水平提高，不仅对纸的种类和数量需求越来越大，而且对纸的质量要求越来越高，由于杨树具有速生丰产，适应性强，繁殖容易，纤维长，材质好等特性，成为了我国主要的纸浆用材林树种。近年来，随着产业结构的调整和造纸业的需要，杨树纸浆林栽植面积逐年扩大。然而，在制浆和造纸中除去木质素是一个极大的障碍，原因是木质素很结实，而纤维素很有韧劲，二者很难分开，必须通过剧烈的化学处理工艺将木质素从纤维素中除去。由于林木种内木质素含量变异小，并且变异受环境条件的影响大，利用常规育种方法很难对这一性状进行有效地定向改良，因此，对于林木育种者来说，目标是创造出更有利于制浆工业脱木质素的工程檀株，并且其木质素含量降低和或木质素结构改变丽植物发育和抗性不受影响。故木质素的遗传改良具有潜在的重要商业价值，降低木材木质素含量或改变木质素结构组成，使得木质素在制浆过程中更易被去除，无论是从提高纸浆得率和质量、降低造纸经济成本还是环境保护方面，都具有重要意义。尤其我国造纸工业污染严重，从源头上治理与减少污染，既可减少能源消耗，又能达到环境保护的目标【3 】。1 1 木质素生物合成途径木质素的出现与陆生植物直立生长的习性相关，是植物进化的一种标志，在植物体内比重仅次于纤维素( 4 j 。现在一般认为，木质素的生物合成过程分为三部分进行：首先是植物光合作用的初级产物葡萄糖等进入莽草酸途径( s h i k i m a t ep a t h w a y ) ，合成苯丙氨酸、酪氨酸( 禾本科植物) 和色氨酸等芳香族氨基酸( a r o m a t i ca m i n oa c i d s ) ，这是细菌、真菌与植物中特有的代谢途径；第二部分是苯丙烷类代谢途径( p h e n y l p r o p a n o i dp a t h w a y ) ，在这一途径中，苯丙氨酸经过脱氨基、羟基化与甲基化等步骤，合成羟基肉桂酸类化合物( h y d r o x y c i n n a m i ca c i d s ，h c a s ) 及羟基肉桂酸酯酰辅酶a 类化合物，包括对一香豆酸( p 弋o u m a r i ca c i d ，p c a ) 、咖啡酸( c a f f e i ca c i d ，c a ) 、阿魏酸( f c m l i ca c i d ，f a ) 、5 罐基阿魏酸( 5 由d r o x y f e m l i ca c i d ，5 - o h f a ) 与芥子酸( s i n a p i ca c i d ，s ao 植物体中，h c a s 能够与角质、木栓质、木质素、碳水化合物、蛋白质、脂类、氨基酸、类萜、生物碱、类黄酮及其它含有羟基的多种化合物缩水形成脂类化合物，h c a s 作为植物体内酚类化合物代谢的中间代谢物，参与了植物体多种生理生化过程，如逆境防御、物质代谢过程的调控及植物形态建成等【5 】。木质素生物合成的最后一部分是将h c a s 及h c a - c o a 还原为各种木质素单体，这些木质素单体再进一步氧化聚合成木质素，也称木质素的特异合成途径。目前，国际上有许多研究小组己经从多种植物中分离到了参与木质素单体醇代谢的酶及其基因，并且通过突变体或转基因植物并结合生物化学的技术来研究确定这些酶和基因在木质素生物合成过程中的作用位点及其调控机制l 删。由于木质素类型和数量以及构成木质素的单体的数量和组成，是随植物种类、细胞和组织类型的不同而不同，而木质素合成过程所涉及的酶的种类、活性及比例的不同，决定了不同单体产生和合成的速率及木质素中不同单体的比例，从而决定了特定木质素的产生。因此，人们将研究重点集中在了发挥主要作用的苯丙烷类代谢途径和木质素合成特异途径这两个阶段，发表了许多研究综述。1 1 1 苯丙烷类代谢途径1 1 1 1 苯丙氨酸解氨酶( p a l )苯丙氨酸解氨酶催化苯丙酸途径中第一步反应，即将苯丙氨酸脱氨基生成反式肉桂酸。反式肉桂酸是许多酚类物质共同的代谢前体，这些酚类物质包括类黄酮、木质素单体和水杨酸等，在植物的生长和发育中具有重要功能。p a l 在反式肉桂酸的合成过程中，将碳从初生代谢途径转向次生代谢途径，驱动细胞的分裂和生长。p a l 己从许多植物组织中纯化和分离，而不同的p a l 同工酶在苯丙酸代谢中功能各异，其活性受光照、损伤、真菌感染、紫外照射、乙烯以及冷或冻处理等多种因子的诱导【l o l 。在苯丙烷代谢途径中，p a l 催化反应曾被认为是限速步骤，因为一些证据表明，抑制该酶及其基因表达会引起苯丙酸的积累【1 1 1 。由于木质素生物合成途径属于其代谢途径的一个分支，因此认为该酶控制木质素总量合成。1 1 1 2 肉桂酸4 一羟基化酶( c 4 h )c 4 h 是一种研究较广泛的p 4 5 0 单氧化物酶，催化苯丙酸途径的第一个氧化反应，将反式肉桂酸催化生成对一香豆酸。人们在对c 4 h 功能的研究中发现，在植物的生长发育过程中以及各种外界因子如激发子、真菌感染、机械损伤及化学诱导子等刺激下，其编码基因m r n a 积累水平的变化趋势与p a l ，4 c l 趋于一致。对这三种酶编码基因的启动子序列进行分析发现，三个基因的启动子序列中具有一些共同的顺式作用元件i l2 1 ，因此更加确定这些基因在转录水平遵循相似的调控模式。在此基础上，人们推测这三种酶可能是以一种组装的多酶复合体( m e c ) 形式存在，发挥其功能。c 4 h 在其中起着结构支架作用，将多酶复合体固定到内质网上。1 1 1 3 香豆酸辅酶a 连接酶( 4 c l )4 c l 作用于苯丙酸途径中最后一步反应，催化各种羟基肉桂酸生成相应的硫酯，这些硫酯处于苯丙酸代谢途径和各种末端产物特异合成途径的分支点。4 c l 通常以基因家族形式存在，其同工酶具有不同的底物特异性和时空表达特性，具有各自的生理2功能。目前人们多集中在与木质素生物合成相关同工酶类的功能研究，因为调节4 c l的表达活性能有效地调节木质素的生物合成途径，有助于培育低木质素含量的造纸原料树种。1 1 1 4 香豆酸3 羟基化酶( c 3 h )c 3 h 实质上是一种p 4 5 0 单氧化物酶，最适催化底物是甲酰肉桂酯类化合物。c 3 h涉及的发生途径，首先是肉桂酸经4 c l 催化生成肉桂酰辅酶a ，后在一种乙酰转移酶h c t 1 3 1 ( 该酶具有羟基肉桂酰一辅酶a _ 奎宁酸羟基肉桂酰转移酶c q t 和羟基肉桂酰一辅酶n 莽草酸羟基肉桂酰转移酶c s t 双重催化活性) 作用下，合成c 3 h 的催化底物羟基肉桂酰莽草酸和羟基肉桂酰奎宁酸，h c t 属于可逆转酶类，可将c 3 h 的催化产物再进一步转换成咖啡酰一辅酶a 【1 4 1 ，进而参与木质素的整个生物合成途径，该途径的阐明对于正确认识木质素的合成与代谢机制有重要意义。1 1 1 5 咖啡酸卜甲基转移酶( c o m t ) 和阿魏酸5 - 羟基化酶( f s h )c o m t 和f s h 均与s 木质素单体特异合成相关，可以说它们是s 木质素合成的限速酶。早期，有实验结果表明，f 5 h 和c o m t 所介导的g 向s 木质素转化合成过程可以在醛的水平上进行。之后，h u m p h r e y s 等t 1 5 】实验同样证明，将拟南芥f s h 置于酵母中表达，它的催化底物除了阿魏酸外，还有松柏醛和松柏醇，而且此酶对松柏醛和松柏醇的亲和力是阿魏酸的上千倍。同位素标记的松柏醇前体示踪实验显示，松柏醇与芥子醇的生物合成有关【1 7 】。上述研究结果表明f s h 优先催化的底物是松柏醛和松柏醇。c o m t 情形与之类似，许多实验数据表明该酶的甲基化反应可以在醛和醇的水平上进行，并且f 5 h 的催化产物5 一羟基松柏醛和5 一羟基松柏醇是c o m t 优先催化的底物8 - 2 0 1 ，这些结果意味f s h 和c o m t 催化的反应除了在肉桂酸水平进行外，还可在醛和醇的水平上发生。这两个酶底物催化特异性方面的研究进展，能更好地反映出f 5 h 和c o m t 在木质素合成与代谢过程中相互作用关系，便于更清楚地理解转基因植物和突变体中木质素合成途径所发生的各种变化。1 1 1 6 咖啡酰一辅酶a 甲基转移酶( c c o a o m t )与c o m t 相比，c c o a o m t 在木质素生物合成途径作用发现较晚，其主要催化羟基辅酶a 酯的甲基化反应，将咖啡酰辅酶a 转化成阿魏酰辅酶a 。最初人们在欧芹和胡萝卜的悬浮细胞中添加真菌激发子能迅速诱导c c o a o m t 活性的急剧增加，因此认为该酶的功能与植物的防御机制有关，它可能参与细胞壁阿魏酸酯的形成【2 l 2 2 1 。直至z j l 9 9 4 年y e 等j 研究百日草离体升肉细胞的木质化发生机制时，发现c c o a o m t ，在以咖啡酰一辅酶a 和5 氇基阿魏酰辅酶a 为底物时，随着百日草叶肉细胞的木质化时期延长，其活性相应升高，因此认为该酶可能参与木质素的生物合成途径。以后的实验证据表明，该酶在连翘、烟草、西红柿、苜蓿、大豆和火炬松等许多植物的木质化组织中表达【2 牝引，并且在c o m t 活性降低的转基因植物中，仅s 木质素含量降低，而g3木质素并无明显改变，由此确定了木质素生物合成途径存在另一种甲基化途径【2 9 一o l 。转基因研究进一步证明，抑制c c o a o m t 的表达活性，能有效地降低植物中的木质素含量，且对g 木质素的影响比较明显，由此推测c c o a o m t 可能与g 木质素特异合成相关。1 1 2 木质素特异合成途径1 1 2 1 肉桂醛辅酶a 还原酶( c c r )c c r 催化羟基肉桂醛c o a 硫酯还原为相应的醛。己从蚕豆、云杉细胞培养物、杨树茎形成层汁液、桉树木质部中纯化出c c r 3 1 q 2 1 ，c c r 基因在植物中以单拷贝或多拷贝形式存在。在桉树、杨树、烟草、甘蔗和火炬松中仅存在一个拷贝，而在玉米、拟南芥中以多拷贝形式存在，并且这些同工酶在植物中具有不同的生理功能，或与植物木质化进程相关，或参与植物对病菌的防御反应【3 3 1 。在木质素生物合成途径中，c c r 处于木质素特异途径中的第一步，可同时催化三种底物，因此人们推测该酶催化的反应是控制木质素特异合成的关键步骤【3 训。1 1 2 2 肉桂醇脱氢酶( c a d ) 与芥子醇脱氢酶( s a d )通常认为被子植物中g 和s 木质素的形成与肉桂醇脱氢酶( c a d ) 催化反应密切相关，该酶负责将c c r 还原的醛类中间产物进一步还原为木质素单体。c a d 己从许多植物中分离纯化【3 5 1 ，它的相应编码基因在许多植物中也是以单拷贝或基因家族形式存在，该酶的同工酶在不同植物中的催化特性有所差异，c a d 则主要参与g 木质素合成调控过程。然 面a n t e r o l a 和l e w i s 3 6 】对c a d 活性缺失的突变体和转基因植物的研究发现，当c a d 活性受到抑制时，会导致s 和g 木质素含量同时减少，且伴随s g l l 值降低。他们认为植物体内并不存在一种与芥子醇合成相关的特异脱氢酶，被子植物体内的g s 木质素合成途径中的还原反应可能是c a d 同工酶催化所致，s a d 基因可能是被子植物进化过程中引入外源基因的结果。最近人们又在c a d 活性缺失的转基因杨树的木质素中检测到s a d 催化底物芥子醛的积累，看来s a d 是否特异催化芥子醛还有待进一步验证。1 2 木质素基因工程研究进展近十几年来，随着遗传学、分子生物学和生物化学的发展，在木质素生物合成有关酶编码基因的克隆和功能研究方面取得了显著进展，使得人们对木质素生物合成途径也有了更多、更深入、更全面的认识，木质素生物合成途径中的许多重要酶及其编码基因的表达调控，已成为了利用转基因植物来改良木质素含量和组成的研究热点。因此，研究者尝试利用基因工程创造满足造纸原材料特性需求的林木新品种，以这些酶编码基因作为靶基因，通过基因工程技术抑制林木木质素生物合成途径，达到定向改良木质素含量或组成、提高造纸原料需求特性的目的，这些相关领域的基础研究和应用研究成为当前林木木质素改良研究的热点，目前越来越多的实验室培育出了理想4的木质素改良的基因工程植株，所获得的研究结果首先是基于对木质素结构及其生物合成途径的基本认识之上。近年通过转基因植物对木质素生物合成调控的研究主要表现在两个方面：一是木质素合成总量的调节，涉及的酶类有p a l ，c 4 h ，4 c l ，c a d 和c c r 等，它们表达活性的高低，与木质素总量密切相关；二是与木质素单体特异合成相关酶类的调控，主要集中于三种酶，即c o m t ，c c o a o m t 和f 5 h ，这些酶类表达对木质素含量尤其木质素单体的特异合成影响较大，决定了各种单体在木质素总量中的比例。以下就近年人们对这两方面取得的进展做一简要介绍。1 2 1 木质素总量合成的生物调控苯丙酸途径是由p a l 催化的酶促反应开始，p a l 是连接莽草酸和苯丙酸途径的关键酶。正义或反义抑制烟草中p a l 活性，会导致木质素含量降低，伴随s g l 卜, 值升高，但对植物的生长产生不良影响，如生长停滞，花畸形，次生木质部细胞壁变薄、抵御病害能力下降等1 3 7 】。苯丙酸途径与许多次生代谢产物的合成密切相关，故调控该途径的合成，不仅致使木质素生物合成途径的改变，而且可能影响其它产物的合成，甚至导致植物性状的变化。c 4 h 催化肉桂酸向香豆酸的转化，在转基因苜蓿和烟草中，该酶表达受抑制后，植株木质素含量减少，植物无异常生长现象发生，且s g l g 值降低【3 8 嘲】，这种结果与p a l 活性受抑制后s g l t 值升高的结论相矛盾。造成这种现象的原因可能是：( 1 ) 通n g s n s 木质素特异合成通道在很早的时期就已各自分开；( 2 ) c 4 h 对s木质素的生物合成有着较强的调控能力，而g 木质素的途径也许可跨越c 4 h 的催化步骤；( 3 ) c 4 h n 能有一种特殊形式存在于酶复合体或其它代谢通道中，调控s 木质素的生物合成【4 卜4 2 1 。4 c l 是连接苯丙酸途径与木质素特异合成途径的关键酶，将羟基肉桂酸乙酰化生成羟基肉桂酰- c o a 酯，它通常以基因家族形式存在于植物中，4 c l 同工酶在植物中的功能各异。人们主要对拟南芥、烟草、颤杨三种植物进行4 c l 表达活性的研究【4 引。抑制该酶表达，均使这些植物木质素含量下降，然而s g l g 例变化趋势却各不相同。在转基因烟草中s g e l 值降低，拟南芥中s g l i , 值反而升高，颤杨中s g 并无明显升降变化，这可能是由于不同植物中4 c l 同工酶对芥子酸催化活性不同所致。不仅如此，几种植物表型上也有差别，拟南芥表型正常，烟草矮化，颤杨生长加快，造成这种生长差异的原因还不清楚。但是根据前人的研究数据和我们的实验结果不难发现，矮化现象主要表现在4 c l 活性受到正义抑制的转基因株系中，反义抑制的烟草中并无类似表型。这可能是正义和反义抑制机理存在某种差异，或许是由于分析群体较小所致。关于颤杨表现出生长加速，纤维素含量补偿性增多，l i 等f 4 7 】认为颤杨生长加快，可能是使用组成型启动子所产生的一种负面效应，因为他们用特异性启动子p 1 4 c l i p 代替组成型启动子c a m v 3 5 s 后，转基因植株与野生型生长状况基本相同。然而，有实验室以中国特有树种毛白杨为研究对象，使用组成型启动子，也未观察至1 4 c l 活性受到抑制的转基因株系生长加快现象，且纤维素的含量无明显变化【4 引。这可能由品种、地域、培养条件与测定方法等原因引起，因此木质素与纤维素之间代谢补偿机制是否在植物中普遍存在还有待进一步探讨。另外，一些转基因毛白杨的茎杆上呈现面积大小不一、颜色深浅不同的红棕色，在转基因烟草中也有类似的现象，这种颜色变化可能与羟基肉桂酸的积累有关，且颜色变化幅度与木质素下降程度呈一定的相关性。k a j i t a等【4 9 l 对4 c l 活性下降的转基因烟草进行制浆实验，结果表明转基因株系木质素易去除，化学药品耗用量少，纸浆产量增加，可见4 c l 是较为理想的用于改良造纸资源植物的目标基因。c c r 和c a d 处于木质素单体的特异合成途径。抑$ 1 j c c r 表达，木质素含量均降低，而且伴随一些非正常酚类物质的增加【5 2 1 ，但这些物质并不参与木质素的聚合过程。部分转基因株系生长停滞，叶型卷缩，花期延长，导管变形，一些转基因株系的木质部呈褐色等。人们在对转反义a t c r r 的拟南芥超微结构观察时发现，其木质化的组织木质素含量减少，导管和束间纤维的次生壁结构松散幅度大，转基因植物易被酶消化。c c r 活性受到抑制对木质素组分也产生影响，s 与g 木质素均有降低，幅度基本相似，说明c c i 澍于s 和g 木质素生物合成是必需的，非特异地参与某一个单体s或g 木质素的合成过程。c a d 参与木质素单体合成的最后一步还原反应。在转基因植物研究中，发现c a d活性受到抑制后，转基因植物的木质素含量变化不明显，对s g e k 值的影响也不大，但会引起羟基肉桂醛的积累，这些醛类物质通过自由基偶连反应与其它木质素成分交连，成为木质素组成部分。这种结构的改变，利于脱木质素的生产工艺。有些转基因植株生长和发育均正常，但木质部局部区域变成红褐色，呈条状或块状分布，这与醛类物质的沉积有关【5 3 】。1 2 2 木质素单体特异合成相关酶的调控从整个木质素合成途径可知，有三种酶与木质素单体的特异合成有关，& c o m t ，c c o a o m t 和f 5 h ，其中c o m t 和f 5 h 与s 木质素的合成密切相关，尤其f 5 h 催化的反应是s 木质素合成的限速步骤【5 4 5 5 j 。过去对抑制c o m t 表达的转基因研究比较多，在大多数c o m t 受抑制的转基因植物中【5 0 1 ，木质素含量变化不大；但也有个别转基因植物，当c o m t 活性抑制到足够低，木质素含量有所减少【6 l l ；就木质素组分而言，s木质素均呈下降的趋势，而g 木质素无明显变化，其中还有一种新组分5 氇基g 木质素积累。这些数据表明c o m t 并不影响碳向木质素的总量合成，s 和g 木质素合成可能在很早的阶段开始分支，c o m t 主要负责s 木质素的生物合成，同时也验证了该酶对5 氇基化合物具有特异催化作用。尽管如此，通过对转基因植物中c o m t 活性与s木质素含量下降幅度比较，可发现只有c o m t 活性下降至f j 3 0 以下，s 木质素才有明6显改变。c o m t 基因在植株中的过量表达，不能使转基因植株s 木质素含量增加，这说明c o m t 的催化作用对于芥子醇的生物合成并非是限速步骤，在s 木质素的生物合成途径中可能存在一个调控开关【6 2 1 。转基因植物的生长无异常现象发生，仅有一些植物木质部或整个木材部分呈现浅粉及斑点状红棕色，造成这种现象的原因还有待进一步查明。l a p i e r r e 等t 6 3 】对c o m t 活性仅存1 0 的转基因杨树进行制浆实验，由于其木质素结构变得致密，故影响制浆效率。c c o a o m t 发现较晚，可能代表早期陆生植物中与木质素合成有关的较原始的酶类。人们主要用烟草，苜蓿和杨树等对该酶进行研究，抑制c c o a o m t 的表达，转基因植物木质素含量均有下降，s 和g 木质素含量都减少，其中g 木质素下降趋势比较显著，因此导致s g 比值升高，这可能与c c o a o m t 对g 木质素合成的特异调控相关。z h o n g 用傅立叶转换红外光谱分析木质素含量下降的转基因杨树，发现植株木质素结构变得疏松，键间的连接也相对松散咿j ，预示制浆中脱木质素相对容易。多数转基因植物生长正常，仅有一例报道，抑制c c o a o m t 表达会导致转基因植物生长畸形，如生长速率减缓，叶面窄，雄蕊变短等【6 5 1 。产生这种结果的原因可能是由于使用不同的基因家族成员、表达载体以及植物种类不同等。另外，一些c c o a o m t 活性受抑制的转基因植物茎上呈现片状或斑点状红棕色，其中检测到羟基苯甲酸的积累，但这并不是导致颜色改变的直接原因，故有关起因还需进一步分析。从突变体和转基因植物研究中发现，f s h 特异控制s 木质素的合成。在f 5 h 活性缺失的拟南芥突变体中，仅含有微量的s 木质素：将f 5 h 置于c 4 h 启动子下游并在该突变体中过量表达，发现转基因植物中的木质素基本由s 木质素组成【6 6 j ：同样将该基因导入正常植株中进行表达，也会使s 木质素含量增多，且使其在植物中的组织分布特异性消失【67 1 ，可见该酶是调控s 木质素合成的关键酶。f 5 h 对于植物木质素的组分改造很有意义，尤其在以g 木质素为主的裸子植物中，若将f 5 h 引入其中，可能会提高s 木质素在木质素总量中的比例，对纸浆生产极为有利。对转c 4 h - f 5 h 基因的杨树进行制浆实验，转基因植株与对照相比，纸浆产量提高，用于分离木质素的化学药品用量减少，相应的废物排放量降低，因此具有潜在的经济和环保效益。上述研究表明，若以不影响植物生长为前提，以降低木质素含量、提高s g 比值及制浆效率高低等为指标衡量转基因植物是否适合用于造纸，则c 4 h 、4 c l 、c c o a o m t 、f 5 h 、c c r 和c a d 是较为理想的用于造纸资源植物材性与品质改良的目标基因。尽管如此，我们不应忽略对某些问题的探讨，例如降低植物木质素含量是否有损于植物疏导和支持系统完整性的保持，植物是以何种补偿机制维持其正常代谢，转基因植物能否经得住恶劣的自然环境的考验，转基因效应引起植物发生怎样的超微结构变化，转基因效应是否随着生长时期加长回归野生型状态以及这种趋势变化如何等等。71 3r n a i 机制和原理无论是要阐踢木质素代谢途径，还是要开发新的植物资源，遗传工程技术都发挥着非常重要的作用。基于有关木质素代谢途径中的基因大多被分离，因此利用转基因手段来调控资源植物木质素结构、组成与含量，改造目的植物的同时，也促进了木质素生物合成途径的研究。目前，大多数转基因研究是通过反义或正义核酸技术调控木质素合成过程中某基因来实现对木质素的改造，而本研究中采用的是r n a 干涉，也是目前为止将此技术应用于杨树木质素改良的首例。r n a i 是指双链r n a ( d o u b e - s t r a n dr n a ，d s r n a ) 在细胞内特异性地诱导与之同源互补的m r n a 的降解，使相应基因的表达关闭，从而引发基因转录后水平沉默的现象。转基因沉默现象是n a p o l ic 等人1 9 9 0 年首次发现的1 6 8 1 ，同年，v a n d e rk r o l 等人在矮牵牛中发现类似的现象【6 9 1 。1 9 9 8 年，a n d