毕业设计（论文）-金属离子的探针检测.doc

北京科技大学本科生毕业设计（论文）摘要金属离子是化学、生命科学、环境科学和医学等许多科学领域研究的重要对象，对溶液中金属离子的识别和检测是分析化学的主要任务之一。荧光分子探针检测法不仅简便，而且在高灵敏度、选择性、时间分辨、实时原位检测方面均有突出优点。因此在传统的受体分子上按照荧光分子传感器设计原理连接荧光团构造的超分子荧光传感器用于识别金属离子的研究受到越来越广泛的关注。本论文主要工作是对已合成的荧光探针化合物利用紫外可见分光光度计和荧光分光光度计进行检测。本研究进行了多个不同探针对不同金属离子的检测，其中有两个比较成功。一个是对铜离子有高选择性的探针A对水中铜离子检测，在对检测液进行3D扫描后得出探针A的检测波长，即探针A检测铜离子的激发波长EX=550nm，发射波长EM=590nm。在对不同浓度的铜离子的荧光扫描中得出探针检测铜离子的标准曲线，其线性方程为y=1.761x+12.4。从标准曲线 中得出该探针A的检测限为6.345ML。该探针检测限低，具有良好的选择性，无其他金属干扰。是一种方便快捷的检测方法。另一个是对汞离子具有高选择性的探针B对水中汞离子的检测，在对检测液进行3D扫描后得出探针B的检测波长，即探针B检测汞离子的激发波长EX=570nm，发射波长 EM=594nm。在对不同浓度的汞离子的荧光扫描中得出探针B检测汞离子的标准曲线，其线性方程为y=1871.8x181.5。从标准曲线中得出探针B的检测限为0.239ML，在对其进行不同PH检测中得出检测液的适宜PH值为68 。在此PH值响应值较高，检测结果较理想。还得出该探针具有良好的选择性，我其他金属干扰。探针B的优点是水溶性好，完全水溶，使得在实际应用中可直接用水做缓冲溶剂，使检测更加方便快捷。关键词：金属离子；荧光探针；Cu2+；Hg2+Fluorescent chemosensors for selective detection of metal ions in natural waterAbstractThe analysis and detection of the transition metal ions is currently of significant importance for chemistry, as they are closed with biology, environment and clinic. The method of fluorescence is not only simple but also can realize space, real time, high sensitive and selective. So the fluorescence supramolecular sensors, which are composed of traditional receptors connecting fluorophores, to metal ions are attracting many peoples attentions.In this paper, our main work is to test the fluorescent probe A that have already synthesized by UV-vis spectrophotometer and fluorescence spectrophotometer. During the research progress, we test several different probes, in which the following two is the best. The first one is a high selective probe of copper ions in a CH3CN/H2O solution. We got the Excitation wavelength 550nm and the emission wavelength 590nm by the 3D scanning. We also tested different concentrations of copper ions with the fluorescent probe to get the standard curve y=1.761x+12.4. And the gainod the detection limit to 6.345 from the standard curve. This fluorescent probe has advantages of low detection limit, good selectivity and no other metal ions interference. The other one is a high selective probe of mercury ions. In 100 aqueous solution. We got the excitation wavelength 570nm and the emission wavelength 594nm by the 3D scanning. We also tested different concentrations of mercury ions with the fluorescent probe to get the standard curve y=1871.8x181.5. And the gainod the detection limit to 0.239 from the standard curve. This fluorescent probe has advantages of low detection limit, good selectivity and no other metal ions interference.Key words: Metal ion; Fluorescent probe; Cu2+；Hg2+- 3 -目录摘要1Abstract2插图或附表清单1引言31绪论41.1金属离子识别的意义和方法简介41.2荧光光谱51.2.1荧光的产生51.2.2荧光光谱的基本概念51.2.3荧光光谱的主要参量61.3荧光分析法71.3.1荧光分析法的发展简史71.3.2荧光分析法定量分析及其原理81.3.3荧光分析的优点101.3.4荧光定量分析的各种条件101.4荧光分析法的灵敏度和选择性111.5荧光的影响因素121.5.1分子结构与荧光的关系121.5.2环境因素对荧光的影响131.6荧光分析法的应用141.6.1金属离子检测中的应用141.6.2有机污染物检测中的应用151.6.3无机污染物检测中的应用72,73-79151.6.4有毒有害气体检测中的应用161.6.5微量元素检测中的应用171.6.6其他的检测应用171.7荧光分子探针181.7.1概述181.7.2荧光分子探针的研究现状191.8荧光分子探针用于金属离子识别的研究现状192铜离子探针对铜离子含量的测定202.1本章引论202.2实验部分212.2.1试剂212.2.2仪器222.2.3溶液的配制222.2.4测定铜离子含量的操作方法222.3实验结果与讨论282.3.1探针与铜离子反应时间对检测的影响282.3.3干扰离子对铜离子分析检测的影响282.3.4测量范围及极线性分析292.4本章小结293汞离子探针对汞离子含量的测定293.1引言293.2实验部分303.2.1试剂303.2.2仪器303.2.3溶液的配制303.2.4测定汞离子含量的操作方法303.3实验结果与讨论393.3.1不同溶剂对荧光光谱的影响393.3.2 PH的影响403.3.3干扰离子对铜离子分析检测的影响403.3.4测量范围及极线性分析403.3.5反应时间对检测的影响413.4本章小结41结论42参 考 文 献43附 录54致谢71北京科技大学本科生毕业设计（论文）插图或附表清单图1.1 20032008年间相关的SIC文章数量20图2.1铜离子探针A紫外可见光光谱扫描22图2.2铜离子探针A荧光3D扫描图23图2.3设定激发波长EX为550nm扫描发射波长从500nm到700nm的荧光强度24图2.4设定发射波长EM为590nm扫描激发波长从450nm到700nm的荧光强度24图2.5固定铜离子浓度变探针A的浓度荧光扫描散点图25图2.6加入铜离子后随着时间的增加荧光强度的变化曲线26图2.7探针A的标准曲线27图2.8探针A检测干扰曲线28图3.1汞离子探针B紫外可见光光谱扫描31图3.2汞离子探针B空白3D扫描谱图32图3.3汞离子探针B荧光3D扫描图32图3.4设定激发波长EX为570nm到700nm的荧光强度33图3.5设定发射波长EM为594nm扫描激发波长从450nm到700nm的荧光强度33图3.6不加探针和加入探针溶液颜色比较34图3.7固定汞离子浓度变探针B的浓度荧光扫描散点图35图3.8变PBS对荧光强度的影响36图3.9探针B检测汞离子荧光强度随时间变化曲线37图3.10不同浓度的汞离子荧光曲线38图3.11扫描的标准曲线38图3.12汞离子检测干扰曲线39注释说明清单HEPES 4-羟乙基哌嗪乙磺酸UV-VIS 紫外可见光谱仪PBS 磷酸盐缓冲液 引言社会的发展带来了城市化的扩大、人口的增加、人民生活水平的提高，然而随之而来的是人类活动导致的环境污染的急剧增加。人工合成各类化学药品的数目及产量以指数增长速度递增，造成了许多环境问题。面对这种现实，环境保护成为每个人义不容辞的职责，这也是国民经济持续发展的必需。鉴于此，环境化学已被列为化学中五个应优先发展的尖端领域之一。作为环境化学的一个重要分支，环境分析化学，又是环境科学和环境保护的重要基础。它是研究环境中污染物的种类、成分，以及如何对环境中化学污染物进行定性分析和定量分析的一个学科。由于其研究对象广，污染物含量低，所以要求分析手段有更高的灵敏度和更低的检测限;更高的分析速度和自动化程度; 更高的准确度和更好的精密度;更好的选择性和更少的物质干扰;更完善可信的形态分析。要达到这一目标，就要应用现代分析化学中的各项新成就，以及其他技术科学的最新成就，来共同解决环境污染分析问题。这其中之一就是研究发展适用于环境污染分析的新型仪器;以及研究新型的分析方法，特别是发展准确、可靠、灵敏、快速、选择性强、简便的环境污染分析技术和新型污染物的分析测试方法。分子荧光分析是一种重要的光谱化学分析手段，可以说其集众优点于一身，不仅检测限低，灵敏度高，选择性好，而且方法简捷快速。其中荧光分子探针检测技术在环境分析化学中占有重要的地位1。荧光分子探针检测技术已经在短时间迅速发展成为分析领域中最重要的研究领域之一，并成功地应用于新型环境污染自动检测网络系统的建立、生产过程和化学反应的自动控制、临床化学中各种无机和有机分析、药物分析、免疫分析、生命分析及生命科学等领域2。随着近场光学纳米技术的发展和亚微米极的出现，大大地缩小光化学传感器的几何尺寸，从而使活体内单个细胞的无损伤分析成为可能3。并且荧光探针无需参比，不受电场、磁场的影响、易于通过光纤实现远程实时、在线自动监测而极为引人注目4.。1绪论1.1金属离子识别的意义和方法简介自然界中广泛存在着多种碱金属、碱土金属、过渡金属和重金属元素。这些金属元素在环境、生物、医学、化学科学中都具有非常重要的功能和作用。例如：碱金属钠、钾离子是在生命体中大量存在的电解质离子；碱土金属钙、镁离子是生命体中重要的组成部分和信号转导离子；过渡金属、重金属离子的功能和作用则更加丰富，它们在不同浓度下往往会显示出差异性的正面作用或负面作用，比如锌离子和铜离子浓度低于1M时，在许多生命过程（生物催化反应酶的辅酶、生物运输过程、生物合成等）中都是不可或缺的5,6，然而，当在生物体中存在浓度过高时，这些过渡金属则会产生对一些必须酶的抑制作用、生物氧化/还原过程异常、神经毒性等有害作用7,8。一些重金属如汞、六价铬、铅、镉等，是剧毒类金属元素，它们具有较强的潜在致癌和致畸性，对生物细胞、组织的毒性非常大，可使与新陈代谢相关的酶、生物蛋白质合成等出现异常。有益金属离子在生命体系中具有重要作用，缺乏它们将影响正常的生理活动，生物体需要适量摄入；而有害金属离子对环境和健康的危害极大，往往来源于工农业生产的排放物。因此，对于各种金属离子的准确定量分析和识别，将非常有助于研究生命必须金属元素在生物体中产生作用的机理、及时发现所缺金属元素并进行补充、有效监控环境危害重金属离子在水质、土壤等环境样品中的存在等重要研究课题的开展。目前常用的金属离子分析检测方法主要分为直接法和间接法两大类9。直接法是一类直接利用金属离子自身物理、化学性质对其进行分析检测的方法，包括原子吸收/发射光谱法和离子选择性电极法；间接法是一类利用金属离子和指示剂（也可称为化学分子探针）之间的特异性化学反应或超分子作用产生的信号变化对金属离子进行分析检测的方法，包括传统的金属离子指示剂和近年来研究较热的金属离子荧光分子探针。直接法和间接法各有其优点和缺点。例如：原子吸收/发射光谱法的优点是技术成熟、分析灵敏可靠、受样品中有机杂质等的干扰很小，缺点是仪器复杂、需要高温原子化部件、分析时能耗和成本高；离子选择性电极法的优点是分析灵敏、对特定金属离子选择性好、电信号可方便的转换到用户界面，缺点是电极表面情况对分析结果影响较大、需要对电极进行保养、分析前需要繁琐的标定过程、溶液中电化学活性杂质对分析结果的影响较大；传统指示剂的优点是简单方便，缺点是灵敏度和选择性较低；金属离子荧光分子探针的优点是简单方便、对特定金属离子的选择性和灵敏度都较高、可对金属离子实现（细胞内）原位分析和成像分析，缺点是研究尚不如传统方法成熟、荧光分子探针的设计和合成没有针对每种金属离子的一般性通法。1.2荧光光谱1.2.1荧光的产生荧光是一种光致发光现象。室温下，大多数分子处于在基态的最低振动能层。处于基态的分子吸收能量(电能、热能、化学能或光能等)后被激发，跃迁到激发态，激发态不稳定，分子将很快衰变到基态。若返回到基态时伴随着光子的辐射，这种现象称为“发光”。荧光和磷光是最常见的两种光致发光。但是，荧光和磷光这两种光致发光过程的产生机制有十分明显的区别。荧光的产生有对光子的吸收和再发射这两个过程。两个过程都是瞬时的，在这两个过程中存在时间间隔，一般为8-10S左右，这一间隔的时间长短是可变化的。因为在这一段时间内处于激发态的分子发射荧光去活过程与各种无辐射去活过程是相互竞争的，当光进入物质以后，可能有两种情况:一种是进入物质后，能量几乎不被吸收;另一种是能量效率取决于分子的环境因素，而荧光发生的内在因素则取决于分子的结构，大多数荧光物质都含有兀兀*跃迁的苯环及其衍生物10,11。1.2.2荧光光谱的基本概念根据量子理论，微观体系(原子、分子等)的内部运动一般是不连续的，有一系列分立的能级。体系由一能级向其他能级的过渡称为跃迁。体系由高向低能级的跃迁伴随着能量的释放;由低能级向高能级跃迁伴随着能量的吸能量的释放和吸收可以以辐射的方式进行(放出或吸收光子)，成为辐射跃迁也可以以无辐射的方式进行，如离子相互碰撞而产生的能量就是无辐射跃迁子。全部能级间可能的辐射跃迁对应于一系列辐射频率，成为该物质的光谱。光光谱包括激发谱和发射谱两种。激发谱是荧光物质在不同波长的激发光作用测得的某一波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效发射谱则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况，就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。同辐射发射和吸收相关联的除了原和分子外，还有他们的聚集结构如晶格、半导体中的电子空穴对等等。荧光现象涉及分子的激发和发射两种过程，因而它能提供比吸收光谱更信息。荧光光谱具备以下三个特征12:激发光谱的形状和吸收光谱极为相似;发射光的形态和激发光的波长无关;发射光的形状和吸收光谱极为相似，且基本上呈镜像对称关系。1.2.3荧光光谱的主要参量1.激发谱和发射谱荧光光谱包括激发谱和发射谱两种。激发谱是荧光团在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处(通常是其荧光光谱峰位的波长)的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效率。激发光谱的形状与吸收光谱的形状极为相似，经校正后的真实激发光谱与吸收光谱不仅形状相同，而且波长位置也一样。这是因为物质分子吸收能量的过程就是激发过程。发射光谱则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况，也就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。荧光发射光谱显示了若干普遍的特性13。(1)斯托克斯位移。在溶液荧光光谱中，所观察到的荧光发射波长总是大于激发波长，因为首次发现这种波长位移现象的人是Stokes，故称Stokes位移。这是由于受激分子通过振动驰豫而失去振动能，也由于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量的损失。因此在激发和发射之间产生了能量损失。(2)荧光发射光谱的形状与激发波长、发射波长无关。这是因为分子吸收了不同能量的光子可以有基态激发到几个不同的电子激发态，而具有几个吸收带。由于较高激发态通过内转换及振动驰豫回到第一电子激发态的几率是很高的，远大于由高能激发态直接发射光子的速度，故在荧光发射时，不论用哪一个波长的光辐射激发，电子都从第一电子激发态的最低振动能层返回到基态的各个振动能层，所以荧光发射光谱与激发波长无关。(3)镜像规则。通常荧光发射光和他的吸收光谱呈镜像对称关系。在发射谱中最大荧光强度的位置常记为max，它是荧光光谱的一个重要参数，且对环境的极性和荧光团的运动均敏感。2.荧光寿命当某种物质被一束激光激发后，该物质的分子吸收能量后从基态跃迁到某一激发态上，再以辐射跃迁的形式发出荧光回到基态.当激发停止后，分子的荧光强度降到激发时最大强度的l/e所需的时间称为荧光寿命，通常用丫表示。通过测量寿命可以得到有关分子结构和动力学等方面的许多信息14,15。3.荧光量子产率荧光量子产率(fluorescent quantum yield)又称荧光量子效率，通常用F表示。是指激发态分子中通过发射荧光而回到基态的分子占全部激发态分子的分数，荧光量子产率(F)即荧光物质吸光后所发射的荧光的光子数与所吸收的激发光的光子数之比值。它的数值在通常情况下总是小于1。F的数值越大则化合物的荧光越强，而无荧光的物质的荧光量子产率却等于或非常接近于零16,17。对于荧光团周围的环境以及各种碎灭过程很敏感，F的改变必然会引起荧光强度的改变。因此，若要研究F的相对值，我们只需测荧光强度就可以。4.荧光强度荧光强度F取决于激发态的初始分布IA与F的乘积。这里的F指的是向各个方向上发射的荧光强度的总和，实际上，光谱仪收集的只是其中的一小部分，因此仪器测到的荧光强度为F=IAFZ，这里Z是仪器因子18,19。很显然荧光强度与样品在波长A处的消光系数有关，而消光系数与激发波长是密切相关的，消光系数随波长的变化称为即吸收谱，因此荧光强度也随激发波长的变化而变化。实际上仪器因子Z与波长是有关的，这就使得激发谱与吸收谱并不完全相似。1.3荧光分析法1.3.1荧光分析法的发展简史具有荧光性质的物质分子中都具有一系列紧密相隔的电子能级，当物质受到紫外光或可见光照射时，由于这些光子的能量较高，可引起物质分子中的电子发生能级间的跃迁而变成电子激发态分子。电子激发态分子不稳定，可能通过辐射跃迁等分子内去活化过程丧失多余的能量返回基态，在此过程中，发生光子的发射，伴随着荧光产生。荧光是某种物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，具有不同的颜色和不同强度。根据荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的方法，称为荧光分析法20,21。第一次记录荧光现象的是16世经西班牙的内科医生的植物学家N.Monardes，1575年他提到在含有一种称为“Lignum NePhriticum”的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝色。17世纪和18世纪中还发现了其它一些发荧光的材料和溶液，然而在解释荧光现象方面却几乎没有什么进展。直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍长些，判明这咱现象是是物质在吸收光后重新发射不同波长的光，从而导入了荧光是光发射的概念。历史上首次利用荧光做分析的是1867年Goppelsroder应用铝一桑色素配合物的荧光进行铝的测定。自此，荧光分析越来越受到人们的关注。20世纪以来，随着激光、微处理机和电子学的新成就等一些新的科学技术的引入，大大推动了荧光分析法理论方面的进展，促进了诸如同步荧光测定、导数荧光测定、时间分辨荧光测定、荧光偏振测定、荧光免疫测定、低温荧光测定、固体表面荧光测定、荧光反应速率法、三维荧光光谱技术和荧光光纤化学传感器等荧光分析方面的某些新方法、新技术的发展，并且相应地加速了各式各样新型的荧光分析仪器的问世，方法的应用范围大大扩展，遍及于工业、农业、医药卫生、环境保护、公安情报和科学研究等各个领域中。如今，荧光分析法己经成为一种十分重要而且有效的光谱化学分析手段，并不断地有新方法、新技术、新应用和研究进展的专著出版22-28。1.3.2荧光分析法定量分析及其原理荧光分析法的定量测定方法较多，可分为直接测定法和间接测定法两类。1.直接测定法:利用荧光分析法对被分析物质进行浓度测定，最简单的便是直接测定法。某些物质只要本身能发荧光，只须将含这类物质的样品作适当的前处理或分离除去干扰物质，即可通过测量它的荧光强度来测定其浓度29,30。具体方法有两种。(1)直接比较法:配制标准溶液的荧光强度Fx，己知标准溶液的浓度CS，便可求得样品中待测荧光物质的含量。如果空白溶液的荧光强度调不到零，则必须从Fs和Fx值中扣除空白溶液的荧光强度FO，然后进行计算。(2)标准曲线法:将已知含量的标准品经过和样品同样处理后，配成一系列标准溶液，测定其荧光强度，以荧光强度对荧光物质含量绘制标准曲线。再测定样品溶液的荧光强度，由标准曲线便可求出样品中待测荧光物质的含量。为了使各次所绘制的标准曲线能重合一致，每次应以同一标准溶液对仪器进行校正。如果该溶液在紫外光照射下不够稳定，则必须改用另一种稳定而荧光峰相近的标准溶液来进行校正。例如，测定维生素B1时，可用硫酸奎宁溶液作为基准;测定维生素B2时，可用荧光素钠溶液作为基准来校正仪器31,32。2.间接测定法:有许多物质，它们本身不能发荧光，或者荧光量子产率很低，仅能显现非常微弱的荧光，无法直接测定，这时可采用间接测定方法33,34。间接测定方法有以下几种:(l)化学转化法:通过化学反应将非荧光物质变为适合于测定的荧光物质。例如金属与鳌合剂反应生成具有荧光的螯合物35,36。有机化合物可通过光化学反应、降解、氧化还原、偶联、缩合或酶促反应，使它们转化为荧光物质。(2)荧光碎灭法:这种方法是利用本身不发荧光的被分析物质能使某种荧光化合物的荧光碎灭的性质，通过测量荧光化合物荧光强度的下降，间接地测定该物质的浓度37,38。(3)敏化发光法:对于很低浓度的分析物质，如果采用一般的荧光测定方法，其荧光信号太弱而无法检测，可使用一种物质(敏化剂)以吸收激发光，然后将激发光能传递给发荧光的分析物质，从而提高被分析物质测定的灵敏度。在实验室，一般采用工作曲线法进行校正。既用处理过的已知量的物质，和式样溶液配成标准溶液，测定其荧光强度，再以标准溶液浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标绘制工作曲线。然后由所测得的试样溶液的荧光强度对照工作曲线以求出试样溶液中分析物质的浓度。有时候可以通过加入某种化合物于试样溶液中，而这种化合物可特效地碎灭分析物质的荧光，从而获得一种很接近于真实空白的空白溶液39,40。1.3.3荧光分析的优点荧光分析法凭借其高灵敏度，得以迅速发展。众所周知在微量物质的各种分析方法中，比色法和分光光度法应用最为广泛。而荧光分析法的灵敏度一般要比这两种方法高23个数量级，它的灵敏度常可达亿分之几。这是因为在荧光分析中，是由所测得的荧光强度来测定荧光物质的含量，而荧光强度的测量值不仅和被测溶液中荧光物质的本性及其浓度有关，而且与激发光的波长和强度以及荧光分析检测器的灵敏度有关。因此加大激发光的强度，可以增大荧光强度，从而提高分析的灵敏度。荧光分析还有一个优点，就是高选择性。在对金属离子的测定中，荧光分析得到了广泛的应用，主要源于这种分析方法对金属离子有很高的选择性。与此同时，荧光分析法还具有动态线性范围宽，方法简便，重现性好，取样量少，仪器设备不复杂等优点。然而，不能对本身不发荧光的物质进行直接检测，这在某种程度上妨碍了荧光分析应用范围的扩展。因此，还要更深入的研究化合物结构的关系与荧光的产生，才能合成更多的灵敏度高选择性好的新荧光试剂，使荧光分析的能够更好的能到应用41。1.3.4荧光定量分析的各种条件在荧光定量分析中，为了确定荧光分析的最佳工作条件，应考察以下的因素的影响及其消除方法同时还必须准确测定待测组分的激发和发射光谱42。试剂是荧光分析的必备物品。荧光分析所用的试剂要求纯度非常高，因为试剂中极少量的杂质有时也会与探针反应，而生成其他物质;长期放置的试剂可能会分解;溶解在试剂中的氧对荧光有碎灭作用，所有的这些，都可能会对探针荧光光谱跟荧光强度产生影响。因此，实验中一定要确保试剂的纯度，各种试剂都需要事先提纯，实验用水应为去离子水或二次蒸馏水。荧光物质的荧光光谱和荧光强度在不同的溶剂中会有很大的区别。这种影响分为一般溶剂效应和特殊溶剂效应。因此，在实验中，一定要选择合适的溶剂，并且该溶剂要有足够的纯度。同时还要必须考虑到的是温度的影响。通常，随着温度的降低，荧光物质溶液的荧光量子产率和荧光强度增大，事实上温度对荧光强度的影响是通过分子的内部能量转化作用。因此实验中，一般将温度控制在2025范围内。但反应速度较慢的情况下，可能要加热才能使反应完全。溶液的pH值改变将对荧光强度产生很大的影响。大多数含有酸性或碱性基团的芳族化合物的荧光光谱，对于溶剂的pH氢键能力是非常敏感的。溶液的pH改变将会影响到基态分子或激发态分子的酸碱性质。对于金属离子与有机试剂形成的荧光络合物，溶液的pH值改变还会影响到络合物组成的改变。不管哪种改变，最终都会导致到荧光光谱与荧光强度的改变。以上是实验中经常要考虑到的条件，但荧光物质本身也可能对其荧光强度造成影响。不稳定的荧光物质，会因其自身的光分解或聚合，使荧光强度减弱。因此，这类物质的检测要尽快。由于荧光物质的稳定性及其化学结构有关，在定量测定之前，必须认真考察荧光物质的稳定性。还有一点在特殊的情况下也可能发生，那就是共存物质的存在。它的存在，可能会产生荧光碎灭，背景荧光，与荧光物质发生反应，吸收激发光或荧光使荧光强度减弱等。无论遇到哪种影响，都应当采取适当的方法，消除干扰。1.4荧光分析法的灵敏度和选择性荧光分析法在近年来发展十分迅速，其原因之一是荧光分析法具有很高的灵敏度。在微量物质的各种分析方法中，应用最为广泛的至今仍首推比色法和分光光度法。在吸光光度法中，是由吸光度的数量来测定试样溶液中吸光物质的含量，而吸光度的数值则决定于溶液的浓度、光程的长度和该吸光物质的摩尔吸光系数，几乎与入射光的强度无关。在荧光分析中，是由所测得的荧光强度来测定试样溶液中荧光物质的含量，而荧光强度的测量值不仅和被测溶液中荧光物质的本性及其浓度有关，而且与激发光的波长和强度以及荧光分析检测器的灵敏度有关。加大激发光的强度，可以增大荧光强度，从而提高分析的灵敏度。随着现代电子技术的发展，对于微弱光信号栓测的灵敏度已大大提高，因此荧光分析的灵敏度一般都高于吸光光度法。荧光分析的灵敏常可达亿分之几，目前，在与毛细管电泳分离技术结合、采用激光诱导荧光检测法时，己能接近或达到单分子检测的水平43。荧光分析的另一个优点是选择性高。这主要是指有机化合物的分析而言。吸光物质由于内在本质的差别，不一定都会发荧光，况且，发荧光的物质彼此之间在激发波长和发射波长方面可能有所差异，因而通过选择适当的激发波长和发射光测定波长，便可能达到选择性测定的目的。此外，由于荧光的特性参数较多，除量子产率、激发与发射波长之外，还有荧光寿命、荧光偏振等。因此，还可以通过采用同步扫描、导数光谱、三维光谱、时间分辨和相分辨等一些荧光测定的新技术，以进一步提高测定的选择性。至于金属离子的荧光分析法，其选择性并不高，这是由于许多金属离子常于同一有机试剂组成结构相近的配合物，而这些配合物的荧光发射波长又极为靠近的缘故44。除灵敏度高和选择性好之外，动态线性范围宽、方法简便、重现性好、取样量少、仪器设备不复杂等等，也是荧光分析法的优点。荧光分析法也存在不足之处。因为有很多物质本身不发荧光，只能间接进行的荧光测定，从而妨碍了荧光分析应用范围的扩展。因此，对于荧光的产生与化合物结构的关系还需要进行更深入的研究，以便合成为数更多的灵敏度高、选择性好的新荧光试剂，使荧光分析的应用范围进一步扩大。1.5荧光的影响因素1.5.1分子结构与荧光的关系经大量实验研究证明，有机试剂分子的荧光特性如荧光强度，紫外吸收光谱，荧光发射激发光谱等首先取决于它自身的能量状态，即取决于它自身的分子结构，而外界因素，如温度，浓度，压力，介质，酸碱度等对荧光特性的影响是次要的。经过大量实验表明，荧光性能与其共扼体系的大小，分子母体上取代基的种类及取代基所在位置，共扼大兀键的共平面性及刚性程度和分子的几何结构等因素有关，下面分别给予讨论。1.分子共扼体系大小对荧光的影响在有机荧光试剂中，有机分子中具有发射荧光的基团称为荧光团。荧光团必须含有共扼大键，当共轭键达到一定程度才会发射出荧光，如苯、葱、蔡、菲、对苯二醒等基团。芳香类碳氢化合物与直链的烯烃化合物相比，激发能向振动能的转换更难，因而荧光强度更大。而对于具有强荧光的有机化合物和荧光试剂，仅有大的共扼体系还是不够的，分子的共辘体系必须具备共平面性并且还要有一定程度的刚性。例如蔡和维生素A都有五个共轭键，前者为平面结构，后者是非刚性结构，而蔡的荧光强度为维生素A的五倍。2.取代基对荧光的影响45-48。取代基效应是有机结构理论的重要组成部分，取代基的性质对荧光体的荧光特性和强度均有强烈的影响。芳烃和杂环化合物的荧光光谱和荧光产率常随取代基而变，取代基对荧光体的荧光强度、激发光谱、发射光谱和荧光效率的影响规律和机理，是人们甚为关注的领域，但到目前为止，我们对激发态分子的性质依旧了解不多，其影响规律大多数是通过实验总结出来的。1.5.2环境因素对荧光的影响溶液中的环境因素对分子荧光可能产生强烈的影响，了解和利用这一重要因素，可以提高荧光分析的灵敏度和选择性。以下讨论一些比较重要的环境因素的影响。1.溶剂对荧光的影响一般溶剂效应指的是溶剂的折身率的介电常数的影响。这种影响十分普遍。同一种荧光体在不同的溶剂中，其荧光光谱的位置和强度都可能会有显著的差别一般情况下，折射率加大，将使荧光光谱的Stokes位移减少，而介电常数加大，将使stokes位移加大，且荧光效应提高。这些过程包括振动松弛、激发态荧光体偶极矩的改变所引起的周围溶剂分子中电子的重排、溶剂分子围绕激发态偶极的重新定向和荧光体与溶剂分子间的特殊作用等。光的吸收过程极其迅速，约10-5s，这一瞬间，核间来不及发生有效的移动，但对于电子的重排却是足够的。许多荧光体，尤其是那些在芳环上含有极性取代基的荧光体，它们的荧光光谱易受溶剂的影响。溶剂的影响可以分为一般的溶剂效应和特殊的溶剂效应，前者指溶剂的折射率和介电常数的影响，后者指的是荧光体和溶剂分子间的特殊化学作用，如氢键的生成和配合作用。一般的溶剂效应是普遍存在的，而特殊的溶剂效应则决定于溶剂和荧光体的化学结构。特殊的溶剂效应所引起荧光光谱的移动值，往往大于一般的溶剂效应所引起的49-51。2.pH值对荧光的影晌假如荧光物质是一种弱酸或弱碱，溶液的pH值改变将对荧光强度产生很大的影响。大多数含有酸性或碱性基团的芳族化合物的荧光光谱，对于溶剂的PH氢键能力是非常敏感的。当分子由基态被激发到较高的电子激发态时，其偶极距也将发生变化。由于激发态与基态两者的电荷分布情况不同，因而它们的化学性质也会有所差别，溶液的pH改变将会影响到基态分子或激发态分子的酸碱性质。具有酸性或碱性发光团物质，由于其基团和酸性或碱性溶液相互作用，亦可能改变由发光过程中竞争的非辐射跃迁过程的性质和速率，从而影响物质的荧光强度和光谱。3.荧光物质的稳定性对荧光的影响在定量测定之前，须认真考察荧光物质的稳定性。在激发光的直接照射下，有些荧光物质不稳定，当连续地用激发光照射时，因荧光物质的光分解或聚合，会使荧光强度减弱。对于这些荧光强度不太稳定的成分应尽快测定，不要经常开启光闸，使光分解现象尽量减少。生成荧光物质的反应速度和荧光物质的稳定性及其化学结构有关，不同结构之间的差别较大。在定量测定之前，必须认真考察荧光物质的稳定性。4.共存物质对荧光的影响在定量分析中，共存物质的干扰主要有以下几个方面:共存物的荧光碎灭作用，共存物质产生背景荧光，共存物质与荧光物质发生反应、共存物质吸收激发光或荧光使荧光强度减弱等。遇到这些情况必须采取相应的措施，消除其干扰。共存物质的存在，会影响荧光分析的定量测定，实际工作中应认真分析其影响原因，不可轻易放过。有时往往因此发现新类型的荧光反应。1.6荧光分析法的应用荧光分析法的高灵敏度使其广泛应用于有机化合物及无机化合物的定量分析，现就其应用作简要介绍:1.6.1金属离子检测中的应用自从水俉病和骨痛病出现后，并且查明是因为汞污染和福污染而导致的死亡公害病以后，重金属的环境污染问题受到人们极大的关注和重视。比较常见的重金属污染物有Hg、pb、Cd、Cu、Co、Ni、Sn等。目前污染最严重的有Hg、Pb、Cd、Cu等有毒元素。随着污染物在环境中的增加，痕量、超痕量水平重金属离子的分析测定技术、方法愈来愈受到科研工作者的关注。目前重金属检测常用的分析方法有原子吸收光谱法52、原子发射光谱法53、紫外分光光度法51、x射线荧光光谱分析55和电化学分析法56等。例如对操作人员熟练程度的要求、样品操作复杂性、其他共存的复合物干涉等限制它的更宽的应用。所以，寻找一种低成本、操作简单和灵敏度高的方法是一个非常有意义的。近年来，荧光分析法得到了迅速的发展。重金属的荧光分析主要依赖于重金属离子与荧光试剂所形成的配合物，它们在紫外一可见光照下发出各种不同波长的荧光，由荧光增强或减弱可以测定重金属离子浓度。自从1868年发现桑色素与A13+的反应产物会产生荧光，并用来检测A13+以来，100多年来用于荧光分析的试剂日益增多。常见的荧光试剂还有卟啉类、荧光素、西夫碱类、腙类、硫脲类等几十类57-63。1.6.2有机污染物检测中的应用有机化合物中脂肪族化合物的分子结构较简单，能发生荧光的为数不多。芳香族及具有芳香结构的化合物，因有二共辘体系容不得易吸收光能，其中结构庞大而复杂的化合物，在紫外光照射下大多能发生荧光。有时为了提高测定方法的灵敏度和选择性，常使弱荧光性物质与某些荧光试剂作用，以得到强荧光性产物。因此，荧光分析在有机物方面的测定为数很多。能用荧光法测定的有机物、生化物质及药物等有200多种，其中包括多环胺类、萘酚类、嘌啉类、吲哚类、多环芳烃类、具有芳环或芳杂环结构的氨基酸类及蛋白质等;药物中的生物碱类如麦角碱、蛇根碱、麻黄碱、吗啡、喹啉类及异喹啉类生物碱等;抗生素如青霉素、四环素等;维生素如维生素A、Bl、B2、B6、B12、E、抗坏酸、叶酸及烟酰胺等。还有中草药中的许多有效成分，不少是属于芳香性结构的大分子杂环类都能产生荧光，可用荧光法作初步鉴别及含量测定64-71。1.6.3无机污染物检测中的应用72,73-79无机离子中除了铀盐等少数例外，一般不显示荧光，所以一般不能直接对无机离子的荧光进行分析，无机化合物的荧光分析主要依赖于待测元素与有机试剂所组成的配合物，它们在紫外光或荧光照射下发出各种不同波长的荧光，由荧光强度可以测定该元素的含量。这种方法称为直接荧光测定法。自从1868年出现桑色素与A13+离子以来，用于荧光分析的试剂日益增多，其中较常采用有机试剂进行荧光法测定的元素为铰、铝、硼、嫁、镁、锌、福及某些稀土元素等。某些元素虽不与有机试剂组成会发生荧光的配合物，但可用荧光碎灭法进行测定。这些元素的离子从发生荧光的其它多属离子一有机试剂配合物中夺取该有机试剂以组成难溶化合物，从而导致原溶液荧光强度的降低，由荧光强度降低的程度来测定该元素的含量。较常采用荧光碎灭法测定的元素有氟、硫、铁、镍、铜、钼等。1.6.4有毒有害气体检测中的应用SO2是大气中的污染控制的重要指标，是衡量大气是否遭到污染的重要标志。当人体吸入SO2时，可使呼吸系统功能受损，进入血液的SO2会对肝脏有一定损害，同时SO2具有促癌作用。因此，其测定空气中的SO2含量具有重要意义。通常采用改进的Vest一Gaeke方法，利用荧光素为荧光试剂，在碘存在下加少许盐酸溶液间接测定SO2。加少许盐酸是因为SO2是H2SO3的酸根，而H2SO3是弱酸，为了防止SO2融于水生成H2SO3，H2SO3会干扰鉴定。该法适用于大气中二氧化硫实际样品分析。硫化氢及硫化物70不仅是环境中的主要污染物，而且对人体危害很大。因此，有必要分析和监测硫化物含量。荧光光度法可用于硫化物的检测。S2-和8-羟基喹啉-5-磺酸碱性溶液中反应，释放出的8-羟基喹啉-5-磺酸与A13+反应，产物具有强荧光性，由于荧光强度与S2-成正比，可定量测定S2-。氮氧化物主要包括一氧化氮、二氧化氮和硝酸雾，以二氧化氮为主。一氧化氮是无色、无刺激气味的不活泼气体，可被氧化成二氧化氮，二氧化氮是棕红色有刺激性臭味的气体。氮氧化物可刺激肺部，使人较难抵抗感冒之类的呼吸系统。关于大气中氮氧化物的测定，可用三乙醇胺为吸收液，采用荧光分析方法，检测大气中痕量的氮氧化物。亚硝酸盐和硝酸盐为一氧化氮、二氧化氮80溶于水后产物，可使人体正常的血红蛋白氧化而失去运输氧的能力。亚硝酸盐和硝酸盐的检测，可用溴酸钾氧化罗丹明6G作指示反应，用荧光动力学法直接测定N02-;然后设法还原N02-为N03-，进行两者的同时测定。1.6.5微量元素检测中的应用痕量砷()的测定意义重大，因为砷()在人体累积，而引起慢性中毒。基于试剂7-(2，4-羟基-5-羧基苯)偶氮-8-羟基喹啉-5-磺酸与As()反应的荧光性能，建立起测定痕量砷(的方法。该方法操作简便快捷，无须富集，可直接测定茶叶中的痕量砷()。硒，动物体必需的营养元素和植物有益的营养元素。2，3-二氧基萘与硒()可以在酸性条件下反应，利用盐酸还原硒()和HNO3-HC1O4消化有机硒后，即可分别测出硒(VI)和有机硒。铝，一般情况下，一个人每天摄取的铝量绝不会超过一定量，否则铝元素能损害人的脑细胞。人们经常用7-【（4-甲基-2-刖酸基苯）偶氮】-8羟基喹啉-5-磺酸（简称4-MsaA-8Q5S）来检测铝。AI3+与4-MsaA-8Q5S在pH=4.4的Hac-NaAc。介质中形成稳定的荧光络合物，氟并不会影响4-MsaA-8Q5S的荧光性质，而会降低A13+- MsaA-8Q5S体系的荧光强度，基于这种荧光熄灭作用，可建立测定微量氟的荧光法分析法。钼，为人体及动植物必须的微量元素。但无论是人体还是环境中，钼的含量都应该保持在一定值。水体中钼浓度达到5毫克/升时，水体的生物自净作用会受到抑制的检测，若钼的浓度加大，将水体，乃至整个环境造成非常大的损害。关于水样中钼81的测定可以在强酸性条件下，用丙酮作增溶剂，硫脲作还原剂，Cu2+作催化剂，以。呲咯红G使Mo(VI)还原为Mo(V)并与SCN-形成离子缔合物，该缔合物的荧光强度在测定条件下与钼的浓度成正比，由于求得钼的含量。1.6.6其他的检测应用通常采用光度法对微量阴离子表面活性剂进行检测，而众多方法中首推亚甲兰法。遗憾的是，这种方法灵敏度较低，需氯仿多次萃取，而且操作繁琐。而文献报道82阴离子表面活性剂能与碱性染料罗丹明6G能在0.10mol/L盐酸溶液中生成离子缔合物，此缔合物可被苯萃取，用这种方法可对痕量表面活性剂进行测定。对于阳离子表面活性剂的测定，阳离子表面活性剂与署红Y在pH为9.5的氨水-氯化铵溶液中，生成离子缔合物，类似于阴离子表面活性剂的萃取，此缔合物也可用苯萃取，通过这种方法可以测定痕量阳离子表面活性剂83。需氧生物体内抗氧化防御体系的主要成分，过氧化氢酶(CAT)84，是一种酶类清除剂，又称为触酶，是以铁卟琳为辅基的结合酶。它可促使H2O2分解为分子氧和水，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御体系的关键酶之一。海洋环境研究领域在研究其牡砺腔液中CAT对浅海稠环芳烃污染的响应，并发现其有很好的线性关系。1.7荧光分子探针1.7.1概述荧光分子探针85-92，是指在一定体系内，当被分析物或被分析体系的物理、化学性质发生变化时，该荧光分子的荧光信号能发生相应改变，从而通过荧光信号反映出被分析物或被分析体系的浓度、性质等信息。通常评价荧光分子探针的性能主要包括灵敏度、选择性、实时性和原位检测性能四方面因素。影响灵敏度的因素有很多：首先，探针与被检测物的结合强度是灵敏度的前提；其次，识别信息的荧光信号转换效率也会影响识别灵敏度，荧光增强型探针一般会比相应的荧光猝灭型探针灵敏度高；另外，荧光团的荧光波长、量子产率、斯托克斯位移和背景