（分析化学专业论文）提高单细胞分析选择性和芯片电泳进样性能的研究.pdf

浙江大掌博士掌位论文 擅要 摘要 芯片毛细管电泳( c h i p - b a s e dc e ) 是微全分析系统的一个重要研究领域，因 具有分析速度快、样品和试剂消耗少、易于集成化等优点，其价值已被不同领域 的科学家所认知和肯定。但在对成分复杂的单细胞内组分进行分析时，因芯片的 通道长度有限，很难将细胞内所有感兴趣的物质都分离鉴定。 进样方法决定了样品塞的质量和形状。样品塞的质量和形状又直接影响到分 离效率。所以进样方法的选择对芯片毛细管电泳技术至关重要。近来，进样量可 调的进样方法越来越受到关注。然而在目前一些体积可变的进样方法中，均需要 四个或四个以上的电极结合复杂的供电电源，通过几次电动夹流进样才能实现。 针对上述问题，我们使用芯片毛细管电泳技术结合选择性标记测定了单个 h e p g 2 细胞内的活性氧( r o s ) 的重要组分超氧阴离子( 0 2 - ) 。首次在芯 片毛细管区带电泳中，用负压结合电动力实现了可变体积的进样方法。 第一章综述了细胞内的标记方法及芯片毛细管电泳中的进样方法。 第二章报道了用透膜荧光试剂( d h e ) 选择性标记后继用芯片毛细管电泳测 定单细胞内的0 2 一的方法。近来文献报道，d h e 的光化学氧化产物溴乙啶( e + ) 干扰荧光成像技术中单细胞内0 2 一的测定。本方法可以在2 0s 内很好地分离0 2 一 标记后的荧光产物2 一羟基溴乙啶和e + 。检测下限达到了2 0a m o l ，比h p l c e c 技术低了三个数量级，比h p l c 荧光检测技术低了五个数量级。并且，不同于 h p l c 的分析结果，在本方法中只检测到了2 一羟基溴乙啶一种物质，说明用微 流控芯片分析单细胞时，可以避免d h e 光化学氧化成e + 现象的发生。 第三章研究了用一个廉价的负压装置结合一组高压电源实现了芯片毛细管 区带电泳中进样量可调的进样方法。通过调节施加在样品废液池( s w ) 上的负 压和缓冲液池( b ) 与缓冲液废液池( b 聊两端的电压大小。样品池中的样品在负 压作用下无歧视地输送到芯片十字交叉口后，样品在电场的作用下注入分离通 道。进入分离通道样品带的长度和进样电压，进样时间成正比。撤去s w 池上的 擅要 负压，s ，b 池流向s w 的液流也随着负压的撤消而消失，进入分离通道的样品塞 在电场的作用下开始电泳分离。通过控制b 池的液面高于s 和s w 池的液面， 避免了分离过程中样品泄漏到分离通道中的现象。在本方法中，仅需控制进样时 间就可以实现任意长度样品带的进样。 关键词：微流控芯片毛细管电泳，细胞内的标记，选择性标记，超氧阴离子，可 变体积进样，灵敏度 h 浙江大掌博士掌位论文a b s t r a c t a b s t r a c t c h i p b a s e dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c h i p b a s e dc e ) h a se m e r g e da sa m a i na r e ao fd e v e l o p m e n ti nt h ef i e l do fm i c r o t o t a la n a l y s i ss y s t e m s ( p t a s ) a n dk n o w nf o ri t s h i g hs p e e da n a l y s i s ，m i n u t es a m p l ea n dr e a g e n t c o n s u m p t i o na n de a s yt oi n t e g r a t e h o w e v e r , c h i p b a s e dc el i m i t st h ec o l u m n c a p a c i t yd u et ot h es h o r ts e p a r a t i o nc h a n n e l i ti sd i f f i c u l tt os e p a r a t ea n d i d e n t i f ya l lt h ei n t r a c e l l u l a rs p e c i e si n t e r e s t e d s a m p l ei n j e c t i o ni sc r u c i a lb e c a u s ei td e t e r m i n e st h eq u a n t i t ya n dt h e s h a p eo fas a m p l ep l u g ，b o t ho fw h i c ha r ec l o s e l yr e l a t e dt os e p a r a t i o n r e c e n t l y , t h e r ei sag r o w i n g i n t e r e s ti n d e l i v e r i n g v a r i a b l e v o l u m es a m p l e p l u g s i n t o s e p a r a t i o nc h a n n e l h o w e v e r ，f o u r o rm o r ee l e c t r o d e sw i t h c o m p l i c a t e de l e c t r i cp o w e rs u p p l i e sa n di m p l e m e n t a t i o na r en e e d e dt ov a r y t h ev o l u m eo ft h es a m p l e p l u g sw i t hm u l t i p l e e l e c t r o k i n e t i c p i n c h i n g t e c h n i q u e s t h ep r e s e n tw o r kr e p o r t sa nu l t r a s e n s i t i v em e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o n o fi n t r a c e l l u l a rs u p e r o x i d e ( 0 2 一) i ni n d i v i d u a lh e p g 2c e l l sb yc h i p b a s e dc e a f t e rl a b e l i n gw i t has p e c i f i cp r o b ed i h y d r o e t h i d i u m ( d h e ) a n dp r o p o s e sa v a r i a b l e - - v o l u m es a m p l i n gs c h e m ef o rc h i p - b a s e df r e e - z o n ee l e c t r o p h o r e s i s u s i n gn e g a t i v ep r e s s u r ec o m b i n e dw i t he l e c t r o k i n e t i cf o r c ef o rt h ef i r s tt i m e i nc h a p t e r1 。i n t r a c e l l u l a rl a b e l i n gm e t h o da n ds a m p l el o a d i n gm e t h o d u s e df o rc h i pb a s e dc ea r er e v i e w e d i n c h a p t e r2 ，d i h y d r o e t h i d i u m ( d h e ) w a su s e d a st h es p e c i f i c f l u o r e s c e n tp r o b et or e a c tw i t hi n t r a c e l l u l a rs u p e r o x i d e ( 0 2 ) t of o r mt h e f l u o r e s c e n t 2 一h y d r o x y e t h i d i u m t h ee l e c t r o p h o r e t i c b e h a v i o r o f 2 - h y d r o x y e t h i d i u ma n de t h i d i u mc a t i o n ( e + ) ，w h i c hw a sr e c e n t l yr e p o r t e d t o b eg e n e r a t ef r o m p h o t o c h e m i c a l o x i d a t i o no fd h ea n di n t e r f e r et h e d e t e r m i n a t i o no f0 2 一w i t hf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p i ct e c h n i q u e 。w a ss t u d i e d t h ee x c e l l e n tr e s o l u t i o nb e t w e e n2 - h y d r o x y e t h i d i u ma n de t h i d i u mc a t i o n ( e + ) i l l 浙江大掌博士掌位论文a b s t r a c t c a nb ea c h i e v e dw i t h i n2 0s a ne x t r e m e l yl o wd e t e c t i o nl i m i to f2 0a m o lw a s a c h i e v e dw h i c hi sm o r et h a nt h r e eo r d e r so fm a g n i t u d el o w e rt h a nt h a t o b t a i n e db yu s i n gh p l c e ca n df i v eo r d e r so fm a g n i t u d el o w e rt h a nt h a t o b t a i n e db ye m p l o y i n gh p l cf l u o r e s c e n c ea n a l y s i s d i f f e r e n tf r o mt h eh p l c a n a l y s i sr e s u l t s ，o n l y2 - h y d r o x y e t h i d i u mb u tn o te + w a sd e t e c t e d ，i n d i c a t i n g t h a tp h o t o o x i d a t i o no fd h et oe + w a sa v o i d e db yu s i n gt h es u g g e s t e d s i n g l e c e l la n a l y s i sm e t h o d i nc h a p t e r3 ，av a r i a b l e - v o l u m es a m p l el o a d i n gs c h e m ef o rc h i p b a s e d f r e ez o n ec ew a sd e v e l o p e d b yn e g a t i v ep r e s s u r e c o m b i n e dw i t h e l e c t r o k i n e t i cf o r c e t h i sw a sa c h i e v e db yu s i n gal o w - c o s tm i c r o v a c u u m p u m pa n das i n g l ep o t e n t i a ls u p p l ya tac o n s t a n tv o l t a g e b ya d j u s t i n gt h e s u b a m b i e n tp r e s s u r ea p p l i e dt ot h eh e a d s p a c eo fs a m p l ew a s t er e s e r v o i r ( s v v ) a n dt h ee l e c t r i cf i e l db e t w e e nba n db w , t h ec h a r g e ds a m p l ei nt h e s a m p l ef l o wc a nb ed r i v e ni n t ot h es e p a r a t i o nc h a n n e l t h ei n j e c t e ds a m p l e p l u gl e n g t hi s i np r o p o r t i o nw i t ht h el o a d i n gt i m ea n dt h el o a d i n gv o l t a g e o n c et h ev a c u u mi ns wr e s e r v o i rw a sr e l e a s e dt oa c t i v a t ee l e c t r o p h o r e t i c s e p a r a t i o n 。f l o w sf r o msa n dbt os ww e r ei m m e di a t e l yt e r m i n a t o db yt h e b a c kf l o wi n d u c e db yt h ed i f f e r e n c eo ft h el i q u i dl e v e l si nt h er e s e r v o i r st o p r e v e n ts a m p l el e a k a g ed u r i n gt h es e p a r a t i o ns t a g e i ti se a s yt of r e e l y c h o o s et h es a m p l ep l u gv o l u m ei nt h i sm e t h o db ys i m p l yc h a n g i n gt h el o a d i n g t i m e t h es y s t e mh a sb e e np r o v e dt op o s s e s sa ne x c i t i n gp o t e n t i a lf o r i m p r o v i n gs e n s i t i v i t yo fc h i p b a s e dc e k e y w o r d s ：c h i p b a s e dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ；i n t r a c e l l u l a rl a b e l i n g ；s p e c i f i c l a b e l i n g ；s u p e r o x i d e ；v a r i a b l e - v o l u m es a m p l el o a d i n g ；s e n s i t i v i t y 1 v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝婆盘堂或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 替 ，乞 签字日期：讼扩年易月少日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝婆盘鲎有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权逝姿盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：芬乏之 导师签名： 屁研 签字日期：协；年6 月乙日签字日期：硝年 月z 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 1 1 引言 第一章文献综述 自从2 0 世纪9 0 年代初m a n z 和w i d m e r 首次提出了微全分析系统 ( m i n i a t u r i z e dt o t a la n a l y s i ss y s t e m ， a s ) 概念，在短短的十余年中，i t t a s 已成 为分析化学中的一个独立领域，并己成为当前世界上最前沿的科技领域之一 1 ，2 。芯片毛细管电泳技术是微全分析系统的一个重要分支，因其比常规毛细 管电泳散热性能好，可以施加更高的场强、分离速度快、效率高，并可以利用其 网络结构将多种分析功能集成在一起，已应用于单细胞分析 3 - 1 2 、药物筛选及 组合化学等领域 1 3 ，1 4 。 芯片毛细管电泳具有分析速度快、样品和试剂消耗少、易于集成化等优点， 其价值已被不同领域的科学家所认知和肯定。但由于芯片毛细管电泳的进样体积 小，在柱检测的光程短，通用型紫外检测器的灵敏度难以满足芯片毛细管电泳分 离分析实际样品痕量组分的要求。为了降低浓度检测限，激光诱导荧光检测技术 是芯片毛细管电泳中应用最广泛的检测方法之一，但是，大部分被测物无天然荧 光，需要进行衍生标记才能进行检测。衍生标记过程中，标记方法和标记试剂的 选择决定了荧光检测的灵敏度。在分析含量低且成分复杂的单细胞内组分时，标 记试剂的选择性更是对检测结果起决定性作用。 定量地将微量样品( 皮升或纳升级) 注入到分离通道是成功进行芯片毛细 管电泳分离的前提条件。根据通道的几何构型，定量地将样品注入分离通道，是 应用最为普遍的样品注入方法。目前，如何在芯片毛细管电泳中实现连续可调地 进样是当前的研究热点 我们课题组已综述了用芯片毛细管电泳高灵敏度，高选择性地测定细胞内的 物质 1 5 】。本章主要综述细胞内组分的标记方法和芯片毛细管电泳中的进样技 术。 1 2 细胞内的标记方法 细胞在新陈代谢、信号传导及遗传等生命活动中起着重要的角色。分析单细 浙江大掌博士掌位论文 胞内组分的含量以及在外界刺激下，细胞内组分的变化情况有助于更好地了解细 胞的基本功能及细胞内与细胞间的信号传导情况【1 6 】。 然而，单细胞分析存在单细胞内的组分含量低且成分复杂两大难点。细胞的 直径大概在几十微米，细胞的体积大概只有1p l ( 1 0 _ 2 l ) 【1 7 ，1 8 】。细胞内的 组分包括一些大分子如d n a r n a 、蛋白质、无机离子和小的有机物分子。它们 的含量一般在1 0 - 1 5 1 0 2 1m o l 。据统计，每个细胞含有至少1 0 00 0 0 种不同种类， 丰度各不相同的蛋白质【1 8 】。细胞内组分复杂，含量低的特点要求用于分析单 细胞的方法灵敏度高、选择性高、分辨率高及在样品的处理和分析过程中尽可能 小的稀释效应。 由于激光诱导荧光检测技术的高灵敏度和易匹配等特点，它是芯片电泳技术 使用最多的检测方法之一。然而，单细胞内绝大部分物质其天然态是没有荧光的， 所以，在单细胞分析过程中，待测组分的荧光标记是必不可少的。目前用于单细 胞检测的衍生试剂和分子探针主要有荧光生成试剂和荧光标记试剂两大类，前者 本身无荧光，而标记反应产物有较强荧光，如邻苯二甲醛( o p a ) ，萘2 ，3 二甲 醛( n d a ) 及荧光胺等；后者本身带有较强荧光团，标记产物的荧光是由标记 试剂的荧光团产生，如丹磺酰氯、荧光素异硫氰酸酯( f i t c ) 和单溴二胺 ( m o n o b r o m o b i m a n e ，m b b r ) 等就是荧光标记试剂。 衍生试剂和被分析物的特异性反应，不仅可以提高检测灵敏度还可以提高选 择性。尽管已经开发出大量的衍生试剂用来标记细胞内的组分，比如蛋白质，氨 基酸及多肽 2 0 ，2 1 1 ，需要指出的是，在衍生过程中，细胞膜会阻碍衍生试剂进入 细胞内。为了避免在标记细胞内的被分析物过程中引起明显的稀释效应，已经进 行了大量的研究工作。下面我们对细胞内的标记方法分类为柱前衍生，柱上衍生， 柱后衍生和量子点标记进行阐述。 1 2 1 柱前衍生 柱前衍生用于单细胞分析最先是由j o r e n s o n 等人在1 9 8 9 年提出来的【2 2 】。 他们【2 2 ，2 3 将一个直径1 2 51 t m ，体积1 0n l 的蜗牛神经细胞放入2 0 0n l 的微型 管状瓶中( 图1 1 ) 溶膜后，取出2 0 - - 3 0 的细胞溶膜液，用2 ，3 一萘二甲醛 2 浙江大掌博士掌位论文 ( n a p h t h a l e n e 一2 ，3 一d i c a r b o x a l d e h y d e ，n d a ) 衍生后，测定了细胞内的氨基酸。 衍生后的最终体积为2 5l l l 。据文献【2 4 】报道，通过这种方式衍生后，细胞内的 氨基酸大约被稀释了1 0 0 倍。如果这种先将细胞溶膜再衍生的方法用于分析直径 为2 0l x m ，体积为4 2p l 的哺乳动物细胞，则稀释效应将会大于1 0 4 倍。大大降 低了检测灵敏度。并且，纳升级别的微化学操作是一项非常繁琐的工作。 o a m p l i n g l a b e l i n gi nm i c r o v i a l 图1 1 单细胞溶膜后衍生示意图 众所周知，微注射 2 5 2 8 能将化学物质引入到细胞里。但是，微注射的主要 缺点是针头很脆易碎且难定位。并且，微注射技术由于采用了较大的机械力，会 破坏细胞膜，甚至弄破细胞【2 9 】。 为了避免柱前衍生过程中引起稀释效应，除微注射外，现已有如下几种较好 的方法对细胞内的被分析物进行衍生，归类为：( 1 ) 透膜的衍生试剂直接透过细 胞膜，细胞作为微反应器进行衍生；( 2 ) 电穿孔技术将不透膜的衍生试剂转入细 胞内进行衍生；( 3 ) 借助于脂质体或聚乙二醇( p e g ) 将不透膜的衍生试剂转入 到细胞内进行衍生。 3 浙江大掌博士掌位论文 1 2 1 1 细胞作为微反应器进行的衍生反应 1 9 9 2 年，h o g a n 和y e u n g 3 0 首次提出了将细胞作为微反应器对活细胞内的 被测物进行衍生的方法。他们用一种透膜的衍生试剂单溴二胺与红血球一起孵 育，标记了红血球内的硫醇和谷胱甘肽( g s h ) 。单个血红细胞进行标记后得到 的电泳图如图1 2 所示。在这个衍生过程中，红血球细胞作为一个亚p l 级的反 应器。细胞周围无极性的小分子衍生试剂可以透过亲脂性的细胞膜进入到细胞 内，与被测物进行反应。衍生试剂与被测物反应后的产物比衍生试剂( 单溴二胺) 要大得多，不会透过细胞膜扩散到细胞外。在此衍生过程中，细胞内的被测物几 乎没有被稀释。如果衍生反应速度比较慢，可增加衍生时间，达到1 0 0 的衍生 效果。衍生完成后，细胞外多余的衍生试剂可以通过离心清洗掉。一些用于荧光 显微镜检测技术和流式细胞仪 2 0 ，3 1 】中的透膜衍生试剂也适用于此方法。这种柱 前衍生的方法有着衍生反应完全，衍生过程中不引起稀释效应等优点而被广泛应 用于单细胞分析中。表1 1 列出了透膜试剂在单细胞分析中的应用情况。 鲁 薹 薹 t i m e 似n l r 嘻 图1 2 单个人红血球经m b b r 衍生后的荧光检测电泳图。峰1 ，多余的m b b r ；峰2 ，细胞 内的硫醇；峰3 ，g s h 。 4 浙江大掌博士掌位论文 表1 1 透膜试剂在细胞作为微反应器的衍生方法中的应用。 衍生试剂激发波长被分析物 文献 氩离子激光( 3 5 0 - 3 6 0 单溴二二胺 硫醇3 0 n m ) 氩离子激光( 4 8 8n m )4 ，5 ，3 2 ，3 3 2 ，3 一萘二甲醛 谷胱甘肽( g s h ) 固体激光( 4 7 3n m ) 3 4 双氢溴乙啶( h e ) 4 8 8 n m超氧阴离子 3 5 ，3 6 3 4 双氢罗丹名1 2 3 固体激光( 4 7 3n m ) 活性氧自由基( r o s ) ( d h r 一1 2 3 ) 氩离子激光( 4 8 8n m )5 ，3 2 ，3 7 h p f 4 8 8 n m 羟基自由基 3 8 a p f f l u o 3 氩离子激光( 4 8 8n m )3 9 ，4 0 ，4l 4 9 0 n m4 2 c a 2 + f l u o - 4 氩离子激光( 4 8 8n m )4 0 ，4 3 ，4 4 ，4 5 ，4 6 氙弧灯( 4 8 0 n m )4 7 2 ，7 一双一( 2 - - 羧乙 基) 一5 一( 和- - 6 ) 一 汞灯 细胞活性 4 8 羧基荧光素乙酸甲酯 异构体( b c e c f - a m ) 6 羧基荧光素乙酰乙酸6 羧基荧光素 士卜 j n 5 一羧基荧光素乙酰乙酸 氩离子激光( 4 8 8n m ) 5 羧基荧光素 4 9 卜 吐 俄勒冈绿乙酰乙酸盐俄勒p q 绿 z i n p y r - 1 5 0 7 r i m 5 0 z n a f r 13 2 9 l l mz n 2 +5 l z n a f r 23 3 5n m5 1 p f l4 8 8 a m p r l5 4 3n m h 2 0 2 5 2 p x l7 0 4 a m 异硫氰酸荧光素标记 氩离子激光( 4 8 8n m )p 糖蛋白 5 3 的抗鼠免疫球蛋白 5 1 2 1 2 电穿孔技术 电穿孔技术是将不透膜的荧光试剂引入到细胞内的技术之一。8 0 年代初， 电穿孔技术用于将d n a 转入到哺乳动物细胞内【5 4 。这种技术的原理是，在加 电场的瞬间，不导电的细胞两端加上一个跨膜电位。在跨膜电位的作用下，细胞 膜上随机地出现一些疏水的孑l 5 5 】。细胞周围不透膜的荧光试剂就会进入到细胞 内【3 0 ，5 6 ，5 7 】。外界电压一撤销，细胞膜上的微孔会自动复合。跨膜电位的大小 和电场强度及细胞的直径成正比。 因为细胞内的一些酶反应速度极快，在瞬间就会引起一个数量级浓度的变化 【1 6 】，所以电穿孔后必须保证细胞的活性。可逆电穿孔( 即细胞膜在电穿孔过程 中形成的微孔在电穿孔后复合) 是保证细胞活性的必要条件。因此电穿孔的条件 如脉冲电压的强度，脉冲时间，脉冲次数需严格优化，这一优化过程对于批量细 胞的电穿孔非常麻烦 5 8 】。 相对于批量细胞的电穿孔装置，在微流控芯片上进行单个细胞的电穿孔有着 明显的优势。l e e 等设计了一种聚合物芯片能选择性地固定单个细胞，并对定位 的细胞进行电穿孔。芯片结构图如图1 3 上方图片所示，左右两条粗通道是细胞 的进出口通道，细通道用来固定细胞，图1 3 左下方的图片是对固定住的细胞进 行电穿孔的示意图，图1 3 右下方是被固定的细胞图片，当固定的细胞重新释放 出来时细胞形状可以恢复。这种芯片在较低的电压下就可以将单个细胞可逆的电 穿孑l 【5 8 】。l u 等设计了一种高通量电穿孔哺乳动物细胞的二甲基硅氧烷( p d m s ) 芯片【5 9 】，电穿孔结构示意图如图1 4 所示，样品池内的细胞悬浮液在注射泵作 用下流向另一个储液池。在两个储液池之间加一高压，通道细的地方分压也大， 细胞逐个经过时被逐个电穿孔。w e b e r 等人总结了细胞的形状，大小与单细胞的 电穿孔的关系。较大的半球形的细胞相对于较小的椭圆形的细胞更易被穿孔，且 穿孔后的存活率更高。细胞两端的最大跨膜电压决定于细胞的大小。单细胞电穿 孔时细胞大小对最大跨膜电压的影响要比批量细胞电穿孔中小很多【6 0 】。 近来，l e e 等人利用微电子加工技术( m e m s ) 加工了一种用于电穿孔的芯 片( 图1 5 ( a ) ) ，芯片上集成了三维的电极( 图1 5 ( b ) ) 用于电穿孔子宫颈癌 ( h e l a ) 细胞。不同大小的荧光物质包括分子量1 0k d a 的罗丹明b 葡聚糖，分子量 6 2 0k d a 的罗丹明b 异硫氰酸酯( r i t c ) 葡聚糖，分子量4 0k d a 和7 0k d a 的荧 光素异硫氰酸酯( f i t c ) 葡聚糖和一段基因译码的绿色荧光蛋白均被转入了h e l a 细弛巾【6 1 】。 圈1 3 芯片结构l 錾i ( f 方) 。 酗i - 4 高逋簟电穿孔细胞平面示意圈( a ) 与削面目；意i 芏i ( b ) 。l 1 = 2 5 m m ，l 2 = 2 0 m m w i - 2 】3 mw 2 - 3 3u m ， 。 罔l 一5 朋r l b 穿孔的芯片结构附( a ) ：芯片h3 d 杜微电极的扫描l b 镜斟 电穿孔技术还被用于测定单个细胞内的氨基酸【2 5 ，6 2 1 。不透膜的荧光试剂 f i t c 通过电穿孔技术转入活细胞内标| 己细胞内的氨基酸。标记完后的单细胞进 样到毛细管的一端，用0im o l f ln a o h 溶膜，衍生后的氨基酸在毛细管中电泳 分离，尼后用激光诱导荧光检测。九种氨基酸被定量测出。个血红细胞中的氨 基酸含量在3 8 到3 2 a m o l 之间1 2 5 1 ，一个原生质体中的氨基酸含越在26 8 x 1 0 。 m o l l 到1 8 1 8 1 0 5 m o l l 之f b j 6 2 1 。 近来，j i n 利用抗原与抗体特异性结合的原理，在细胞内进行免疫分析州 毛细管电泳激光诱导荧光检测技术测定了单个自然杀伤细胞( n a t r u a lk i l t e rc e l l ， n kc e l l ) 内的t 干扰素 6 3 。不透膜的f i t c 标记后的t 干扰素抗体( a b + ) 通过 电穿孔技术引入到n k 细胞内，通过细胞内免疫反应，y 干扰素抗原( a g ) 与 a b * 特异性结合并被标已，如图1 - 6 所示。当有一合适的脉冲电压加在细胞两端 时，细胞膜上就会形成可逆的微孔。当细胞膜上的微孔彤成时，外界溶液中的 a b * 通过微孔进八细胞里( 图1 6 b ) 。外界电压一撤销，细胞膜上的微孔自动 复合( 图1 6 c ) 。细胞内的免疫反应完成后，洗去细胞外的a b ( 图1 6 d ) 。衍 生完后的n k 细胞通过电动进样到毛细管中。进入毛细管的细胞会自动贴壁，用 超声溶膜细胞。毛细管电泳激光诱导荧光检测到了两种t 干扰素，检测下限z m o l ( 1 0 - 2 1 m 0 1 ) 。由于荧光试剂标记的抗体或抗原均有商品可供，通过细j 胞内高选 浙江大掌博士掌位论文 择性的免疫反应标记与高分离度、高灵敏度的电泳激光诱导荧光检测技术相结 合，为单细胞内特定组分的分析提供了有效的分析方法。 f s e 一 霉日 辇：肋幸 ：a g 日茎日 abcd 图1 6 电穿孔用于细胞内免疫反应示意图。( a ) 电穿孔前；( b ) 电穿孔时；( c ) 细胞内 免疫反应；( d ) 洗去细胞外多余的a b * 。 1 2 1 3 借助于脂质体和聚乙二醇( p e g ) 的衍生反应 脂质体是利用磷脂双分子层膜所形成的囊泡，它的内部含有一个水相的空穴 【6 4 ，6 5 。由于脂质体的结构和细胞膜的结构很相像，脂质体被用来往细胞内投递 药物【6 6 】，转入基因【6 7 】或荧光染料 6 8 1 。近来，在芯片电泳技术上发展了一种借 助于脂质体而进行的细胞内衍生方法 6 9 1 。卵磷脂通过超声的方法形成平均直径 为1 0 0n n l 的脂质体，脂质体内包裹着不透膜的荧光试剂f i t c 。f i t c 通过脂质 体投递到细胞内，在长达2 4 小时的孵育后，细胞的活性没有受到影响，且孵育 的过程也避免了细胞内物质的稀释效应。芯片电泳激光诱导荧光检测到一大堆 的峰，说明脂质体进入细胞后，溶膜并释放出f i t c 标记了细胞内的氨基酸，蛋 白质等物质。 c h e n 利用p e g 能增加细胞膜通透性的特点，把f i t c 和基因成功转入到植 物细胞内，标记细胞内的氨基酸。标记后的氨基酸用电泳激光诱导荧光检测测 定 7 0 1 。 1 2 2 柱上衍生 1 9 9 5 年，g i l m a i l 和e w i n g 7 1 发明了毛细管电泳柱上衍生分析单细胞的方 法。实验步骤如图1 7 所示。步骤l ，将用于分离的毛细管内充满缓冲溶液，缓 9 浙妇。气掌博士掌位论文 冲溶液中含有细胞的溶膜剂和标记被分析物的衍生试剂。然后，在倒置显微镜和 微操作系统的辅助下，利用电渗流( e o f ) 将单个完整的细胞进样到毛细管前端。 撤去电渗流后，进入的细胞就会贴在毛细管壁上。步骤2 ，在缓冲溶液中溶膜剂 的作用下，细胞静态溶膜。十二烷基硫酸钠( s d s ) 和毛地黄皂苷是常用的溶膜剂。 步骤3 ，溶膜后释放出细胞内的物质，被缓冲溶液中的衍生试剂标记。步骤4 ，5 ， 衍生反应完成后，在毛细管两端加上分离电压，使衍生后的被分析物电泳分离和 检测。 用这种方法，单个p 1 2 细胞( 直径1 5 2 5 岬) 【7 1 ，单个尸c o r t t e z l s 蜗牛神 经细胞( 直径7 5 岬) 【7 2 ，老鼠腹膜巨噬细胞( 直径1 5 2 5i n n ) 【7 3 和老鼠腹 膜肥大细胞 7 4 】内f m o l ( 1 0 彤m 0 1 ) 到a m o l ( 1 0 1 8 m 0 1 ) 水平的多巴胺，氨基酸 和内生的组氨酸可以被定量测得。近来，经过荧光染料3 ( 2 呋喃甲酰) 喹啉2 甲醛( f q ) 【7 5 柱上衍生后，利用两维毛细管电泳分离，测得了单个m c f 一7 细 胞内蛋白质和主要的氨基酸。 f l u o r e s c e n c e s a m p l i n g de t e c t i o n s t e pl o 重= 三三二苹o s t e p2 s t e p3 s t e p4 00 d e t e c t i n g s t e p5 o 三二= 蚕= 革o o ：c e l l 萎：f r e ea n a l y t e霉：l a b e l e da n a l y t e 粪l 。a b e b da n a i 啦ea i i ：a b e l e da n a l y t e 日 图1 - 7 单细胞柱上衍生法示意图 l o 柱| 衍生时，尽管毛细管管壁叫以阻止细胞溶膜后细胞内物质的纵向扩散， 但足沿毛细管方向的扩散还是无法避免的。因此，柱上衍生时衍生反应的速度 影响细胞内物质的稀释倍数。据计算，在用n d a 和氰化物柱上衍生细胞内的多 巴腋和氩摹酸时，反应l o 分钟后，直径2 0o n l ，体积是4 2p l 细胞内的物质被 稀释了约1 0 0 倍【7 1 】。很显然，衍生反应时间越长，稀释的倍数越多。如果衍生 试荆和细胞内被分析物反应速度很慢，在衍生过程山于扩散而导致被分析物的过 度稀释，电泳分析的灵敏度和分辨率会大大降低【7 1 】。 o c v i r k 等人报道了在微流控玻璃芯片上衍生和连续测定单个h l - 6 0 细胞内 b 一牛乳糖的方7 2 7 6 1 。如图1 8 所示，荧光底物荧光素乳吡喃精昔( f d g ) 和溶 膜剂放于a c 储液池中，细胞放于d 储液池中在e 处用泵抽。一艘单细胞的 液流自d 处向y 形的交叉点流动，与溶膜剂在交叉点相遇被溶膜后，与f d g 生 成有荧光的酶解产物单乳吡喃糖苷( f m g ) ，被位于交叉点液流下方的荧光检测器 测定。 l y s i n ga g e n t r 1 曹 枣 c e 业s 幽 i l s 一 f i l 酗i - 8 一占片枉上j 苹膜，衍生铡定h l * 6 0 细胞示意陶 我们课题组也报道了用微流控芯片电泳同时测定单个血红细胞内活性氧 ( r o s ) 和谷胱甘肽( g s h ) 的方法。用透膜的d h r 1 2 3 细胞内衍生法标记r o s ， 用n d a 通过柱上衍生法标记g s h 【3 2 。芯片结构如图l - 9 a 所示，柱上衍生和测 浙江大掌博士掌位论文 定单个细胞内的g s h 步骤如图1 - 9 b ，c ，d 所示。s 池中的细胞悬浮液在液位差 的作用下流向s w ，a s 池，当在十字交叉口看到细胞时，施加如图1 9 c 所示的 一组电压，细胞在电渗流的作用下向b w 池运动，0 1 s 后，断开所加的电压，细 胞停止运动，沉降在靠近十字交叉口附件的管壁上( 图1 - 9 c ) ，1 5 秒后，在四个 储液槽上施加与刚才进样相同的电压，停留的细胞立刻在电场和缓冲液的双重作 用下原位溶膜( 图卜9 d ) ，释放出来的g s h 在线与缓冲液中的n d a 衍生标记，标 记反应2 2s 内完成，生成有荧光的产物并被检测。g s h 的平均分离效率是2 4 x 1 0 6 p l a t e s m 。g s h 在柱上衍生模式和柱外衍生模式中的迁移时间分别为1 1 6 s 和 11 0 s 7 7 1 。这种方法简化了细胞的处理过程，减少了样品和试剂的消耗，但仅适 用于反应速度快的衍生反应。 a b u 讹rw a s t e ( b w ) a u x i l i a r ys a m p l e ( a s ) b s w cs w + 7 0 0 v ds w 7 0 0 v a s + 7 0 0 、， - b 喇艮rf l o wd k e d h m。 j 苣羔g 刁l 陌洲。 8 唪一b 坩 r v c c e l lt l ( , w4 1 1 e c l l o n 图1 - 9 ( a ) 微流控芯片示意图( 单位：m m ) ：( b ) 液压下的单细胞进样；( c ) 施加电场后， 细胞进入分离通道并沉降在通道底贴壁； ( d ) 贴壁细胞被缓冲液溶膜后开始电泳分离。微 流控芯片中细胞( 白色箭头) 和缓冲液( 黑色箭头) 的流向。 1 2 浙江大掌博士掌位论文 c h e n g 课题组用芯片电泳柱上衍生法测定了单个p c i 2 细胞内的神经传递质 如多巴胺( d a ) 、降肾上腺素( n e ) 和丙胺酸( a l a ) 、牛磺酸( t a u ) 、 氨基乙酸 ( g l ”、谷氨酸( g l u ) 和天冬氨酸( a s p ) 等氨基酸【7 8 】。他们将单细胞通过电动进样 到芯片上双t 通道的交叉处，贴壁后，再用含0 6m ms d s 的硼酸盐缓冲溶液 ( 2 0 m m ，p h 9 o ) 溶膜。溶膜后，细胞内释放出来的神经递质和氨基酸被邻苯 二甲醛( o p a ) 静态标记2m i n 。然后，在分离通道两端加上分离电压进行电泳 分离。检测时用h g 灯作为荧光激发光源，光子计数器计数。 表1 2 y t j 出了其他一些柱上衍生法用于分析单细胞的例子。 表1 2 柱上衍生法在单细胞分析中的应用 文 被分析物衍生试剂激发波长 献 谷氨酸 谷氨酸脱氢酶，谷丙转氨酶氩离子激光( 3 0 5n l i l ) 7 9 氩离子激光( 4 8 8 8 0 蛋白质 3 一( 2 - 呋喃甲酰) 喹啉一2 一甲醛( f q ) n m ) 8 1 丫干扰素异硫氰酸荧光素标记的y 干扰素氩离子激光( 4 8 8n m ) 8 2 乳酸脱氢酶乳酸，n a d + 3 4 0n l n8 3 s y t 09汞弧灯8 4 d n a 溴化乙啶固相激光( 5 3 2 n m ) 8 5 邻苯二甲醛( o p a ) ，2 一巯基乙醇 氨基酸3 4 0n l n 8 6 ( 2 一m e ) w u 等人设计了一种用于分析单个j u r k a 细胞内的氨基酸的p d m s 芯片。这种 芯片集成化了单细胞的进样，溶膜，衍生，分离和检测等功f l 皂 6 】。为了减少柱 上衍生时带来的横向扩散效应，衍生反应在一个体积为7 0p l 的反应腔内完成。 反应腔的两端用两个通过多层软光刻制作的阀控制关闭。芯片示意图如图1 1 0 所 示。该芯片由四部分组成：细胞操控通道( 通道5 7 ) ，试剂引入通道( 通道1 和 2 ) ，两个阀间的反应腔及分离通道( 通道3 ) 。三位阀( a ) 控制细胞和试剂的 引入，两位阀( b ) 控制反应腔和分离通道的联通。通过控制施加在阀上的压力， 1 3 浙江大掌博士掌位论文 三位阀有以下三种状态：( i ) 没有压力施加在阀上的时候，通道完全联通；( i i ) 当 阀上施加一较小的压力时，阀处于半开状态。此时，反应腔与左侧的通道不通， 而与右侧的通道相通；( i i i ) 当阀上施加一较大的压力时，阀完全关闭，阻断所有 通道。 芒一腿一l 、 八 u 一， 酸八3 a 。 一一 1_ z 7i ， 一嗍 rl l；弛f i 龟6 2 0 0 j 叠i 5 。 阿 ， 4 一三h 图1 1 0 用于单细胞分析的芯片结构示意图。 图l l l 是在上述芯片上进行单细胞操控和分析的示意图。首先，三位阀完全 关闭，从通道7 引入细胞悬浮液，细胞从通道7 流入通道5 和6 ( 图1 1l a ) ；当看到 有一个细胞接近三位阀时( 通道5 和6 的连接处)