（植物病理学专业论文）核盘菌病毒ssdrv的5末端克隆及侵染性全长cdna克隆的构建.pdf

华中农业大学2 0 0 9 届硕上毕业论文 摘要 本论文以核盘菌弱毒菌株e p 1 p n 为材料，对核盘菌弱毒菌株e p 1 p n 中的核 盘菌衰退相关r n a 病毒( s s d l w ) 的基因组序列进行了修正、构建了侵染性载体 构建并对该载体进行了初步的验证。 实验室前期构建的一个双元载体p 1 3 0 1 s s d r v ，利用农杆菌介导转化技术转化 盾壳霉。获得了1 0 5 个转化子，p c r 验证了t d n a 已成功导入到盾壳霉菌株z s 1 中。对转化子的菌落形态、菌丝生长速度、孢子产量、寄生致腐菌核等生物学特性 进行了研究，结果表明导入s s d r v - c d n a 未引起盾壳霉z s 1 出现显著的异常表型。 采用r t p c r 可以检测到目的s s d r v e d n a 的m r n a ，但未能检出d s r n a 。通过 对己知的s s d r v 基因组进行分析，推测其5 末端序列可能存在未知的r n a 片段。 提取核盘菌弱毒菌株e p 一1 p n 的总r n a ，采用s m a r t ( s w i t c h i n gm e c h a n i s m a t 5 e n do f t h er n a t r a n s c r i p t ，s m a r t ) 技术克隆了s s d r v 基因组的5 t 末端还存在8 2n t 的r n a 片段。s s d r v 基因组全长为5 5 0 0 个核苷酸序列( 不包括p o l y a ) ，只有一个 开放式阅读框( 1 7 4 n t - 5 2 7 4 n t ) 。s s d r v 的5 味端含有一个帽子结构。进一步分析发 现，s s d r v 的基因组在5 端存在着变异，其3 端含有p o l y a 结构。对5 u t r 和 3 - u t r 进行二级结构预测，5 - u t r 形成发夹结构，有一个a u 富含区，3 - u t r 形 成类似t r n a 结构。 分段扩增s s d r v 的c d n a ，分别连入p u h l 8 的构巢曲霉的仃p c 启动子下游和 t r p c 终止子的上游，得到s s d r v 的全长c d n a 侵染性载体p t s v h 。利用电穿孔转 化核盘菌的原生质体，将线性化载体p t s v h 导入核盘菌e p 1 p n a 3 6 7 的染色体中， 获得了9 个转化子。对转化子的生物学特性进行了分析，发现转化子生长缓慢且致 病力减弱。通过p c r 检测证实核盘菌菌株e p 1 p n a 3 6 7 中含有s s d r v 的c d n a ； r t - p c r 检测表明s s d r v 的c d n a 的m r n a ，但是采用纤维素c f 1 1 法未检测到 s s d r v 的复制体形式d s r n a 。 关键词：真菌病毒；核盘菌；核盘菌衰退相关病毒；侵染性克隆 核盘菌病毒s s d r v 的5 味端克隆及侵染性伞长e d n a 克降的构建 a b s t r a c t i nt h i s s t u d y , t h ef u l l l e n g t hg e n o m i cs e q u e n c e o fs c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u m d e b i l i t a t i o na s s o c i a t e dr n av i r u s ( s s d r v ) m o d i f i e d ae d n ai n f e c t i o u sv e c t o ro f s s d r vw a sc o n s t r u c t e d ，a n dt h ei n f e c t i o u se d n av e c t o rw a st r a n s f o r m e di n t os c l e r o t i n i a s c l e r o t i o r u ms t r a i ne p 一1p n a 3 6 7 ( v i r u sf r e e ) p r e v i o u s l y , ap u t a t i v ef u l l l e n g t he d n ao fs s d r v w a sc l o n e do n t op c a m b i a l3 0 1 v e c t o r , n a m e da sp 1 3 0 1 s s d r v ( x i ee t a l ，2 0 0 6 ) i nt h i ss t u d y , p 1 3 0 1 - s s d r vw a su s e d t ot r a n s f o r m c o n i o t h y r i u m m i n i t a n s a m y c o p a r a s i t e o f & s c l e r o t i o r u mw i t h a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n 10 5t r a n s f o r m a n t sw e r eo b t a i n e d ； s o m eo ft h e mw e r ec o m f i r m e dp c ra m p l i f i c a t i o n t h ec o l o n ym o r p h o l o g y , c o n i d i a l p r o d u c t i o na n dp a r a s i t i c a la b i l i t yo fs o m et r a n s f o r m a n t sw e r es t u d i e d ，a n dt h er e s u l t s s u g g e s t e dt h a tt h ep h e n o t y p e so f t r a n s f o r m a n t sw e r en o ts i g n i f i c a n t l ya f f e c t e d t h ev i r a l e d n ac o u l db ed e t e c t e df r o mt e s t e dt r a n s f o r m a n t s ，b u td s r n ac o u l dn o tb ee x t r a c t e d f r o mt h e mw i t hc e l l u l o s ec f - 11 t h u s ，t h ef u l l l e n g t he d n ac l o n eo fs s d r vw a si n d o u b t t h ef u l l - l e n g t he d n ao fs s d r vw a sr e - a n a l y z e d ，a n dt h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a t t h ef o r m e rs p l i c e de d n aw a si n c o m p l e t e ，a n dt h es e q u e n c eo f5 e n dt h e r em i g h tb e m i s s e d a na d d i t i o n a l8 2n t - l e n g t hf r a g m e n ta tt h e5 t e r m i n u sw a sc l o n e df r o mt o t a lr n ao f s t r a i ne p - 1p nw i t hs m a r t ( s w i t c h i n gm e c h a n i s ma t5 e n do ft h er n at r a n s c r i p t ， s m a r t ) t e c h n i q u e t h u s ，t h eg e n o m eo fs s d r vw a sr e - s p l i c e d ，a n dt h ef u l l l e n g t h s e q u e n c ei s 5 5 0 0n u c l e o t i d e ( e x c l u d i n gp o l y a ) w i t ho n l yo n eo p e nr e a d i n gf r a m e ( 17 4 n t 一5 2 7 4 n t ) ，t h e r ei sac a ps t r u c t u r e a t5 e n d f u r t h e ra n a l y s i ss h o w e dt h a tt h e s e q u e n c ei sv a r a b l ea tt h e5 u n t r a n s l a t i o nr e g i o n ，a n dh a sap o l y as t r u c t u r ea t3 e n d t h es e c o n d a r ys t r u c t u r e so f5 - u t ra n d3 - u t rw e r ep r e d i c t e d ，a n dt h r e eh a i r p i n s t r u c t u r e sw e r ed e d u c e da t5 u t ra n dat r n ak n o ts t r u c t u r ea t3 - u t r b a s e do nt h em o d i f i e dg e n o m i cs e q u e n c eo fs s d r v , an e wf u l l l e n g t hi n f e c t i o u s e d n av e c t o r , n a m e dp t s v h ，w a sc o n s t r u c t e db yi n s e r t i n gt h ee d n ab e t w e e nt r p c p r o m o t e ra n dt r p ct e r m i n a t o rf r o ma s p e r g i l l u sn i d u l a n s t h ep t s v hw a sl i n e a r z e dw i t h r e s t r i c t i o ne n z y m e ，a n dt r a n s f o r m e di n t o & s c l e r o t i o r u ms t r a i ne p 1p n a 3 6 7w i t h i l 华中农业大学2 0 0 9 届硕士毕业论文 e l e c t r o p o r a t i o nu s i n gp r o t o p l a s ta sa c c e p t o r , 9t r a n s f o r m a n t sw e r eo b t a i n e d t h eg r o w t h r a t ea n dt h ep a t h o g e n i c i t yt ot o m a t ol e a v e so ft h et r a n s f o r m a n t sw e r er e d u c e ds l i g h t l y p c ra n a l y s i ss h o w e dt h a ts s c l e r o t i o r u me p - 1p n a 3 6 7h a dt h ee d n ao fs s d r v r t - p c ra n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ec d n ao fs s d r vh a dt r a n s c r i b e dn o r m a l l y , b u tt h e r e p l i c a t i n gf o r m ( d s r n a ) c o u l d n o tb ed e t e c t e df r o mt h e s et r a n s f o r m a n t s k e yw o r d s ：m y c o v i r u s ；s c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u m ；s c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u md e b i l i t a t i o n a s s o c i a t e d 删v i r u s ；i n f e c t i o u se d n a i i i 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 否如需保密，解密时间年 月 日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究_ t - 作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 毗娩雩阁狻 帆刁年月圪日 学位论文使用授权书 揪黼鲐彳顽强撇各一 签名魄砷年舌月捌 签名日期垆肌日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 华中农业人学2 0 0 9 届硕七毕业论文 第一章文献综述 1 真菌病毒的研究进展 1 1 真菌病毒分类 真菌病毒( m y c o v i r u s 或f u n g a lv i r u s e s ) 是一类宿主为真菌的病毒，普遍存在 于真菌之中。1 9 6 2 年，英国科学家h o l l i n g s 等利用电子显微镜观察双孢蘑菇的子实 体，首次发现了三种真菌病毒粒体：直径为2 5 n m 和2 9 n m 的球形病毒及1 9 5 0 n m 的短棒状病毒。相对于植物病毒和动物病毒的研究，真菌病毒的研究滞后。目前关 于真菌病毒分布及寄主范围的研究，尚未如植物病毒学那样全面与深入。真菌病毒 核酸序列己测定的还很少，因此发现新的真菌病毒及测定真菌病毒的序列，是研究 病毒分类与进化的最好补充( p e a r s o ne ta 1 ，2 0 0 9 ) 。 真菌病毒的分类依据是病毒基因组组成及复制方式。目前所发现的绝大多数真 菌病毒的基因组核酸是d s r n a 或( + ) s s r n a ，其中以d s r n a 为主，( - ) s s r n a 和d n a 病毒尚未见报道。双链r n a 真菌病毒( d s r n a 真菌病毒) ，根据病毒粒体大小分为 两大类：直径为8 01 1 i n 的双层衣壳结构的球形粒体，如呼肠孤病毒科( r e o v i r i d a e ) 的m y c o r e v i r u s e s 属；直径为2 5 5 0 n m 的等轴球形病毒粒体，根据基因组的分段多少， 又可分为全病毒科( t o t i v i r i d a e ) 、双分病毒科( p a r i t i v i r i d a e ) 和黄绿病毒科 ( c h y r o v i r i d a e ) 等3 个科，其中全病毒科( t o t i v i r i d a e ) 不存在基因组分段现象， 只有一条d s r n a 片段编码外壳蛋白( c o a tp r o t e i n ，c p ) 和依赖r n a 的r n a 聚合酶 ( r n a - d e p e n d e n tr n ap o l y m e r a s e ，r d r p ) 。 s s r n a 真菌病毒不编码外壳蛋白，或多或少以d s r n a 复制体形式存在于寄主 中，有充分的证据表明，病毒复制和表达由r d r p 及解旋酶的引发。可将( + ) s s r n a 真菌病毒分为低毒病毒科( h y p o v i r i d a e ) 、杆菌状核糖核酸病毒科( b a r n a v i r i d a e ) 和裸露病毒科( n a r n a v i r i d a e ) 等3 个科，另外一些s s r n a 分为假病毒科( p s e u d o v i r i d a e ) 和变位病毒科( m e t a v i r i d a e ) 2 个科( g h a b r i a l & s u z u k i ，2 0 0 8 ) 。 还有一些真菌病毒的分类地位尚未未确定，如b o t r y t i sv i r u sf 和b o t r y t i sv i r u s x 、s c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u md e b i l i t a t i o n a s s o c i a t e dr n av i r e s ( s s d r v ) 和s c l e r o t i n i a s c l e r o t i o r u mr n av i r u sl ( s s r v - l ) 、d i a p o r t h er n av i r u s ( d r v ) 、s c l e r o p h t h o r a m a c r o s p o r ev i r u s e sa a n db ( s m v aa n ds m vb ) 等。其中b o t r y t i sv i r u sx 与马铃薯x 核盘菌病毒s s d r v 的5 味端克隆及侵染性全长c d n a 克隆的构建 病毒组( p o t e x v i r u s ) 的病毒有相似的基因组结构。b o t r y t i sv i r u sf 和s s d r v 的r d r p 与马铃薯x 病毒属亲缘关系最近，其基因组结构上有显著的差异，b o t r y t i sv i r u sf 的基因组含有2 个阅读框，编码r n a 复制酶和外壳蛋白，而s s d r v 的基因组仅有 一个阅读框，编码r n a 复制酶，不编码外壳蛋白。s s r v - l 基因组也只有一个阅读 框，编码r n a 复制酶，在系统进化上与植物病毒有亲缘关系，但与人类戊型肝炎病 毒( h e v ) 、鸟类戊型肝炎病毒( a h e v ) 和昆虫病毒( h e l i c o v e r p aa r m i g e r as t u n tv i r u s ， d e n d r o l i m u s p u n c t a t u st e t r a v i r u s 和n u d a u r e l i ac a p e n s i sb e t av i r u s ) 等病毒亲缘关系更 近。 1 2 真菌病毒的传播 真菌病毒在传播上，与细菌病毒、植物病毒、动物病毒有很大的差异，即真菌 病毒不存在体外侵染寄主真菌的途径。通常提纯的真菌病毒没有侵染力，真菌病毒 不能裂解寄主细胞，不存在介体传播( b u c k ，1 9 8 6 ) 。自然条件下，真菌病毒的寄主 范围很窄，仅仅局限于特定的种，甚至只局限于特定的菌株。 真菌病毒的传播有垂直传播和水平传播两种方式。垂直传播主要以真菌繁殖时 产生的孢子携带病毒进行传播，无性生殖产生的无性孢子病毒携带率很高，无性孢 子能普遍检测到真菌病毒，如蘑菇褐腐病菌( m y c o g o n ep e r n i c i o s a ) 的厚垣孢子 ( a l b o u ye ta 1 ，1 9 7 2 ) 、禾柄锈菌( p u c c i n i ag r a m i n i s ) 的夏孢子( r a w l i n s o ne ta 1 ， 1 9 7 3 ) 、核盘菌( s e l e r o t i n i as c l e r o t i o r u m ) 的菌核( b o l a n d ，1 9 9 2 ) 等都可以检测到真 菌病毒。胡开辉( 1 9 9 9 ) 认为真菌孢子中病毒的脱除机制可能与真菌孢子的形成有 关，真菌病毒不均匀的分布于菌丝体中，其先随孢子梗的形成进入孢子梗，再由孢 子梗进入孢子中，因孢子成熟到释放的时间在不同真菌种类中迟早不一，故真菌病 毒在不同类型真菌孢子中传递的情况各不相同。而真菌病毒有性生殖传播病毒因真 菌病毒种类和寄主真菌而异，大多数子囊菌门真菌的真菌病毒不能通过有性生殖传 播病毒，而感染担子菌的很多病毒可以通过有性孢子担孢子将病毒传递给后代； v a r g a ( 1 9 9 8 ) 在研究a s p e r g i l l i 的1 7 8 个分离物的d s r n a 存在情况时，从其有性后代 的线粒体中检测到了真菌病毒，因此推测a s p e r g i l l i 的在有性生殖过程中可能存在脱 除细胞质中真菌病毒的防卫机制。 真菌病毒的水平传播发生在两个遗传上可亲和的细胞间，可亲和的细胞发生菌 丝的融合进行真菌病毒的传递，真菌病毒从感染病毒的细胞进入健康细胞；但菌丝 2 华中农业大学2 0 0 9 届硕士毕业论文 融合只有在相同的营养亲和型菌株之间才能进行，因此水平传播受到真菌营养体非 亲和性( v e g e t a t i v ei n c o m p a t i b i l i t y ) 的限$ 1 j ( g h a b r i a l ，1 9 9 8 ；a n a g n o s t a k i se ta ，1 9 9 8 ) 。营 养体不亲和性被认为是丝状子囊菌用以抵御分子寄生物( m o l e c u l a rp a r a s i t e 如病毒、 质粒和转座子等) 侵入，保持真菌物种稳定的一种重要机铝l j ( s a u p e ，2 0 0 0 ) ，复杂的 营养亲和性限制了病毒的传播，显然，真菌病毒很难扩散到与寄主亲缘关系较远的 真菌中。g a n d y 等( 1 9 6 2 ) 最早证明栽培蘑菇病毒随着菌丝联合而传播并引起相应的病 害。通常认为种内或种间的营养上的不亲和性都会阻碍病毒在不同菌株间的传播， 而近年来对板栗疫病菌不同亲和性的强毒和低毒株之间的配对实验表明，营养的不 可亲和性菌株间有2 0 5 0 可以传播d s r n a 以及引起弱毒现象( 王克荣，1 9 9 6 ；周而 勋，1 9 9 6 ；a n a g n o s t a k i s ，1 9 8 3 ) 。c o m p e l ( 1 9 9 9 ) 研究表明，营养体亲和型的菌株的 病毒大小如果相同往往具有较高的同源性，营养体非亲和型菌株中的病毒即使病毒 核酸大小相同，但是它们在遗传进化上并非具有很高的同源性。d e n g 等( 2 0 0 3 ) 对新 榆枯萎病菌( o p h i o s t o m ar l o v o u t m o 币n 葡甸剪股颖币斑病菌( s c l e r o t i n i ah o m o e o c a r p a ) 的线粒体病毒的基因组序列测序分析表明，这两种菌的线粒体病毒的同源性非常高。 最近b o l a n d 研究小组又证实来自c e r a t o c y s t i s p o l o n i c a 和c e r a t o c y s t i sr e s i n i f e r a 两种 真菌中的双分病毒具有高度的同源性( n c b is e q u e n c ed a t a ) 。营养体非亲和性不能 完全阻止真病毒菌病毒的传播，有些真菌病毒可以在营养体非亲和性的菌株间以极 低的频率进行传播，从自然寄主传播至亲缘关系较远的非自然寄主中。l i u ( 2 0 0 3 ) 推定弱毒病毒( h y p o v i r u s ) 在自然条件下可以极低频率感染隐丛赤壳属 ( c r y p h o n e c t i a ) 属的其他种；核盘菌的d s r n a 可以在对峙培养的条件下传染给小 核盘菌( s c l e r o t i n i am i n o r ) ( m e l z e re t 口正，2 0 0 2 ) ；核盘菌的s s d r v 同样可以通过对峙培 养传递给同一个属的雪腐核盘菌( s c l e r o t i n i an i v a l i s ) l e t 1 9 ( 滕飞，2 0 0 8 ) 。 通过遗传工程手段打破营养体不亲和性带来的障碍，真菌病毒可以在与其寄主 不同种的真菌中繁殖和影响寄主。c h o i 等( 1 9 9 2 ) 成功地将低毒力菌株e p 7 1 3 的 l - d s r n a ( c h v - 7 1 3 ) 全长c d n a 整合到毒力菌株e p l 5 5 基因组中，获得了具低毒力 表型的转基因工程菌株，c h e n 等( 1 9 9 3 ) 对转基因工程菌株c n 2 中的d s r n a 病毒 的稳定性作了研究，连续三次单孢( 无性孢子) 分离培养，c n 2 单孢分离物均带有 l d s r n a 。连续两次接种活体板栗树茎及再分离培养，重新分离到的菌株同样含有 l d s r n a 。在c n 2 的子囊孢子后代同样可以检测到l - d s r n a ，由整合到基因组中的 3 核盘菌病毒s s d r v 的5 末端克隆及侵染性全长c d n a 克隆的构建 病毒c d n a 转录复制而来。如将h y p o v i r u s 的全长c d n a 的体外转录产物导入不携 带病毒的与c r y p h o n e c t r i a p a r a s i t i c a 营养体不亲和型菌株中，健康菌株就会转变成病 毒具传染性的弱毒菌株( c h e ne ta 1 ，1 9 9 4 ：n u s s ，2 0 0 5 ；l i n , e ta 1 ，2 0 0 7 ) ，该c d n a 的体外转录产物也可转染( t r a n s f e c t i o n ) 与板栗疫病菌同目但不同属的病原真菌中， 并导致它们出现病毒性致病力衰退( v a nh e e r d e ne ta 1 ，2 0 0 1 ；s a s a k ie ta 1 ，2 0 0 2 ) ； m o l e l e k i 等( 2 0 0 3 ) 报道另一种分类地位未定的致病力衰退相关病毒d a r v 的全长 c d n a 体外转录产物也转染特性。因此，利用真菌病毒的全长c d n a 质粒转化多种 不同v c g 菌株，构建针对不同v c g 的工程菌株，将可以提高真菌病毒的传染效率， 从而达到有效控制病害发展的目的。a n a g n o s t a k i s 等( 1 9 9 8 ) 利用转基因工程菌株 在美国康涅狄格森林田间试验证实，转基因弱毒菌株的d s r n a 达到有效的转染。 1 3 真菌病毒与寄主真菌的互作 真菌病毒侵染寄主后，能够在寄主体内稳定存在，大多数寄主真菌受到真菌病 毒感染之后，在表型上不发生显著变化( b u c ke ta 1 ，1 9 8 6 ) ，类似于植物病毒的隐症 现象，其致病作用在特定条件下才会出现。 有些真菌病毒促使寄主真菌产生毒素，有利于寄主真菌的生存。啤酒酵母 ( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 和玉米黑粉菌( u s t i l a g om a y d i s ) 均存在着嗜杀系统，可以产 生一些具有抗菌活性的外毒素称为嗜杀因子( k i l l e r t o x i n ) ，通常是蛋白质或糖蛋白， 作用部位是细胞壁受体，能够杀死属于同种或亲缘关系比较近的酵母菌( s c h m i t te t a 1 ，1 9 9 0 ；t i p p e re ta 1 ，1 9 9 1 ；s c h m i t te ta 1 ，1 9 9 7 ) 。研究表明，嗜杀系统与寄主真菌所 携带的d s r n a 病毒是直接相关的；嗜杀因子有利于嗜杀酵母与敏感酵母菌竞争有限 营养和空间的环境( m a g l i a n ie ta 1 ，1 9 9 7 ) 。有研究表明，感染真菌病毒的孢子生活力 并没有下降，反而孢子的活力得到加强，如双孢蘑菇( a g a r i c u sb i s p o r u s ) 在感染真 菌病毒后担孢子产生能力得到了提高，所产生的担孢子萌发快，生活力旺盛 ( d i e l e m a ne ta 1 ，1 9 7 2 ) 。 有些真菌病毒对寄主真菌有显著影响，如孢子产量减少、生长缓慢、色素沉降， 也可以引起病原真菌的致病力衰退。由d s r n a 的真菌病毒引起的蘑菇病毒病可以造 成食用菌产量的严重减产，造成了大量的经济损失。有些植物病原真菌受到d s r n a 病毒侵染而导致其病原真菌对宿主植物的致病力显著降低、菌丝生长缓慢、产孢量 下降、色素减少等。这种致病力衰退的菌株称为弱毒株，出现致病力衰退的现象称 4 华中农业大学2 0 0 9 届硕士毕业论文 为弱毒现象( h y p o v i r u l e n t ) ( g r e n t e ，1 9 6 5 ；g - r e n t e & s a u r e t ，1 9 6 9 ) 。在维多利亚长蠕 孢属( h e l m i n t h o s p o r u mv i c t o r i a e ) 首次报道了植物病原真菌的弱毒现象，分离到的 弱毒株，表现为生长缓慢，孢子很少产生，菌丝分枝异常同时大部分菌丝有溃解， 从弱毒株分离了两种d s r n a 病毒，分别为h v l 9 0 s 病毒和h v l 4 5 s 病毒，正常菌株 只含有h v l 9 0 s 病毒，通过感病菌株和正常菌株之间的菌丝融合可以传递弱毒特性， 1 4 5 s 病毒与弱毒性状伴随出现( g h a b r i a le ta 1 ，1 9 9 2 ) 。存在于弱毒株中的真菌病毒 或d s r n a 与弱毒现象必然有着紧密的联系，它们之间有着直接或间接的相关性。目 前，已有1 5 种已知基因组序列和结构的真菌病毒被认为与植物病原真菌的弱毒特性 ( h y p o v i m l e n c e ) 相关，这些病毒的寄主真菌包括c r y p h o n e c t r i ap a r a s i t i c a ，d i a p o r t h e p e r j u n c t a , o p h i o s t o m an o v o - u l m i ，f u s a r i u mg r a m i n e a r u m ，h e l m i n t h o s p o r u mv i c t o r i a e ， b o t r y t i sc i n e r e a ，r h i z o c t o n i as o l a n i ，r o s e l l i n i an e c a t r i x , s c l e r o t i n i ah o m o e o c a r p a 和 s c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u m 等州u s s ，2 0 0 5 ；x i ee ta 1 ，2 0 0 6 ；l i ue ta l ，2 0 0 9 ) 。研究结果 表明，病原真菌弱毒株中漆酶、纤维素降解酶、酚氧化酶、没食子酸氧化酶、草酸 ( c r a v e ne t a l ，1 9 9 3 ；w a n g e t a l ，1 9 9 5 ；s m i t e t 以，1 9 9 6 ) 等物质的活性显著降低。 真菌病毒也存在着复合侵染现象，即同一种真菌可以被多种真菌病毒感染，如 板栗疫病菌中报道存在6 种病毒( n u s s ，2 0 0 5 ) ，灰霉病菌( b o t r y t i sc i n e r e a ) 报道有5 种病毒( v i l c h e se ta 1 ，1 9 9 7 ；c a s t r oe ta 1 ，1 9 9 9 ；c a s t r oe ta 1 ，2 0 0 3 ；h o w i t te ta 1 ，2 0 0 1 ； h o w i t te ta 1 ，2 0 0 6 ) 。同一真菌的同一菌株也有可能同时感染2 种或更多种真菌病毒， 如h v l 9 0 s v 和h v l 4 5 v 共同感染燕麦枯萎病菌( h e l m i n t h o s p o r i u mv i c t o r i a e ) ( h u a n ge t a l ，19 9 6 ) 。s p h a e r o p s i ss a p i n e ar n av i m s l 和s p h a e r o p s i ss a p i n e ar n av i r u s 2 共同感 染松梢枯病菌( s s a p i n e a ) ( p r e i s i ge ta 1 ，1 9 9 8 ) ，松树枯梢病菌冷杉变种a 型 ( g r e m m e n i e l l aa b i e t i n av 牡a b i e t i n at y p ea ) 的菌株s u r s 4 中存在3 种病毒，它们分别 隶属于不同的科( 全病毒科、双分病毒科和裸露病毒科的线粒体病毒) ( t u o m i v i r t ae t a 1 ，2 0 0 5 ) ，真菌与病毒的这种特性与同一株植株可以被多种植物病毒复合感染相类 似。 5 核盘菌病毒s s d r v 的5 t 末端克隆及侵染性全长e d n a 克隆的构建 2 核盘菌的研究进展 2 1 核盘菌及其危害 核盘菌( s c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u m ( l i b ) d eb a r y ) 是一种重要的植物病原真菌，可 侵染4 5 0 多种植物( b o l a n de ta l ，1 9 9 4 ；b o l t o ne ta l ，2 0 0 6 ) ，核盘菌在我国的寄主植物 也高达3 6 科，2 1 4 种( 杨新美，1 9 5 9 ) 。核盘菌形成菌核结构，因而能顽固地存活 于土壤中越冬、越夏( p u r d y , 1 9 7 9 ) 。当温湿条件适宜时，菌核萌发产生子囊盘，散发 的子囊孢子引起初次侵染( 杨新美，1 9 5 9 ；p u r d y , 1 9 7 9 ) 。核盘菌的这种生活史循环特 点为其顽固性创造了有利条件。由它引起的菌核病是我国油菜生产上的主要病害， 年均发病率为1 0 - - 2 0 ，尤其是在长江流域的广大油菜种植区，严重年份达5 0 以上( 刘澄清等，1 9 9 1 ) 。目前菌核病己成为油菜产量进一步提高的限制因子，菌核 病也是我国北方向日葵和大豆等油料作物上的主要病害。核盘菌不仅可以在作物的 生育期造成严重危害，而且还可以在储藏和运输过程中侵染，给这些作物的产量和 品质带来了巨大的损失( 杨新美，1 9 5 9 ；王道本，1 9 8 6 ) 。 2 2 核盘菌的致病机理 核盘菌是一种弱寄生真菌，以菌核在土壤、病残体和种子中越夏和越冬，在适 宜的温度和湿度条件下，菌核陆续开始萌发，形成大量的子囊盘。子囊盘成熟后弹 射子囊孢子，子囊孢子随气流传播，在寄主上萌发产生侵入丝，借机械压力从寄主 表皮细胞间隙或伤口、自然孔口侵入。子囊孢子在田间条件下存活期可长达1 2 天， 存活时间与气候条件密切相关，特别是温度与水分。子囊孢子随气流飘散的距离可 达数十米至数千米，孢子侵染花瓣和花药，感病的花瓣和花药落到叶上，病叶腐烂 黏附茎上导致茎秆的菌丝随即侵入，完成再侵染，导致整株或秸杆枯死。核盘菌能 迅速入侵寄主组织，形成浅褐色、水样腐烂，伴随白色的棉絮状的菌丝体覆盖在被 侵染的植物组织，发病后期在植株的表面或茎杆内部形成形状、大小不一的菌核。 研究表明，草酸( o x a l i ca c i d ，o a ) 和细胞壁降解酶( c e l l - w a l l - d e g r a d i n ge n z y m e s ， c w d e s ) 在核盘菌的致病过程中起着重要作用。目前，普遍认为核盘菌分泌的草酸 毒素是致病力的决定因子( d u t t o na n de v a n s ，1 9 9 6 ；z h o ua n db o l a n d ，1 9 9 9 ) 。草酸的 致病机理主要有：( 1 ) 侵染早期，使寄主细胞的p h 值降至4 5 ( m a r e i a n oe ta 1 ，1 9 8 3 ； m a g r oe ta 1 ，1 9 8 4 ) ，有利于多种细胞壁降解酶酶活性的发挥，有利于核盘菌的侵入； ( 2 ) 草酸的酸化作用，抑制了植物防卫反应产生的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白 6 华中农业大学2 0 0 9 届硕士毕业论文 ( p o l y g a l a c t u r o n a s ei n h i b i t i n gp r o t e i n ，p g i p ) 的活性( f a v a r o n e ta 1 ，2 0 0 4 ) 。( 3 ) 细胞 内大量草酸的存在，与寄主植物体内的c a 2 + 结合，形成草酸钙晶体堵塞导管和维管 束，引起寄主植物的萎蔫，同时由于寄主体内c a 2 + 的减少，寄主植物的防卫能力被 弱化；( 4 ) 草酸的存在，也能抑制0 2 。和h 2 0 2 合成有关的氧化酶的活性或是阻碍氧 化酶激活信号传导的通路( 包括质膜或胞内受体与病菌的相互识别，以及参与信号传 导的酶类，如g t p 结合蛋白、蛋白激酶等) ，有利于病原菌的侵染( c e s s n ae t a l ，2 0 0 0 ) 。 ( 5 ) 草酸的酸化环境，有利于核盘菌的一些致病相关基因和生长发育相关基因表达 ( r o l l i n se ta 1 ，2 0 0 1 ；r o l l i n s , 2 0 0 3 ；c h e ne t a l ，2 0 0 4 ) ，而不利于寄主植物的生长，从而 核盘菌能够完成成功侵染。 核盘菌在核盘菌侵染寄主时能产生很多细胞壁降解酶，如蛋白酶、纤维素酶、 半纤维素酶、果胶酶类和酯酶等( r i o ue ta 1 ，1 9 9 1 ；b o l t o ne ta 1 ，2 0 0 6 ) 。果胶是构 成中胶层的主要成分，如果植物的果胶被水解后，细胞壁即被弱化，有利于病原菌 的侵入和定殖，也为病原菌提供丰富的碳源( r i o ue ta 1 ，1 9 9 1 ) 。果胶酶又称多聚半 乳糖醛酸酶( p o l y g a l a c t u r o n a s e s ，p g s ) ，在病原真菌杀死寄主细胞和软化植物组织 的致病过程中起着重要作用( k a r se ta 1 ，2 0 0 5 ) ，但并不是与所有病原菌的致病过程 相关( g a oe ta 1 ，1 9 9 6 ) 。近年来的研究表明，在核盘菌侵染的过程中e n d o p g s 基 因的表达在数量和时间上也不同( k a s z a e t a l ，2 0 0 4 ；l ie t a l ，2 0 0 4 ) ，e n d o p g - s 基因 的表达是一个动态过程，与病原菌的致病过程及外界环境密切相关。 核盘菌的致病是一个复杂的过程，既有病原菌的致病基因表达及其所涉及的信 号传导，同时也有病原菌和寄主之间的相互作用。 2 3 菌核病的防治 近年来由于大面积种植“双低油菜品种，引起油菜对菌核病的抗性降低，加 剧了菌核病的危害( 傅廷栋，1 9 9 5 ) 。另外，由于大力推广大棚等保护地生产技术， 核盘菌有了了比较适宜的生长和致病环境，蔬菜菌核病的危害也日益严重。目前尚 未发现真正的抗病品种，因此长期依赖于化学农药防治。核盘菌的抗药性和残留等 问题随之出现( 潘以楼等，1 9 9 7 ；g o s s e ne ta 1 ，2 0 0 1 ) 。自然界中，存在着一些有益微 生物，对核盘菌的菌核存活及子囊孢子萌发有抑制作用，能够寄生核盘菌，溃解核 盘菌的菌丝。利用这些有益微生物控制菌核病被认为是安全有效的，包括盾壳霉 ( c o n i o t h y r i u mm i n i t a n s ) ( c a m p b e l l ，19 4 7 ；w h i p p se ta 1 ，19 9 2 ) 、木霉( t r i c h o d e r m a 7 核盘菌病毒s s d r v 的5 末端克隆及侵染性全长c d n a 克隆的构建 s p p ) ( m e r r i m a n ，1 9 7 9 ) 、粘帚霉( g l i o l a d i u ms p p ) ( a d a m se t a l ，1 9 7 9 ) 、细顶棍 孢霉( s p o r i d e s m i u ms c l e r o t i v o r u m ) ( a d e m e se ta 1 ，19 8 2 ) 、黄色蠕形霉( t a l a r o m y c e s f l a t u s ) ( 李国庆等，1 9 9 5 ) 、假单孢杆菌( p s e u d o m o n a ss p p ) ( e x p e r te t a l ，1 9 9 5 ) 、 芽孢杆菌( b a c i l l u ss p p ) ( h ue t a l ，2 0 0 5 ) 等。核盘菌的重寄生真菌盾壳霉因专一性 强( w h i p p se t