（分析化学专业论文）牛血清白蛋白和阿特拉津在金纳米通道内迁移特性研究.pdf

上海师范人学硕 ：毕业论文中文摘要 a ) ，加入分析物后氯离子修饰的通道较没修饰的电流的降低值大( 如图3 6 ，8 a ) ，究其原因可能是通道经修饰后表面带有负电荷，会吸引溶液中的阳 离了如钠离子，使通道内壁附近的阳离子浓度较本体溶液要大，故引起较大的电 流产牛“”。修饰后通道具有电流放大作用，选择修饰后的通道作为检测载体。 上海师范大学硕上毕业论文第三章 耋 _ c o 。 l = ) o1 0 02 0 03 0 0 t i m e ( s ) 图3 - - 5 分析物加入前，纳米通道修饰前后的电流响应( a ) 没有修饰( b ) 修饰氯离子 富 。 鼍 罢 ， o o 4 2 m 4 3 o 4 4 旬弱 国4 6 _ o 7 6 由孺 国8 0 以8 2 m ，8 4 国8 6 一o 8 8 a b 图3 6 加入分析物时，纳米通道修饰前后的电流响应( a ) 没有修饰( b ) 修饰氯离子 3 3 4 2m p a d - b s a 复合体的电流响应 图3 7 为一定量的阿特拉津免疫原( i f l ，1 2 5 1 0 - 4 m ) 逐次加入到含阿 特拉津抗体的进样池溶液中形成的响应电流( 插图为阿特拉津免疫原加入前电 流) 。没有加入阿特拉津免疫原时电流值可达一稳定态，加入免疫原后产生电流 衰减，当阿特拉津免疫原浓度达到3 3 3x1 0 - 7m 以上后，电流不再随免疫原浓 o 4 之 4 4 击 焉 刁 名 l 一 一 一 上， 一 一 第三章 上海师范大学硕士毕业论文 度变化而变化。加入免疫原后出现电流降的原因可能是以下两点：( 1 ) 形成大体 积的免疫原抗体复合体，该大体积复合体对电解质的流动产生阻碍效应；( 2 ) 免 疫原可能非特异性吸附在通道内，引起通道内径的减小和其运输特性的变化，进 而导致电流的降低。当免疫原浓度达一定程度后免疫原在通道内的非特异性吸附 达饱和。在第( 1 ) 种情况下，产生较为稳定降低值，当进样池中的的抗体全部被免 疫原结合后，再加入免疫原不会有复合体形成，故此时电流不再有明显的降低。 借此可用于阿特拉津免疫原的测定。过膜电流的降低值与免疫原浓度关系见图3 8 ，免疫原浓度在2 5 6 x1 0 一3 3 3 1 0 _ 7m 范围内，电流降低大小与阿特拉 津免疫原浓度成线性关系，检测限为1 7 x1 0 1 0m 。 3 0 耋 _ c o l - - ： o l i m e ( s ) 图3 7 阿特拉津免疫原逐次加入到含相应抗体的溶液中形成的响应电流值情况 ( 插图：加样前电流响应) 上海师范人学硕士毕业论文第三章 o 3 0 o 2 5 o 2 0 o 1 5 司o 1 0 o 0 5 o o o o oo 51 01 52 o2 53 o3 5 c o n c e n t r a t i o n ( 1 0 7t o o ll 1 ) 图3 8 电流变化值与阿特拉津免疫原浓度线性关系图 图3 9 电流响应的部分图( a ) 阿特拉津免疫原( b ) 阿特拉津 4 b 当以纯阿特拉津代替阿特拉津免疫原以相同摩尔浓度逐次加入时，电流同样 也会出现降低。因为阿特拉津是半抗原，也会与抗体结合形成复合体，引起阻碍 作用，所以有电流降产生。但比阿特拉滓免疫原加入时降低量要小的多，阿特拉 津引起的电流降值为阿特拉津免疫原的五分之一左右( 图3 9 ) ，究其原因可能 是：b s a 分子具有橄榄球的形状，其长轴半径为1 4n n l ，短轴半径为41 1 i i l 盯5 1 ， 醒 柏 匏 孔 两 弛 强 瓢 勰 枷 引 州 娥 税 粥 拼 咄 吨 诹 葺v-c，之jq 第三章 上海师范人学硕：f ：毕业论文 阿特拉津免疫原为大分子，而阿特拉津为小分子，阿特拉津免疫原体积较阿特拉 津大，故形成的复合体前者较后者大；其次所用的鼠抗阿特拉津抗体在制备过程 中也是以键合在b s a 上的阿特拉津为免疫原，抗体对阿特拉津免疫原的亲和性大 于对单独的阿特拉津的亲和性。该方法对阿特拉津免疫原和阿特拉津的测定范 围、相关系数和检测限列入表3 3 。本方法对阿特拉津免疫原浓度在( 2 5 6 1 0 3 3 3 1 0 _ 7m ) 范围内有线性响应，而对阿特拉津则在( 1 1 1 1 0 嵋4 4 0 1 0 吨m ) 浓度范围内有线性响应，对阿特拉津免疫原的检测限为1 7 1 0 一“m ， 对阿特拉津检测限为0 6 1p m ，阿特拉津免疫原的检测限比阿特拉津也要低3 个数量级。表明该感应器对于阿特拉津免疫原具有更高的敏感性。 表3 3 纳米通道用于阿特拉津免疫原和阿特拉津的测定结果 c o m p o u n d l i n e a rr a n g e c o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n td e t e c t i o nl i m i t ( m ) 3 3 5 体系选择性的考察 测定了另两种常用除草剂百草枯、敌草隆对响应电流的影响，并将此时的电 流响应与阿特拉津免疫原、阿特拉津加入时的电流响应进行比较结果如图3 1 0 所示。结果表明当百草枯或敌草隆以与阿特拉滓免疫原、阿特拉津相同量( 1 h l ， 1 2 5 1 0 _ 4m ) 逐次加入时，没有产生电流的降低，原因是阿特拉津抗体不会 与这两种物质结合形成较大的复合体，所以该体系对阿特拉津免疫原、阿特拉津 具有较好的选择性。 3 2 上海师范大学硕上毕业论文 第三章 2 0 1 8 1 6 1 4 1 2 1 0 鬲 8 abc d 图3 1 0 不同物质引起的电流降低情况 a 阿特拉津免疫原b 阿特拉津c 百草枯d 敌草隆 3 3 6 稳定性及实际样品的测定 采用本方法对0 1 7 6n m 的阿特拉津免疫原进行重复测定( n = 5 ) ，测得的 相对标准偏差为4 0 ；使用过的金纳米通道膜水洗后室温下保留2 个月，重新 对样品进行测定，结果产生的的电流响应仍为原来的9 5 ，表明该方法具有很好 的稳定性。 采用该方法对合成样品和河水样品进行测试。河水样取自于康健园河的不同 水段，将取得的河水静置过夜，多次过滤，滤液蒸发后余下固体部分用于制备免 疫原，通过测定免疫原间接地测定阿特拉津。测定的免疫原的量与荧光光度法测 定结果比较，结果见表3 4 。从表3 4 可知，测得的免疫原量与荧光光度法测 得结果一致，回收率在9 8 - 1 0 5 之间，结果满意。 3 3 第三章上海师范人学硕上毕业论文 表3 4 样品测定结果 汕出器黜高捌f o u n d * * 胝孵町慧竺= oo 。盯8 0o 0 7 7 0甄7o 0 朗3 n 200 1 5 3 6融1 5 i o1 0 0 20 , 1 5 2i沼0 0 2 0 4 80 2 0 l 1眈啪 n 4 *潮o 0 5 1 2氇0 辩觋oo 0 4 妮 x 5 潮轨1 1 5 6o 1 2 0 2l 10 1 1 3 6 n l ，n 2 和n 3 为合成样品，n 秘和n 融为河水样品；n d ：没有检测到料：三次测量的平 均值 3 3 7 应用前景 该体系对阿特拉津免疫原、阿特拉津具有显著的响应，而对其他类除草剂没 有识别作用，故可用于从其他类除草剂中对阿特拉津及阿特拉津免疫原的检测， 具有广泛潜在实际应用价值。 3 4 本章小结 本试验制备了阿特拉津免疫原，并用氯离子修饰的金纳米通道对阿特拉津进 行测试研究。通过加入抗体实现选择性，当阿特拉津免疫原及阿特拉津分别加入 含有抗体的进样池时，产生阿特拉津免疫原抗体、阿特拉津抗体复合体，它们 较单独的抗体在体积上要大，对电流产生阻碍作用，出现电流衰减。而百草枯、 敌草隆加入时不会与抗体结合，没有电流衰减产生，借此实现了阿特拉津免疫原 及阿特拉津的特异性检测。 上海师范大学硕士毕业论文 第四章 第四章基于金纳米通道膜对牛血清白蛋白的测试 4 1 前言 牛血清白蛋白( b o v i n es e r u ma l b u m i n ) 简称b s a ，它的相对分子质量为1 0 的4 次方级别，是多聚物。等电点是4 8 ，含氮量1 6 ，含糖量0 0 8 ，仅含已 糖和已糖胺，含脂量只有0 2 ，由5 8 1 个氨基酸残基组成。牛血清蛋白可作为细 胞培养液的主要成分，其含量的多少对细胞繁殖生长有着及其重要的作用。也可 作为手性分离剂分离色酸，还可以作为新一代医用缝合线和绷带的纳米纤维的原 料。 牛血清白蛋白存在于复杂的混合体系中，且稳定性较差，对温度、机械剪切 力等非常敏感、易于变性。它们的提取与精制通常采用沉淀、离心、萃取、离子 交换和色谱等方法，但工艺过程复杂，且费用通常高达生产成本的5 0 以上。 已报道的光谱法测定蛋白质的新技术和新方法主要有荧光猝灭法n 嘶3 、共振瑞利 散射法n 睁1 删、双缩脲试剂法删、分光光度法1 3 1 、荷移荧光探针法4 1 和化学发 光法5 1 等，测定牛血清白蛋白理想的方法应该是灵敏度高、线性范围广、干扰 物质少、操作简单、快速的方法，但很难实现。染料结合法n 埔3 已被应用于血清 白蛋白的测定，但这种方法中吸光度不随蛋白的增加而呈直线增加。而利用纳米 银粒子的光学特性对牛血清蛋白( b s a ) 的检测方法n 1 7 1 已有报道，但这些方法存 在灵敏度低，线性范围窄等不足。 近年，m a r t i n 等用圆锥形的纳米孔传感器对蛋白质和蛋白质抗体复合体 进行研究发现电流脉冲衰减频率与分析物浓度成一定比例，但没有探讨电流衰减 大小与分析物浓度的关系口目。许光明m 利用金纳米通道阵列传感器对免疫球蛋白 ( i g g ) 进行定量测定，检测的灵敏度很高并具有较好的选择性，实现了对免疫球 蛋白快速、灵敏检测。王月荣等口1 8 1 考察了b s a 在氯离子修饰的金纳米通道内的 迁移特性。 本章以牛血清白蛋白抗体为分子识别物，利用氯离子修饰的金纳米通道对 b s a 进行检测。在电场作用下电解质离子通过纳米通道陈列时形成一电流信号， 加入b s a 后，b s a 与抗体结合形成更大分子，对通道产生阻碍作用并引起电流信号 衰减，借此实现b s a 的检测。 4 2 实验部分 第叫章 j ：海师范人学硕1 二毕业论文 4 2 1 仪器与试剂 f - 4 6 0 0 荧光分光光度计( 日本日立公司) ；b s a 抗体液( s i g m a 公司) ，其他仪 器与试剂同3 2 1 ，实验用水均为超纯水( 1 8 2 1 0 7q ) 。 4 2 2 实验方法 4 2 2 1 纳米通道的制备、活化、修饰与表征 纳米通道的制备、活化、修饰与表征同3 2 2 2 。 4 2 2 2 响应电流信号的测定 采用u 形连通池为信号产生装置。纳米通道膜将u 形池分为进样池和透过 池两部分( 图4 一1 ) 。以铂丝电极作为工作电极和参比电极，工作电极插入进样 池中，参比电极插入透过池，并通过电化学工作站进行电流信号测量。 参照文献口引，在u 形连通池的透过池中加入0 0 lm 、p h 为7 4 0 的p b s 溶 液5m l ，同时进样池中加入4m lp b s 和lm l 含b s a 抗体( 3 6m g l ) 的p b s ， 维持两池中液面平行。在参比电极和工作电极两端施加1 ov 电压，室温下测定 基底电流，随后加入b s a 测定电流一时间曲线。 工作电极 4 3 结果与讨论 电解质 大分子 图4 一la u 纳米通道膜检测装置简图 上海师范大学硕士毕业论文第四章 4 3 1b s a 的检测 实验考察了在金纳米通道内修饰氯离子对电流的影响。结果表明，进样池中 没有加入分析物前，相同条件下电流达到稳定态后，经氯离子修饰后的金纳米通 道的基底电流明显比没有修饰的金纳米通道基底电流大( 见图3 5 ) 。修饰后通 道具有电流放大作用，故选择修饰后的通道作为检测载体。 图4 2 为含b s a 抗体的进样池溶液中每次加入4 “l 含4 4 1x1 0 - 5mb s a 的p b s ( p h = 7 4 0 ) 溶液形成的响应电流情况( 插图为b s a 加入前电流情况) 。 没有加入b s a 时电流值可达一稳定态，当加入b s a 后产生电流衰减，究其原因可 能是b s a 和其抗体形成较大体积的b s a 抗体复合体，从而产生强的阻碍效应。 此外b s a 可能非特异性吸附在通道内，引起通道内径的减小和运输特性的变化， 这也可能引起对过膜电流的阻碍效应。 i 、 h _ t s 图4 2 陷a 加入后的电流响应( 插图为b s a 加入前响应曲线) 为了考察并证明b s a 在纳米通道内的非特异性吸附，另取一片修饰了氯离子 的金纳米通道膜浸入b s a 浓度为6 0 x1 0 。m 的p b s ( p h = 7 4 0 ) 溶液中，测得膜 浸入前及浸入2h 后该溶液的荧光强度，测定条件为：入e x = 2 8 5 n m ，入e m = 3 5 0 n m 。 结果发现膜浸入2h 后荧光强度显著降低( 图4 3 ) ，说明该溶液中有部分b s a 吸附到膜上。 3 7 第四章上海师范大学硕士毕业论文 z 8 03 0 03 2 0 3 4 03 6 03 8 04 0 0 4 2 0 九r i m 图4 - - 3 荧光发射光谱( 激发波长2 8 5n m ) ( a ) 膜放入前( b ) 膜放入后 当b s a 在金纳米通道内的非特异性吸附达饱和后，不会再吸附于通道内，此 后形成的较大体积b s a 抗体复合体产生较为稳定的阻碍效应，出现稳定的电流 降低值，随着b s a 的逐次加入形成的分子复合体逐渐增多，阻碍效应逐渐增强， 响应电流值越来越低，它与空白电流( 未加入b s a 时) 的差值i 越来越大。当 b s a 浓度大于5 4 6 l o - 7m 时，电流不再随b s a 的加入而变化，原因可能是抗体 已全部被结合完，加入b s a 不再会有大体积的复合体形成，阻碍作用不再增强， 电流不会有明显的降低。当电流出现稳定降低时电流降低值与b s a 浓度关系见图 4 4 。结果表明，电流降低值与b s a 浓度在3 6 4 1 0 一5 4 6 x1 0 - 7m 范围内 成线性关系，线性回归方程为i ( a ) = 2 2 1 6 1 0 _ 9 + 1 9 6 4 1 0 - 8c ( 1 0 7m ) ， 相关系数为0 9 9 6 2 ，检测限为1 9 3 1 0 硼m ( 3 s n ) 。 0 o 0 0 o o 0 0 5 0 5 0 5 o 5 o 4 4 3 3 2 2 1 1 茸_昌q-旦 l ：海师范人学硕士毕业论文 第四章 0 1 2 0 1 0 0 0 8 i = 0 0 6 q 0 0 4 0 0 2 o 0 0 0123456 c o n c e n t r a t i o n m 0 1 l - 1 图4 4 电流变化值与b s a 浓度的线性关系图 4 3 2 干扰成分对b s a 测定的影响 在b s a 浓度为3 6 4 1 0 _ 8 m 时，以加入的干扰物质产生的相对误差大于5 为指标，考察生物体内常见物质对应用上述方法检测b s a 的影响，结果表明：2 0 i 0 - 5m 的z n 2 + 、m 9 2 + 、f e 肘、c u 2 + 、n a + 离子，1 5 1 0 _ 7m 的l 一胱氨酸、l 一赖 氨酸、甘氨酸、柠檬酸对测定均不产生干扰，表明该方法具有很好的选择性 4 4 本章小结 利用c 1 一修饰的金纳米通道膜对b s a 进行分析检测，最后得到的信号特征十 分明显。b s a 浓度在3 6 4 1 0 一5 4 6 x1 0 7m 范围内，电流降低幅度随b s a 浓度增大而增大，借此实现了对b s a 的检测，检测限为1 9 3 1 0 吨m 。该方法 的建立在生物分析中具有广泛的应用，用其他的大体积分子如d n a 、酶分子、病 毒代替b s a 分子，则可以实现对它们的简便、快速、灵敏检测，形成一种新的适 用于生物分子检测的纳米分析技术。 3 9 第五章 一i ：海师范大学硕士毕业论文 第五章金纳米通道膜对牛血清白蛋白吸附的研究 5 1 前言 纳米通道在蛋白质的分离与传感领域中存在广泛应用，殷月芬等咖1 利用金纳 米通道膜分离牛血清白蛋白( b s a ) 和免疫球蛋白g ( i g g ) 抗体。c h u n 等侧研究 了摩尔分子量几乎相同的蛋白牛血清白蛋白( b s a ) 和牛血色素( b h b ) 在修饰巯 基十一酸的孔径为8 7 n m 的金纳米通道膜内的迁移，并实现了两者的分离。尹志 芳等阳考察了羊抗牛i g g 和羊抗猫i g g 在牛i g g 修饰的金纳米通道内的迁移，当通 道孔径足够小时，修饰的通道可对与牛i g g 具有特异性相互作用的羊抗牛i g g 进行 选择性的运输，基于此对羊抗牛i g g 和羊抗猫进行了分离，分离系数达4 8 7 6 。s i w y 等口4 3 对圆锥形纳米单通道膜进行功能化修饰制备了蛋白质生物传感器。s e x t o n 等玎司利用锥形金纳米单通道传感器通过脉冲电流的考察对b s a 和b s a f a b 复合 体进行分析检测。许光明等口6 1 用氯离子修饰金纳米通道膜，在一定电场下，当电 解质离子和生物大分子通过纳米通道时，大分子产生的阻碍效应使电解质离子迁 移电流发生变化，基于此发展了纳米通道传感技术，实现了对人i g g 的检测。 蛋白质是生物大分子，颗粒大小属于胶体粒子的范围，且分子表面有许多极 性基团，亲水性强，易溶于水成为稳定的亲水性胶体溶液，几乎可以自发地吸附在 任何表面上，而材料表面的物理性质和化学性质对蛋白质的吸附具有很大的影 响卜1 2 1 1 。s e x t o n 等已提出蛋白质可非特异性的吸附于金纳米通道内口5 1 ，但其没 有对这种非特异性吸附进行深入的探讨，由于这种非特异吸附，给利用金纳米通 道膜对蛋白质进行定量分析带来了困难，所以开展蛋白质在金纳米通道膜上的吸 附研究具有一定的指导意义。 本章以牛血清白蛋白为例，考察了p h 、温度、通道内径、修饰剂对牛血清白 蛋白在金纳米通道吸附的影响。 5 2 实验部分 5 2 1 仪器与试剂 3 一巯基丙酸( a r 、a l d r i c h ) ，其他仪器与试剂同4 2 1 。 5 2 2 实验方法 5 2 2 1 金纳米通道膜的制备、活化与修饰 上海师范人学硕士毕业论文第五章 参照2 2 2 方法制备金纳米通道膜。 金纳米通道膜的活化：将金膜浸入p i r a n h a 溶液中清洗，再先后用乙醇、水 充分冲洗。 膜的修饰：将所得聚碳酸酯膜在氮气氛围下分别浸入o i mk c l 溶液和3 一 巯基丙酸液中1 2h ，分别得c 1 一和3 一巯基丙酸修饰的金纳米通道膜： 5 2 2 2 不同p h 条件下b s a 在金纳米通道膜上吸附 ( 1 ) 不同p h 值下b s a 的荧光性质 将b s a 溶于不同p h ( p h 为1 o o 、3 0 0 、4 7 0 、7 4 0 、9 0 0 ) 下的p b s 缓冲 液，在各p h 条件下测定b s a 的荧光强度与浓度的标准曲线。 ( 2 ) 不同p h 下金纳米通道膜对b s a 的吸附量 将镀金7h 的金纳米通道膜浸泡在5 m lb s a 浓度为1 5 1 0 “m 不同p h ( p h 为1 o o 、3 o o 、4 7 0 、7 4 0 、9 0 0 ) 下的p b s 缓冲液中，1 0h 后测定溶液荧光 强度，根据不同p h 下的标准曲线可得膜浸入1 0h 后溶液浓度，进而可得此时 溶液中b s a 的量，则溶液中b s a 减少的量即为吸附在金纳米通道膜上的量。 5 2 2 3 不同温度下b s a 在金纳米通道膜上吸附 将化学镀金7h 的金纳米通道膜浸泡在生理p h ( p h 为7 4 0 ) 条件下5 m lb s a 浓度为1 5 1 0 - 6mp b s 缓冲液中，将该溶液分别置于4 c 、1 5 c 、3 0 c 环境中， 1 0h 后，测得不同温度下各溶液中b s a 量的变化，进而得出不同温度下金纳米 通道膜对b s a 的吸附量。 5 2 2 4b s a 在不同孔径的金纳米通道膜上吸附 分别将化学镀金7h 、4h 、2h 的金纳米通道膜浸泡在p h 为7 4 0 、b s a 浓度为 1 5 1 0 - 6m 的5m lp b s 缓冲液中，每隔一段时间测定各自溶液的荧光强度， 进而确定不同孔径的金纳米通道膜对b s a 的吸附量。 5 2 2 5b s a 在化学修饰的金纳米通道膜上吸附 将化学镀金7h 的金纳米通道膜分别修饰c l 一和3 一巯基丙酸然后各自浸入 p h 为7 4 0 、b s a 浓度为1 5x1 0 咱m 的5 m lp b s 缓冲液中，1 0h 后测定各自溶液 的荧光强度，考察通道膜上的修饰剂对b s a 吸附量的影响。 4 1 第五章 f ：海师范大学硕士毕业论文 5 3 结果与讨论 5 3 1p h 对b s a 吸附量的影响 图5 1 为不同p h 条件下，b s a 在金纳米通道膜的吸附。由图可9 1 ：i - 吸附量 在b s a 的等电点处( p h 为4 7 0 ) 有最大值，低于等电点和高于等电点时吸附量均 有所下降，原因可能是p h d , 于4 7 0 时b s a 荷正电，p h 大于4 7 0 时荷负电，等电 点处b s a 所带净电荷为零，此时b s a 分子内的静电排斥力及分子问的横向相互作用 力处于最小状态n 2 削，易于b s a 的吸附。 o 0 5 5 o 0 5 0 o 0 4 5 o 0 4 0 o - 0 3 5 o 嘲 o 0 2 5 o123456789 p h 图5 一l 不同p h 值下b s a 在化学镀金7h 的金纳米通道膜的吸附量 5 3 2 时间及通道内径对b s a 吸附量的影响 当纳米通道膜浸入b s a 溶液中时，b s a 在聚碳酸酯膜( 原膜) 上的吸附在很短 时间内很快达到饱和状态( 如图5 2 d ) ，而在金纳米通道膜上的吸附则不同， 在6h 内随着时间的增长，b s a 在金纳米通道膜上的吸附量增加，6h 后吸附量 不再随时间而变化，此时b s a 在金纳米通道膜上的吸附达饱和( 如图5 2 a 、b 、c ) 。 一apcooc侣立lo西口 一 ：海师范大学硕上毕业论文 第五章 o 0 9 o 0 8 o 0 7 o 0 6 o 0 5 o 0 4 o 0 3 o 0 2 0 0 1 o o o 图5 - 2 不同孔径金纳米通道膜吸附：a ：2h b ：4hc ：7hd ：原膜 吸附量a b c d ，没有镀金的聚碳酸酯原膜对b s a 的吸附很少，金膜较 原膜更易于吸附b s a ，且随着制备金纳米通道膜时化学镀金时间的增长b s a 的吸附 量也增加。原因是化学镀金时间越长孔道内附着的金的厚度越大所得的纳米通道 的内径越小( 如图5 3 ，内径大小：a b c ) ，孔内的表面积越小，r p b s a 可吸附的表面积越小，吸附量越少。 磊 图5 3 化学镀金不同时间所得金纳米通道孔径示意图 a ：镀金2hb ：镀金4hc ：镀金7h 5 3 3 温度对b s a 吸附量的影响 考察了p h 为7 4 时，温度对b s a 在金纳米通膜上吸附量的影响。结果表明， 当温度为4 c 、1 5 。c 、3 0 c 时，各自的吸附量相等( 如图5 4 ) ，说明温度对b s a 在金纳米通道膜上的吸附量不会产生影响。 4 3 第五章上海师范大学硕士毕业论文 o - 0 6 o 0 5 童0 0 4 匕 垄0 0 3 日 a q0 0 2 口 口 o - 们 0 abc 图5 4 不同温度下金纳米通膜吸附量 ( a ) ：4 1 3 ( b ) ：1 5 ( 2( c ) ：3 0 ( 2 5 3 4 修饰剂对吸附的影响 金纳米通道膜经氯离子和3 一巯基丙酸修饰后，对b s a 的吸附量均减小，3 一 巯基丙酸修饰的金膜对b s a 的吸附较氯离子修饰的金膜吸附更少( 如图5 5 所 示) 。 a bg 图5 - - 5 修饰剂对吸附量的影响 a - 没有修饰b ：修饰氯离子c ：修饰3 一巯基丙酸 通道膜经修饰后膜及孔的表面部分被修饰剂所占据，从而导致b s a 吸附位点 的减少，故修饰后吸附量会降低。金纳米通道膜修饰氯离子时，由于氯离子之间 的排斥作用，使得孔壁上氯离子间存在着一定的间距，而修饰3 一巯基丙酸时， 在p h 为7 4 0 条件下，孔壁表面的3 一巯基丙酸不带电荷，使得3 一巯基丙酸较氯离 子在孔壁上分布更加致密( 如图5 6 ) ，从而导致吸附位点更少，对b s a 的吸附 一矗i_eooc再cllo弓 上海师范大学硕上毕业论文 第五章 量也越少。p h 为7 4 0 条件时，b s a 荷负电与膜上的氯离子产生静电排斥作用，理 应不产生吸附或吸附量很少，但结果却显示在静电排斥的情况下也会有蛋白的吸 附，这是因为溶液中的带相反电荷的小分子物质可吸附到带电荷基团附近从而 有效屏蔽静电排斥作用，蛋白在物理吸附的作用下吸附于材料上n 捌。 s h ( c h b ) , ；c o o h s h ( c i - h 1 2 c o o h s h ( c h h b c o o h s h ( c h 2b c o o h s h ( c h b c o o h s h ( c h hb c o o h s h ( c i h1 2 c o o h s h ( c h 2 ，1 2 c o o h s h ( c h 2 h c o o h 图5 6 孔壁表面示意图 a ：没有修饰b ：修饰氯离子c ：修饰3 一巯基丙酸 5 4 本章小结 本章以b s a 为研究对象，考察蛋白质在金纳米通道膜上的吸附。研究结果 表明：p h 、时间、金纳米通道孔径大小及修饰剂均可对b s a 的吸附量产生影响， 而温度对吸附量没有影响。在利用金纳米通道膜对蛋白质进行的分析应用中，可 通过对金纳米通道膜进行化学修饰的方法减小由蛋白质吸附产生的误差。 4 5 j1卅爿训盈1习。 叮 饼 饼 盯 崩11耐a11a b 结论上海师范人学硕1 ：毕业论文 结论 金纳米通道膜在物质的分离与检测领域存在着广泛的应用，本论文在实验室 已有工作的基础上开展了以下研究： ( 1 ) 以聚碳酸酯膜为基底，考察了摇床转动频率、p h 、温度、时间对金纳米 通道制备的影响。并确定摇床转动频率为1 5 0 1 8 0 r m i m 、p h 为1 0 、温度为4 c 是 金纳米通道制备的最佳条件，并通过透射电子显徽镜( t e m ) 表征证明制得了金 纳米通道膜。 ( 2 ) 制备了阿特拉津免疫原，并用氯离子修饰的金纳米通道对阿特拉津及阿 特拉津免疫原进行测试研究。通过加入抗体实现选择性，当阿特拉津免疫原及阿 特拉津分别加入含有抗体的进样池时，产生阿特拉津免疫原抗体、阿特拉津 抗体复合体，它们较单独的抗体在体积上要大，对电流产生阻碍作用，出现电流 衰减。而百草枯、敌草隆加入时不会与抗体结合，没有电流衰减产生，借此实现 了阿特拉津免疫原及阿特拉津的特异性检测。本方法对阿特拉津免疫原浓度在 2 5 6 1 0 , - - , 3 3 3 1 0 _ 7m 范围内有线性响应，检测限为1 7 1 0 叫1 t m ，对阿特 拉津则在1 1 1 1 0 。6 4 4 0 1 0 。6 m 浓度范围内有线性响应，检测限为0 6 1i t m 。 ( 3 ) 对金纳米通道进行氯离子修饰，考察b s a 迁移通过金纳米通道时引起 的电流响应。在电场作用下电解质离子通过纳米通道时产生稳定的电流，当 牛血清白蛋白( b s a ) 加入含b s a 抗体的进样池后，与溶液中的牛血清白蛋白 抗体分子形成b s a 抗体复合体，该大体积的复合体对电流产生一定的阻碍 作用，引起相应的电流降，基于此发展了纳米通道检测b s a 的传感技术。电 流降低值与b s a 浓度在3 6 4 1 0 一 - - - 5 4 6 1 0 _ 7m 范围内具有线性关系， 线性回归方程为i ( a ) = 2 2 1 6 1 0 - 9 + 1 9 6 4 1 0 - 8 c ( 1 0 - 7 m ) ，检测限为1 9 3 1 0 m 。 ( 4 ) 以b s a 为考察对象，研究蛋白质在金纳米通道膜上的吸附。p h 、时间、 金纳米通道孔径及修饰剂均可对b s a 的吸附量产生影响，而温度对吸附量没有影 响。在利用金纳米通道膜对蛋白质进行的分析应用中，可通过对金纳米通道膜进 行化学修饰的方法减小由蛋白质吸附产生的误差。 上海师范大学硕士毕业论文 参考文献 参考文献 【l 】a k e s o nm ，b r a n t o nd ，k a s i a n o w i c zjj ，e ta 1 m i c r o s e c o n dt i m e s c a l e d i s c r i m i n a t i o na m o n g p o l y c y t i d y l i ca c i dp o l y a d e n y l i ca c i da n dp o l y - u r i d y l i ca c i d a sh o m o p o l y m e r so ra ss e g m e n t s “t l l i i ls i n g l er n a m o l e c u l e s j b i o p h y s ，19 9 9 ， 7 7 ：3 2 2 7 3 2 3 3 【2 】k a s i a n o w i c zjj ，b r a n d i ne ，b r a n t o nd ，e ta 1 c h a r a c t e r i z a t i o no fi n d i v i d u a l p o l y n u c l e o t i d em o l e c u l e su s i n gam e m b r a n ec h a n n e l j p r o cn a t la c a ds c i u s a ，1 9 9 6 ，9 3 ：1 3 7 7 0 1 3 7 7 3 【3 】s o n gl ，h o b a u g hmi ls h u s t a kc ，e ta 1 s t r u c t u r eo fs t a p h y l o c o c c a l - h e m o l y s i n ，a h e p t a m e r i ct r a n s m e m b r a n ep o r e j s c i e n c e ，19 9 6 ，2 7 4 ( 5 2 9 4 ) ：18 5 9 18 6 6 【4 】d e a m e rdm ，a k e s o nm n a n o p o r e sa n dn u c l e i ca c i d s ：p r o s p e c t sf o ru l t r a r a p i d s e q u e n c i n g j t r e n d sb i o t e c h n 0 1 ，2 0 0 0 ，18 ：14 7 一i5 1 【5 】v e r c o u t e r ew ，w i n t e r shs ，o l s e nh ，e ta 1 r a p i dd i s c r i m i n a t i o na m o n g i n d i v i d u a ld n a h a i r p i nm o l e c u l e sa ts i n g l e n u c l e o t i d er e s o l u t i o nu s i n ga l li o n c h a n n e l j n a tb i o t e c h n 0 1 ，2 0 0 1 ，19 ：2 4 8 - 2 5 2 【6 】n a s h l u n dj ，t h y b e r gj ，t j e m b e r glo ，e ta 1 c h a r a c t e r i z a t i o no fs t a b l ec o m p l e x e s i n v o l v i n ga p o l i p o p r o t e i na n dt h ea m y l o i db e t ap e p t i d ei na l z h e i m e r sd i s e a s e b r a i n j n e u r o n ，19 9 5 ，l5 ：219 2 2 8 【7 】s e e b a c hd ，m a t t h e w sjl 1 3 - p e p t i d e s ：as u r p r i s ea te v e r yt u m j c h e mc o m m u n ， 1 9 9 7 ，2 1 ：2 0 1 5 - 2 0 2 2 8 】b a y l e yh ，c r e m e rps s t o c h a s t i cs e n s o r si n s p i r e db yb i o l o g y j n a t u r e ，2 0 0 1 ， 4 1 3 ：2 2 6 2 3 0 【9 】k a n gxf ，c h c l c ys ，g u a nx ，c ta 1 s t o c h a s t i cs e n s i n go fe n a n t i o m e r s j j a m c h e m s o c ，2 0 0 6 ，1 2 8 ：1 0 6 8 4 1 0 6 8 5 【10 】c h e l e ys ，x i eh ，b a y l e yh ag e n e t i c a l l ye n c o d e dp o r e f o rt h es t o c h a s t i c d e t e c t i o no fap r o t e i nk i n a s e j c h e m b i o c h e m ，2 0 0 6 ，7 ：19 2 3 19 2 7 【ll 】b r a h ao ，w e b bj ，g ulq ，e ta 1 c a r r i e r sv e r s u sa d a p t e r si ns t o c h a s t i c s e n s i n g j c h e m p h y s c h e m ，2 0 0 5 ，6 ：8 8 9 - 8 9 2 【12 】g u a nx ，g ulq ，c h e l e ys ，e ta 1 s t o c h a s t i cs e n s i n go f 耵盯w i t hag e n e t i c a l l y e n g i n e e r e dp o r e j c h e m b i o c h e m ，2 0 0 5 ，6 ：18 7 5 - 18 81 【13 】h o w o r k as ，n a mj ，b a y l e yh ，e ta 1 s t o c h a s t i cd e t e c t i o no fm o n o v a l e n ta n d b i v a l e n t p r o t e i n - l i g a n di n t e r a c t i o n s j a n g e w c h e m 1 1 1 t e d ，2 0 0 4 ，4 3 ： 8 4 2 8 4 6 4 7 参考文献上海师范大学硕上毕业论文 【14 】s h i n s h ，l u c h i a nt ，c h e l e ys ，e ta 1 k i n e t i c s o far e v e r s i b l e c o v a l e n t - b o n d f o r m i n gr e a c t i o no b s e r v e da tt h es i n g l e - m o l e c u l el e v e l j a n g e w c h e m i n t e d ，2 0 0 2 ，4 1 ：3 7 0 7 3 7 0 9 【15 】c h e l e ys ，g ulq ，b a y l e yh s t o c h a s t i cs e n s i n go fn a n o m o l a ri n o s i t o l l ，4 ，5 - t r i s p h o s p h a t ew i t ha l le n g i n e e r e dp o r e j c h e m b i 0 1 ，2 0 0 2 ，9 ：8 2 9 8 3 8 【16 】w uhc ，b a y l e yh s i n g l e m o l e c u l ed e t e c t i o no fn i t r o g e nm u s t a r d sb yc o v a l e n t r e a c t i o nw i t h i nap r o t e i nn a n o p o r e j j a m c h e m s o c ，2 0 0 8 ，13 0 ：6 813 - 6 819 17 】r o b e r t s o njwf ，r o d r i g u e srg ，s t a n f o r dvm ，e ta 1 s i n g l e m o l e c u l em a s s s p e c t r o m e t r yi ns o l u t i o nu s i n gas o l i t a r yn a n o p o r e j p r o e n a n a c a d s c i ， 2 0 0 7 ，1 0 4 ：8 2 0 7 8 2 11 【18 】m e l l e ra d y n a m i c so fp o l y n u c l e o t i d et r a n s p o r tt h r o u g hn a n o m e t r e - s c a l e p o r e s j j p h y s ：c o n d e n s m a t t e r ，2 0 0 3 ，15 ：r 5 8 2 - r 6 0 7 【19 】k a s i a n o w i c zjj ，r o b e r t s o njwf ，c h a ner ，e ta 1 n a n o s c o p i cp o r o u ss e n s o r s 【j 】a l l a n r e v a n a l c h e m ，2 0 0 8 ，l ：7 3 7 7 6 6 【2 0 】h e n d r i c k s o nse ，m i s a k i a nm ，r o b e r t s o nb ，e ta 1 d r i v e nd n at r a n s p o r ti n t oa n a s y m m e t r i cn a n o m e t e r - s c a l ep o r e j p h y s r e v l e t t ，2 0 0 0 ，8 5 ：3 0 5 7 3 0 6 0 21 】k a s i a n o w i c zjj ，h e n d r i c k s o nse ，w e e t a lhh ，e ta 1 s i m u l t a n e o u sm u l t i a n a l y t e d e t e c t i o n 谢t l lan a n o m e t e r s c a l ep o r e j a n a l c h e m ，2 0 0 1 ，7 3 ：2 2 6 8 - 2 2 7 2 【2 2 】h o r n b l o w e rb ，c o o m b sa ，w h i t a k e rrd ，e ta 1 s i n g l e m o l e c u l ea n a l y s i so f 。e i n a p r o t e i nc o m p l e x e su s i n gn a n o p o r e s j n a t m e t h o d s ，2 0 0 7 ，4 ：315 - 3 17 【2 3 】c o c k r o f tsl ，c h uj ，a m o r i nm ，e ta 1 as i n g l e m o l e c u l en a n o p o r ed e v i c e d e t e c t sd n ap o l y m e r a s ea c t i v