（分析化学专业论文）茶叶活性成分的荧光性质与分析方法研究.pdf

i 摘 要 研究了儿茶素和表儿茶素的荧光光谱性质，考察了实验条件对其荧光光谱的影响。 对西湖龙井茶和苦丁茶进行了荧光光谱的分析研究，建立了测定茶叶中儿茶素和表儿茶 素的新方法。利用柱色谱分离出两种色素物质，它们在 365 nm 紫外灯下均显红色荧光。 论文工作主要包括三部分： 1、研究了儿茶素和表儿茶素的内源荧光和敏化荧光性质，探讨了溶液酸度、有机 溶剂、金属离子、表面活性剂 sds 和 - cd 对荧光光谱的影响。儿茶素水溶液在酸性条 件下有稳定的荧光，最大激发和发射波长分别为 280 nm和 311 nm。5ph9 时，由于酚羟基质子的电离而使荧光消失。以 l- 色氨酸为参比， 测得儿茶素和表儿茶素的荧光量子产率分别为 0.062 和 0.047。 同时对茶叶中的咖啡碱和 茶碱的荧光光谱性质进行了初步的考察，发现二者自身均不发荧光。 2、研究了 21 种茶叶水浸液的三维荧光光谱，发现它们的图谱在短波处都有荧光峰 出现，并且光谱基本相似。详细研究了两种茶叶水浸液的荧光光谱性质，佐证了茶叶中 的主要成分为儿茶素类。此外，在选好的实验条件下，两种茶叶稀溶液中所含荧光组分 的荧光强度都与其浓度呈良好的线性关系，据此可以对茶叶中的荧光组分进行定量分 析。 3、用高效液相色谱法/荧光检测法对茶叶中儿茶素和表儿茶素同时进行定量分析， 建立了选择性测定药材中二者含量的新方法。 4、采用柱色谱方法对茶叶中色素类进行分离，得到两种在硅胶板上发红色荧光的 物质，研究了其三维荧光图谱，测量了 1h- nmr 图谱、13c- nmr 图谱、红外吸收光谱 和质谱，推测了其结构特征。 关键词：荧光光谱；儿茶素；表儿茶素；茶叶；柱色谱；荧光量子产率；高效液相 色谱 ii abstact in this thesis, fluorescence properties of (+)- catechin (c) and (- )- epicatechin (ec) were studied. influence of experimental conditions on f luorescence spectroscopy was inspected. the fluorescence spectra of west lake longjing tea and kuding tea were studied. two kinds of pigments with red color when irradiated with 365nm u v- irradiation were separated by column chromatography. the main contents of the thesis were as follows： 1. the native fluorescence and sensitized fluorescence properties of c and ec were studied.the impacts of acidity, organic solvents, metal ions, surface active agent (sds and - cd) on fluorescence spectroscopy were inspected. under acidic conditions, catechins solution had a stable fluorescence. the maximum excitation and emission wavelengths were 280 nm and 311 nm. as the acidity of solution changes from ph 5 to ph 9, fluorescence decreases. when ph greater than 9, flurescence disearpered due to phenolic hydroxyl proton ionization. using l- tryptophan as a reference, fluorescence quantum yields of c and ec were determined to be 0.062 and 0.047, respectively. the fluorescence character of caffeine and theophylline in tea was also studied, but no fluorescence was found. 2. three- dimensional fluorescence spectra of 21 kinds of tea were studied. it was found that they had the similar fluorescence peaks at short wavelengths. the fluorescence properties of two types of tea water extract were studied in detail. it was discovered that the main components of tea were catechins. in selected conditions, a good linear relationship between fluorescence intensity and concentration was found, which can be used for the quantitative determination of the fluorescence components of tea. 3. using a method of high- performance liquid chromatography with fluorescence detection, c and ec in the tea were determined at the same time. this new method can also be used for the determination of c and ec in chinese herbal medicines. 4. using column chromatography method, two kinds of red fluorescence substances in tea were separated. its three- dimensional fluorescence spectra were investigated, and their molecular character was estimated based on the measurement of 1h- nmr, 13c- nmr, infrared absorption spectroscopy and mass spectrum. key words: fluorescence spectroscopy; (+)- catechin; (- )- epicatechin; tea; column chromatography; fluorescence quantum yield; high- performance liquid chromatography 学位论文原创性声明 本人所提交的学位论文茶叶活性成分的荧光性质与分析方法研究 ，是在导师的 指导下，独立进行研究工作所取得的原创性成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。 对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中标明。 本声明的法律后果由本人承担。 论文作者（签名） ： 指导教师确认（签名） ： 年 月 日 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解河北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学 位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河北师范大学可以将学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保 存、汇编学位论文。 （保密的学位论文在 年解密后适用本授权书） 论文作者（签名） ： 指导教师（签名） ： 年 月 日 年 月 日 1 绪 论 中国，被称为茶的祖国。文字记载表明，在 3000 多年前，我们祖先已经开始栽培 和利用茶树1。人类的泡茶方法，也是经过代代相传，从茶叶的起源地扩到社会各个地 区。因为国内外市场需求量的增加，未来我国茶叶种植面积会不断扩大。现在中国是世 界茶产量第二大国、茶出口第三大国1。从国内来看，日常生活中喝茶的人越来越多， 茶已成为人们生活中不可缺少的精神饮品，而且，人们不断追求健康消费方式，茶正在 被越来越多的人喜爱。从国际需求来看，中国茶出口量不断增大。另外中国种植茶地区 受到当地政府和投资者的关注，茶产业开始走向正规化、现代化、规模化。在我国南方 产茶地区，茶生产已经被作为农民重要的产业。制造茶的工艺技术不段发展，开始从手 工化向机械化过渡2。 一、茶叶的研究现状 茶叶的化学成分 茶叶中富含的化学物质比较复杂，经过分离和鉴定的有机化合物就有 450 多种，其 中含量较高的是茶多酚和生物碱两种成分，它们都有很高的使用价值。 茶叶主要化学成分 the main chemical components of tea 茶叶化学成分 黄烷醇 酯型儿茶素 表儿茶素没食子酸酯 表没食子儿茶素没食子酸酯 花色素 非酯型儿茶素 没食子儿茶素 表没食子儿茶素 儿茶素 表儿茶素 黄酮醇 黄烷酮 茶多酚3- 11 其它 原花色素 咖啡酸 绿原酸 生物碱类5- 11 、 可可碱 茶碱 咖啡碱 黄嘌呤 黄酮类 槲皮素 芹菜素 牡荆素 肥皂草素 山奈酚- 3- 鼠李糖- (2? 1)- 葡萄糖苷 三萜类 茶叶皂苷 玉蕊醇 r1 茶皂醇玉蕊精醇 c 茶叶皂苷苷元 a 维生素类9- 11 维生素（b、c、p、a、d、k 和 e） 色素类12- 14 叶绿素（a、b） 脱镁叶绿素（a、b）脱镁叶绿酸酯（a、b） 叶绿酸酯（a、b） 2 茶叶的基本分类 中国茶叶据统计有 6000 多个品种，但按制做方式分类为大三类，即不发酵茶、半 发酵茶、全发酵茶；按商品分类为六大类，即红茶、绿茶、白茶、黄茶、黑茶、乌龙茶 （青茶） ，具体分类见上表。 茶叶的基本分类15- 22 the basic categories of tea 茶叶的基本分类 炒青绿茶 眉茶（炒青、特珍、珍眉、凤眉、秀眉、贡熙等） 珠茶（珠茶、雨茶、秀眉等） 细嫩绿茶（龙井、大方、碧螺春、雨花茶、松针等） 烘青绿茶 普通烘青（闽烘青、浙烘青、微烘青、苏烘青等） 细嫩烘青（黄山毛峰、太平猴魁、华顶云雾、高桥银峰等） 晒青绿茶 滇青、川青、陕青等 绿茶 燕青绿茶 煎茶、玉露等 白茶 白叶茶 白牡丹、贡眉等 不发酵茶 黄茶 黄芽茶（君山银针、蒙顶黄芽等) 黄大茶（霍山黄大茶、广东大叶青等) 黄小茶（北港毛尖、沩山毛尖、温州黄汤等） 半发酵茶 乌龙茶 闽北乌龙（武夷岩茶、水仙、大红袍、肉桂等） 闽南乌龙（铁观音、奇兰、水仙、黄金桂等） 广东乌龙（凤凰单纵、凤凰水仙、岭头单纵等) 台湾乌龙（冻顶乌龙、包种、乌龙等） 红茶 小种红茶(正山小种、烟小种等) 工夫红茶(滇红、祁红、川红、闽红等) 红碎茶(叶茶、碎茶、片茶、未茶) 全发酵茶 黑茶 湖南黑茶（安化黑茶等） 湖北老青茶（蒲圻老青茶等） 四川边茶（南路边茶、西路边茶等） 滇桂黑茶（普洱茶、六堡茶等） 3 茶叶的药理及临床应用研究 人体自然衰老是由于细胞受到氧自由基的氧化损害。在人体中 95 %自由基是氧自 由基（损伤生物大分） ，它们参与多种疾病发生发展6。自由基代谢所产生的过氧化脂质 是导致人体衰老的重要原因。茶叶可与过量的自由基结合，抑制氧自由基，减少增龄色 和脂褐素等损伤生物大分子的堆积，从而延长人的寿命。机体免疫功能的减退，是导致 人体衰老的另一重要原因，茶叶还能提高人体免疫机能，能够较好的防治放射线引起的 白细胞减少，抑制人体对放射线的吸收，降低 x射线对细胞的致死作用23 、24，达到提高 机体免疫功能的目的。 绿茶可以抑制癌细胞扩散，降低肺癌、皮肤癌、前列腺癌和胃肠癌的发生几率25 、26、 27。祁禄等研究了茶多酚的抗癌机理。分别让吸烟者饮（绿、红）茶、及茶多酚片，跟 踪血液中 8- 羟基脱氧鸟嘌呤、mda、血淋巴微核细胞率、染色体畸变率等指标的变化。 实验发现研究对象的尿液中 mda 的排出量明显降低。同时可抑制口腔粘膜微核染色体 畸变发生。保护吸烟所致的（dna、氧化）损伤。防止癌症的发生6。 应用 ames 试验，阮萃才等对(红、绿)茶进行抗诱变性研究, 发现两种它们对迭氮 钠 (nan 3)、黄曲霉毒素 b1 (a fb1)和 2- 氨基芴 (2- a f) 诱导的 ta (98、100)突变株 引起的突变有抑制作用。 毕宝元等研究了 b2- a6 和交链孢酚单甲醚 (am e) 诱导人胚肺 2bs 细胞 sce 的影响, 发现绿茶自身都不能增加 sce 的频率, 但有绿茶存在的情况 下, 由 b2- b6(0.1mg ml- 1) 和 am e (10ug ml- 1) 所诱导的 sce 频率偏低, 并成剂量- 效 应关系。程书钧等发现茶叶中抗氧化剂成份能够抑制 a fb1 对 v 79 细胞的突变作用。 其机理可能阻止细胞中 dna 的损伤，从而抑制了致癌物的代谢作用28。 研究表明茶中的茶多酚类能够明显地抑制肾上腺素 (adr)adp 诱导的血小板聚集, 对血浆 (prp) 产生的血栓素 b2 (txb2) 有明显的抑制作用。该效果可能是与降低细胞 内 ca2+的浓度有关。对茶多酚抑制血小板聚集作用，王振生等曾进行体外试验, 发现它 能使纤维蛋白原分解为腺苷环磷酸 (fdp), 阻止由 aa、adp 诱致的血小板聚集, 并发 现聚集后的 prp 中产生的 (cam p) 增高，茶多酚可能作用于前列腺代谢的中间环节, 作用机理与血小板释放的活性物质 (如 a g)、升高血小板内环磷酸腺苷的浓度有关 28。 二、茶叶中活性成分茶多酚的研究现状 茶多酚的种类 茶多酚在常温下呈浅黄色，暴露在空气中就会被氧化为其它衍生物。结构式中具 2- 4 苯并毗喃的苯基碳架，苯环上含有两个或 两个以上的邻位羟基，具备酚类化合物的 特性。茶多酚具有一定的分子氢键力，易 溶于温水和冰醋酸、乙醇、丙酮等含水的 有机溶剂中。在碱性环境下易氧化、聚合， 苯环上的羟基极易失去质子，具有一定的 还原电位，因此是一种理想的抗氧化剂。 o ho oh or2 oh oh or1 茶多酚的结构通式 the general formula structure of tea polyphenols 茶多酚又叫茶单宁。儿茶素是茶多酚里的重要化学成分，约占茶多酚总量的 65%80%。从茶叶的分类表中可以看到茶多酚种类较多，但从茶叶中提取的儿茶素主要 有以下 5 种。 ho oh o h oh h oh oh ho oh o oh oh oh 儿茶素 (+)- eateehin(c) 表儿茶素 (- )- epieateehin(ec) o ho oh oh oh oh oh o ho oh oh oh oh o o oh oh oh 表没食子儿茶素 (- )- epigallocatechin(egc) 表儿茶素没食子酸酯 (- )- epieatechingallate(ecg) oho oh oh oh o o oh oh oh 表没食子儿茶素没食子酸酯 (- )- epigallocateehingallate(egcg) 茶多酚的分离提取 茶叶中茶多酚的提取研究已经有了相当多的报道，有超声波浸提法29、树脂吸附法 5 30、31、微波浸提法32- 35等，茶多酚结构中含有多个羟基，利用这一结构特点，目前提取 的主要方法是溶剂浸提法36- 41、金属离子沉淀法42- 44。 超声波浸提法是利用超声波能够加速茶多酚向溶剂的扩散，该方法大大缩短提取时 间。水和溶剂放置浸提需要时间比较长，并且在加热时茶多酚还容易发生氧化作用，从 而导致产率下降，超声波浸弥补了传统提取方法的缺点。 茶叶粉末 热水浸提 超生波发生器（频率为20khz）处理 提取液 过滤 滤液 加入alcl3 ph=11 茶多酚-铝盐沉淀 离心，酸溶 茶多酚溶液 乙酸乙酯萃取 乙酸乙酯相 减压蒸馏，真空干燥 粗茶多酚 超声波法提取茶多酚过程示意图 the process of ultrasonic extraction of tea polyphenols 树脂吸附法是利用树脂的特性 吸附、解吸，把茶提液中的茶多酚先吸附在离子树 脂上，接着用适当溶剂淋洗分离混合物，最后减压浓缩、真空干燥得到茶多酚。 茶叶粉末 乙醇提取 提取液 纸滤 滤液 nk- s3树脂吸附 饱和树脂 水洗 树脂 混合液脱附 解吸液 减压蒸馏 浓缩液 真空干燥 粗茶多酚 树脂吸附法提取茶多酚过程示意图 the process of resin adsorption extraction of tea polyphenols 溶剂浸提取法过程比较简单、省时，被广泛应用于工业领域。常用的溶剂有水、乙 醇、乙酸乙酯、丙酮等，茶多酚很易溶于这些溶剂，可直接从茶叶中把它们分离出来。 茶叶粉末 85%乙醇 40.c水浴，加热20min 提取液 过滤 滤液 45.c水浴 减压蒸馏 浓缩液 氯仿萃取 有机相 水相 弃去 乙酸乙酯萃取 水相乙酸乙酯萃取液 45.c减压蒸馏 真空干燥 茶多酚粗品 溶剂浸提法提取茶多酚过程示意图 the process of solvent extraction of tea polyphenols 6 茶叶粉末 乙醇提取 提取液 过滤 滤液 0.4mol/l zncl2溶液 15%nahco3水溶液调 ph 茶多酚-锌盐沉淀 离心，3mol/l hcl溶液 茶多酚酸溶液 nacl盐析 弃去 絮状沉淀 上清液 15%nahco3水溶液调ph 乙酸乙酯萃取 弃去 水相乙酸乙酯相 vc溶液洗涤 减压蒸馏,真空干燥 茶多酚粗产品 金属离子沉淀法提取茶多酚过程示意图 the process of metalion precipitation extraction of tea polyphenols 因茶多酚苯环上含有两个或两个以上的邻位羟基结构特点，能与某些金属离子络合 生成沉淀，利用这一化学特性，使它们从浸提液中分离出来，目前多用 mg2+、ca2+、 a13+、zn2+、ba2+等来沉淀提取 tp。 茶多酚含量的测定研究 茶多酚是茶叶中的主要活性成分，主要的分析测定方法有原子吸收分光光度法 45- 47、紫外分光光度法47- 49、高效液相色谱法50- 58 、红外光谱法59- 61、高效薄层色谱 (hptlc)法62 、63等。 原子吸收分光光度法是一种间接测定茶叶中茶多酚的含量的方法，目前文献主要利 用金属铜离子去络合茶叶中的茶多酚，利用原子吸收分光光度法测定溶液中剩余金属铜 离子，通过换算求出茶多酚的含量。如王吉德等用茶多酚和 cu3(po4)2反应生成 cu- 茶多 酚沉淀络合物。用该方法测定滤液中过量的 cu，间接测定茶多酚。 紫外吸收分光光度法测定茶叶中的茶多酚，茶多酚其结构通式见上图，根据结构中 r1、r2基的不同，茶多酚分为黄烷醇类、黄酮醇类、羟基- 4- 黄烷醇类等物质。由于茶 多酚有共轭双键结构，茶多酚在 205 nm和 375 nm 有最大吸收峰，其它酚酸类在该波段 内没有吸收峰，故选择该波长，用直接紫外吸收分光光度法测定茶多酚的总量。廖晓玲 发现茶多酚能钼酸铵反应，生成物最大吸收波长为 341 nm。用该方法测定。 高效液相色谱法测定了茶叶中的茶多酚，莫燕霞等人将茶叶提取过滤后，取一定量 7 的滤液直接注入色谱柱，采用甲醇- 水- 甲酸做为流动相，在 waters xbridge c18色谱柱、 柱温 40 、检测波长 280 nm 的实验条件下实现了茶叶中茶多酚的分离。并进行了含量测 定，实验结果理想。罗晓明等人以水- 甲醇- 乙酸为流动相，在 alltima c18色谱柱、柱温 30 、检测波长 280 nm 的实验条件下实现了茶叶中儿茶素的分离。高效液相得分析时间 短，成为一种快速、准确测定茶叶中儿茶素的方法。 红外光谱法测定茶多酚是由于该物质有 c- o、o- h、c- h 等基团，这些基团的弯曲 振动、伸缩振动的差频和合频够能产生特征吸收峰。有吸收峰的强度不同反映茶叶中茶 多酚含量不同。quansheng chen等人用近红外（nir）作为快速方法定量茶叶中总多酚 含量，结合最小二乘法（pls）算法。预测模型的相关系数分别的 r = 0.9299。近红外 光谱多元校正技术， 是一种快速的测定方法来确定茶叶的有效成分， 控制工业生产过程。 芦水军等人傅里叶变换光谱仪，选定 10002500 nm为固定波长漫反射式测量，结合偏 最小二乘回归方法实现茶多酚的快速测定。 高效薄层色谱(hptlc)吸收法是实验室常用的一种分离技术，根据不同化合物具有 不同的极性，选用合适的展开剂，将其在薄层板上达到基线分离再去定量，茶叶成分复 杂，主要以儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素等为主，应用该技术能够实现茶多酚的 快速定量。朱敏等用高效薄层色谱(hptlc)法测定茶叶茶多酚含量，将各种标准品各称 量 1mg 置于 1ml 容量瓶中，甲醇溶解定容，然后取适量点于薄层板上，溶剂为选用正 丁醇- 甲酸- 氯仿- 甲酸乙酯=(0.4：0.3：2：1.3)，在展缸里展开，结果在该条件下各儿茶 素实现的分离。然后对其进行薄层扫描定量。 三、荧光分析法的应用 荧光分析法的灵敏度高，草药中的微量及痕量物质常用此法进行测定。荧光分析法 应用非常的广泛，可应用于无机物、有机物及生物分子的分析。从无机化合物分子结构 看，它们不具备发荧光的条件，这些无机分子能够与有机荧光试剂配位形成发光体系， 从而达到测定目的。实验室常用的荧光试剂有 8- 氨(羟)基喹啉类及衍生物、绕丹宁类、 腙类、氨基硫脲类、罗丹宁类、噻唑类等，这些试剂可用于测定铝、钡、镁、等多种元 素64。 间接法是测定无机化合物的另外一种方法， 如超氧离子65、 氟离子66、 铁离子67、 铜离子68等能使荧光减弱，其减弱的程度与猝灭剂的浓度成计量关系，这些无机物可以 利用荧光猝灭法测定。具有内在荧光的有机芳族化合物和生物物质，可直接采用荧光分 析法进行测定，或者通过与某些荧光试剂结合后测定，如黄酮69 、70、维生素71、72、生 物碱73等许多有机物质可直接用荧光分析测定。因此荧光分析技术在食品74、药物75、 8 环境76、中草药鉴定79等领域占有重要地位。 荧光分析法在科研领域引起人们的高度重视，电子学、计算机、激光等新技术的飞 速发展，加速了荧光分光光度计使用范围，可做为实验室新型分析仪器检测器。如荧光 分光光度计被广泛用作高效液相色谱80 、81、毛细管电泳82、83、薄层扫描84、85等分析方 法的检测器。 四、本文研究内容及其意义 本文主要对茶叶及其荧光成分的光谱性质进行了研究。茶叶中的化学成分比较复 杂，已报道的有机化合物就有 450 多种。本文首先对茶叶中活性成分儿茶素和表儿茶素 的荧光光谱性质进行了研究。考察了酸度、溶剂、表面活性剂等对其荧光光谱的影响， 并在最佳的实验条件下测得了它们的荧光量子产率。另外对咖啡碱和茶碱的荧光性质进 行了考察。 在前人研究的基础上，采用高效液相色谱/荧光检测法对儿茶素和表儿茶素同 时进行定量分析，在一定浓度范围内，发现两物质线性关系良好。同时研究了两种茶叶 水浸液的荧光光谱性质，进而为茶叶中荧光物质的定量分析提供依据。采用柱色谱方法 对茶叶中色素物质进行了分离，得到两种在硅胶板上发红色荧光的物质，并对其光谱进 行了研究比较，测量了其中一种的核磁共振氢谱、碳谱和质谱，并对其结构进行了分析。 本文研究结果将为茶叶中化学成分的分析提供基础资料。 9 1 茶叶活性成分的荧光光谱研究 儿茶素(+)- catechin)和表儿茶素(- )- epicatechin)互为构象异构体，属于黄烷醇类化 合物。三叶委陵菜、白桦树皮、宝枫叶等药材中主要含有儿茶素；鸡血藤中、大叶钩藤、 黄皮、荞麦、宝枫叶等药材中主要含有表儿茶素。儿茶素类物质，是茶叶中最主要的活 性成分。具有抗动脉粥样硬化、消除人体自由基、抗癌等作用86。 儿茶素类为白色固体，亲水性较强，易溶于热水、甲醇、含水乙醚和乙酸乙酯等溶 剂，但在苯、氯仿、石油醚等溶剂中很难溶解。常采用红外光谱法、分光光度法、流动 注射法等化学分析方法测定药材中儿茶素的总量，但要测定儿茶素单体的含量，则需采 用色谱法分析测定47。运用光谱手段对儿茶素类单体荧光性质的研究少见文献报道。儿 茶素结构见图 1.1，表儿茶素结构见图 1.2。 ho oh o h oh h oh oh ho oh o oh oh oh 图 1.1 儿茶素的结构图 scheme 1.1 molecular structure of (+)- catechin 图 1.2 表儿茶素的结构图 scheme 1.2 molecular structure of (- )- epicatechin 1.1 儿茶素的荧光光谱与荧光量子产率 1.1.1 实验部分 1.1.1.1 仪器与试剂 868 型 ph/ise 测试仪；uv- 2501pc 分光光度计；f- 4500 荧光分光光度计；容量瓶 (10ml)。 儿茶素(中国药检所，编号：877- 200001)：用水配成 288.0 g ml- 1溶液，扫描时适 当稀释； l- 色氨酸(层析纯)： 以水配成 0.2 mg ml- 1溶液， 扫描时适当稀释。 - 环糊精( - cd， 生物试剂)、磷酸氢二钠 磷酸二氢钾缓冲溶液(1/15 mol l- 1)、氢氧化钠溶液(1.0 mol l- 1)、 盐酸溶液(0.1 mol l- 1)、二次去离子水。 1.1.1.2 实验方法 分别加入一定量的儿茶素溶液、磷酸氢二钠 磷酸二氢钾缓冲溶液、氢氧化钠溶液 和盐酸溶液于 10 ml容量瓶中，以水定容至刻度，摇匀，然后扫描其光谱图。最后测其 ph。 10 分别加入一定量的儿茶素溶液、辅助试剂 ( - cd、甲醇、常见金属离子) 于 10 ml 容量瓶中，以水定容至刻度，然后扫描其光谱图，研究各种附加试剂对其荧光光谱的影 响。 1.1.2 结果与讨论 1.1.2.1 儿茶素三维荧光光谱 等高线光谱比较直观，荧光峰的强度和位置以及荧光光谱的某些特性易从图上观察 到。在酸性条件(ph=2.82)下，扫描儿茶素的三维等高线荧光光谱如图 1.3 所示，以平面 坐标的纵轴表示激发波长，横轴表示发射波长，平面上的点表示由两个波长所决定的样 品的荧光强度。将强度相等的各个荧光点连结起来，便在 ?ex- ?em构成的平面上显示了 一系列等强度线组成的等高线光谱， 图中圆圈中点处荧光强度最强， 从中心向两边延伸， 荧光强度逐渐减弱。 图中位于?ex/?em235 nm/311 nm和280 nm/311 nm有两个荧光峰， 其发射波长相同，从图上可以看出 ?ex (280 nm)处的荧光强度最强，所以在研究各种外 界环境因素(酸度 溶剂 表面活性剂)对其荧光强度影响时，选择该波长进行测定，但发 现 ?ex (280 nm)、?em (311nm)处有水的拉曼散射的干扰，所以在对其定量时应扣除该背 景值。 250300350400450 200 220 240 260 280 300 320 340 ex em 250300350400450 200 220 240 260 280 300 320 340 ex e m 图 1.3 儿茶素的三维荧光光谱 fig.1.3 fluorescence spectra of (+)- catechin ph=2.82 , c(+)- catechin: 4.32 g ml- 1, slit:5.0 nm/5.0 nm , interval: 10 图 1.4 儿茶素三维荧光光谱 fig.1.4 fluorescence spectra of (+)- catechin ph=7.83, c(+)- catechin: 4.32 g ml- 1, slit: 5.0 nm/5.0 nm, interval: 10 在 ph=7.83 条件下，测得儿茶素的三维荧光光谱图，随着 ph 升高，儿茶素圆圈中 点处的亮度发生了变化如图 1.4 所示，图中的荧光峰位置没变，激发和发射波长仍然位 于 ?ex/?em235 nm/311 nm 和 280 nm/311 nm。对比图 1.3 荧光强度显著减弱，表明酸 度对儿茶素光谱的变化有显著影响。 11 用氢氧化钠溶液(1.0 mol l- 1)将溶液酸 度调到碱性区域，图 1.5 是儿茶素在 ph=11.35 条件下的荧光光谱，从图中可以 看出儿茶素位于 ?ex/?em235 nm/311 nm 和 280 nm/311 nm荧光峰消失，表明碱性 条件下不利于儿茶素荧光光谱的研究，在 该条件荧光法定量药材中其它成分时，儿 茶素不会对其造成干扰。有儿茶素结构图 1.1 可知，芳环上有多个可离解的质子，是 一种有机弱酸，溶液酸度的变化将影响儿 茶素溶液中不同型体的比例，导致荧光峰 的强度降低或升高。因扫描三维荧光用时 比较长，并且会缩短氙灯的使用寿命。所 以接下来研究了不同酸度下儿茶素的二维 荧光光谱。 250300350400450 200 220 240 260 280 300 320 340 ex em 图 1.5 儿茶素的三维荧光光谱 fig.1.5 fluorescence spectra of (+)- catechin ph=11.35, c(+)- catechin : 4.32 g ml- 1 slit: 5.0 nm/5.0 nm, interval: 10 1.1.2.2 儿茶素在不同酸度下的荧光光谱 考察了硼砂对儿茶素荧光光谱的影响，发现儿茶素在其溶液中荧光强度减低，所以 用磷酸氢二钠 磷酸二氢钾缓冲溶液(1/15 mol l- 1)、hcl(0.1 mol l- 1)和 naoh(1.0 mol l- 1) 替代实验室常用的三酸缓冲溶液来调节 ph。测量儿茶素的二维荧光光谱和紫外吸收光 谱。 200250300350400 0 100 200 300 400 500 fluorescence intensity /nm ph 2.23- 5.92 200250300350400 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 fluorescence intensity /nm ph 5.92 6.92 7.42 7.66 7.83 8.05 8.38 8.54 8.90 9.40 图 1.6 儿茶素在酸性溶液中的荧光光谱 fig.1.6 fluorescence spectra of (+)- catechin in acidic condition c (+)- catechin: 4.3 g ml - 1 ?ex ex / ?em: 280/311 nm, slit: 5.0 nm/5.0 nm 图 1.7 儿茶素在近中性溶液中的荧光光谱 fig.1.7 fluorescence spectra of (+)- catechin in near neutral condition c (+)- catechin: 4.32 g ml - 1 ?ex / ?em: 280/311 nm, slit: 5.0 nm/5.0 nm 儿茶素在 ph 26 范围荧光光谱如图 1.6 所示，位于 ?ex (280 nm)、 ?em (311nm)处的 12 荧光强度稳定、且保持不变。后期工作中用缓冲溶液控制儿茶素的 ph，在该酸度范围 对其荧光量子产率和药材中该成分的定量进行研究。 儿茶素在ph 610酸度范围内的荧光光谱如图1.7所示， 随着ph值的升高， 位于?ex (280 nm)、?em (311nm)处的荧光强度逐渐减弱，儿茶素芳环上的- oh 基转为- o-离子， 通常酚盐的荧光强度要比其共轭酸弱的多，故荧光强度迅速降低。大约 ph=9.40 时芳环 羟基上的质子全部电离，到强碱性范围，荧光强度稳定不变如图 1.8 所示。 240260280300320340360 0 5 10 15 20 25 30 35 40 fluorescence intensity /nm 9.40- 12.83 02468101214 0 100 200 300 400 500 fluorescence intensity ph 图 1.8 儿茶素在碱性溶液中的荧光光谱 fig.1.8 fluorescence spectra of (+)- catechin in alkaline condition c (+)- catechin: 4.32 g ml - 1 ?ex / ?em: 280/311 nm, slit: 5.0 nm/5.0 nm 图 1.9 酸度对荧光强度的影响 fig.1.9 curve of acidity and fluorescence strength c (+)- catechin: 4.32 g ml - 1, ? ex / ?em: 280/311 nm, slit: 5.0 nm/5.0 nm 固定激发 ?ex(280 nm)和发射波长 ?em(311 nm)扫描荧光光谱， 绘制荧光强度随酸度变 化的关系图 1.9。随酸度变化质子解离情况如表 1.1 所示，从表中可以看到在 ph 26 范 围儿茶素的荧光最强、且荧光强度稳定；近中性条件荧光逐渐减弱；减性条件下儿茶素 的荧光最弱。 表 1.1 儿茶素的质子电离 table 1.1 ionization process of (+)- catechin 酸度范围 ph 质子情况 型体类型 荧光强度 ph（26） 分子型体 荧光最强 ph9 型体 弱荧光 有结构式可知，儿茶素苯环上有四个易电离的羟基，ph 值的改变影响儿茶素的离 解平衡，可以推断，随着酸度变化，儿茶素的型体发生如下变化： 13 ho oh o h oh h oh ohoh h ho oh o h oh h h oh h o o o h oh h o o i ii iii oh oh 图 1.10 儿茶素的质子电离 fig.1.10 ionization process of (+)- catechin 1.1.2.3 儿茶素在不同酸度下的的紫外吸收光谱 200250300350 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 abs /nm ph 1.28- 6.48 200300400500 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 abs /nm ph 12.16 11.35 10.52 9.47 8.54 7.42 200300400500 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 abs /nm ph 12.16 12.56 12.83 图 1.11 儿茶素素在不同酸性溶液中的吸收光谱 fig.1.11 absorption spectra of (+)- catechin at different ph c (+)- catechin: 4.32 g ml - 1 儿茶素的紫外吸收光谱如图 1.11。随着溶液酸度的变化，儿茶素的吸收光谱发生了 明显的不规律变化，在 ph 17 范围内吸收光谱稳定、且保持不变，波长 279nm 有最大 14 吸收， 该波长与图1.3、 1.4 激发峰的位置对应。 儿茶素类在ph 712范围内波350 nm500 nm处出现了新的吸收峰，吸光度随 ph 升高而增强，并发生了蓝移；在强碱性范围内， 波长 350 nm500 nm 处的吸收峰强度随 ph 升高而减弱，并发生红移，儿茶素紫外光谱 吸收波长的波动，也说明儿茶素的型体发生了变化。但无明显的等色点出现，可能由于 儿茶素结构中有多个可离解的羟基 h，推测其结构中羟基 h 的离解程度相差不大，电离 时互相干扰，无法对其电离常数进行测定。 1.1.2.4 甲醇浓度对儿茶素荧光光谱的影响 由于溶剂分子与溶质在同一溶液中存在静电作用，从而导致研究对象在不同溶剂中 荧光峰的强度和位置发生变化。固定儿茶素浓度不变，加入不同量的甲醇溶液，儿茶素 的荧光强度随甲醇含量的增加成正比例变化，在 90%100%的甲醇溶液中儿茶素的荧光 最强。 200250300350400 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 fluorescence intensity /nm m e t h a n o l ( v ) 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0 0.00.20.40.60.81.0 400 500 600 700 800 900 1000 fluorescence intensity methanol volume percentage 图 1.12 不同甲醇含量时儿茶素的荧光光谱 fig.1.12 fluorescence spectra of (+)- catechin in methanol c (+)- catechin: 4.32 g ml - 1, c nacl: 0.1 mol ml - 1, ?ex / ?em: 280/311 nm, slit: 5.0 nm/5.0 nm 1.1.2.5 常见金属离子对儿茶素光谱性质的影响 目前有许多关于儿茶素类与金属离子相关报道。研究儿茶素与金属离子光谱性质, 在医学、药学有着重要的意义，重金属能与体内大分子结合，使其不能发挥正常生理作 用，在体内，儿茶素能和过量的重金属离子发生作用，抑制重金属过量引起的身体的不 适。茶叶中富含的儿茶素类含有多个酚羟基，可与多种金属离子络合。固定儿茶素的浓 度，加入常见的金属离子，测其光谱。见下图1.13、1.14， ca2+、mg2+、al3+加入儿茶 素溶液后，使儿茶素的荧光有不同程度的猝灭，对其吸收光谱基本上没有影响，最大吸 收波长仍然为279 nm；具有氧化性的cu2+、fe3+对儿茶素的荧光也有猝灭作用，并对其 吸收光谱有显著影响，最大吸收波长都发生红移。初步推断mg2+、ca2+、al3+ 主要通过 15 与儿茶素络合，降低儿茶素浓度，从而导致其荧光强度的下降；儿茶素极易被氧化，推 测高价的金属离子cu2+，fe3+将其氧化为其它衍生物，故导致儿茶素荧光强度的猝灭87。 200250300350400450 0 50 100 150 200 250 300 350 fluorescence intensity /nm 儿茶素 儿茶素+ c a c l 2 儿茶素+ m g c l 2 儿茶素+ c u s o 4 儿茶素+ a l c l3 儿茶素+ f e c l 3 图 1.13 金属离子对儿茶素荧光光谱影响 fig.1.13 the role of metal ions on (+)- catechin c (+)- catechin: 2.88 g ml- 1, c metal ion: 0.01 mol l- 1, ?ex / ?em: 280/311 nm, slit: 5.0 nm/5.0 nm 200250300350 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 abs /nm 儿茶素 儿茶素+ c a c l 2 儿茶素+ m g c l 2 儿茶素+ a l c l 3 200300400500600 0 1 2 3 4 5 abs /nm 儿茶素+ f e c l 3 儿茶素+ c u s o 4 儿茶素 图 1.14 金属离子对儿茶素吸收光谱影响 fig.1.14 the role of metal ions on (+)- catechin c (+)- catechin: 2.88 g ml - 1, c metal ion: 0.01 mol l - 1 1.1.2.6 - cd 对儿茶素荧光光谱的影响 表面活性剂被广泛应用于科研领域，它能够提高荧光分析方法的选择性和灵敏度， 它的胶束溶液光学上稳定、透明，是非光活性物质。对有机发光分子具有增稳、增敏的 作用。 儿茶素自身荧光并不是很强，试图对其荧光进行增敏。实验发现十二烷基硫酸钠对 儿茶素荧光无增敏； - 环糊精对儿茶素荧光有显著增敏。 - cd 是由 7 个葡萄糖分子以 1,4- 苷键连接而成的环状低聚糖， - cd 分子结构中 外缘易亲水，而空腔易疏水，其疏水的空腔能与许多有机分子发生络合，形成主客体包 合物，这种包合物稳定，能够使荧光增强。如下图 1.15 为儿茶素随 - cd 浓度变化的荧 16 光光谱，从图中可以看出荧光强度随 - cd 加入量的增加成正比例变化，由于儿茶素分 子在疏水作用和氢键力的作用下，进入 - c