（基础兽医学专业论文）小鼠围着床期子宫中多胺相关基因的表达、调节与功能.pdf

摘要 摘要 多胺广泛存在于真核生物细胞内，包括腐胺、亚精胺和精胺，在细胞增殖等过程中发挥 重要作用。鸟氨酸脱羧酶( o m i t h i n ed e c a r b o x y l a s e ，o d c ) 是多胺合成的限速酶，其蛋白降解 由o d c 抗酶( o d ca n t i z y m e ，o a z ) 介导。o d c 与腺苷甲硫氨酸脱羧酶( s a d e n o s y l m e t h i o n i n e d e c a r b o x y l a s e ，a m d ) 、亚精胺合成酶( s p e r m i d i n es y n t h a s e ，s r m ) 和精胺合成酶( s p e r m i n e s y n t h a s e ，s m s ) 等可通过一系列生化反应催化多胺的合成。多胺的代谢主要由亚精胺精胺 n 1 乙酰转移酶( s p e r m i d i n e s p e r m i n en 1 a c e t y l t r a n s f e r a s e ，s a t ) 、过氧化物酶体n l 乙酰基精 胺亚精胺氧化酶( p e r o x i s o m a ln 1 a c e t y l s p e r m i n e s p e r m i d i n eo x i d a s e ，p a o x ) 和精胺氧化酶 ( s p e r m i n eo x i d a s e , s m o x ) 等完成。本实验利用原位杂交、实时定量r t - p c r 和w e s t e r nb l o t 等方法，检测了多胺相关基因在围着床期小鼠子宫中的表达，并利用假孕、延迟着床及激素 处理等模型研究了这些基因在子宫中的表达与调节。在体外培养水平，我们还检测了o d c 及 多胺水平对子宫内膜细胞增殖活性以及其它多胺相关基因表达的影响。利用o d c 特异性抑制 剂a 二氟甲基鸟氨酸( a - d i f l u o r o m v t h y l o r n i t h i n e ，d f m o ) ，我们研究了o d c 在胚胎着床过程 中的作用。 o d c 的m r n a 和蛋白水平在妊娠第5 天子宫的着床位点都显著上调。在妊娠第1 5 天子 宫中，o a z l 基因的表达方式与o d c 极其接近。s r m 、a m d l 、s a t 和s m o x 等多胺相关基因也 在着床位点明显增强。而在早期妊娠小鼠子宫中，基本检测不到s m s 和p a o x 的表达信号。 在假孕第5 天以及延迟着床子宫中检测不到o d c 、o a z l 、s r m 、a m d l 、s a t 和s m o x 等基因 的表达，而在延迟激活子宫的着床位点，这些基因的表达特异性增强。在卵巢切除后用雌激 素和或孕酮处理的小鼠子宫中，o d cm r n a 表达信号显著增强，而雌激素或者孕酮受体拮抗 剂处理后却检测不到表达信号。在雌激素处理子宫中，可以检测到较强的o a z lm r n a 表达， 但在注油对照或者雌激素及雌激素受体拮抗剂共同处理的子宫中却检测不到表达信号。另外， 在类固醇激素处理的小鼠子宫中，检测不到其它多胺相关基因的表达。 在体外培养的子宫内膜细胞中，过表达o d c 能够促进o a z lm r n a 的水平。另外，精胺 或亚精胺处理后，s a t 的表达水平也明显上调。d f m o 处理后，子宫内膜基质细胞的增殖活 性明显减弱，同时细胞周期调节因子p 2 1 的基因表达水平增强。在妊娠第3 - 4 天，通过皮下 注射d f m o 后，小鼠的着床率明显降低。d f i v l o 处理还能够抑制延迟着床的激活。而用s r m 抑制剂反式4 甲基环己胺( t r a m 4 m e t h y l c y c l o h e x y l a m i n e ) 处理，却对着床没有影响。 在d f m o 处理后的子宫着床位点中，a m d lm r n a 表达水平明显增强。在体外培养的子宫内 膜细胞中，d f m o 处理也能够促进a m d l 的表达水平，而o d c 过表达或者腐胺处理却能够降 低a m d l 的表达水平。 总之，o d c 等多胺相关基因在围着床期子宫中的表达与胚胎着床过程密切相关，并且受 胚胎活性的调节。o d c 和o a z l 在子宫中的表达还受类固醇激素的调节。在子宫内膜细胞中， o d c 及多胺水平能够影响o a z l 、s a t 和a m d l 的表达以及基质细胞的增殖活性。d f m o 处理 可明显抑制着床，同时引起a m d l 表达的上调。这些结果说明o d c 等基因在子宫中的表达对 x i 东北农业大学农学博士学位论文 于胚胎着床十分重要，为我们深入了解胚胎着床的分子机制提供了新的信息。 关键词小鼠；子宫；着床；多胺；o d e a b s t r a c t 暑詈曼皇鼍皇鼍葛量皇喜詈鼍曼曼鲁詈鲁曼皇詈皇皇皇量曼皇曼皇量曼皇皇暑, i i 曼曼昌皇量葛曼曼皇曼皇曼量詈詈詈曼量量置葛墨 e x p r e s s i o n ，r e g u l a t i o na n df u n c t i o no fp o l y a m i e r e l a t e d g e n e si nm o u s eu t e r u sd u r i n gp e r i - - i m p l a n t a t i o np e r i o d a b s t r a c t t h ep o l y a m i n e s ，i n c l u d i n gp u t r e s c i n e , s p e r m i d i n ea n ds p m n i n e , e x i s tw i d e l yi ne u c a r y o t i c c e l l s t h r o u g hb i n d i n gd i f f e r e n tm o l e c u l e s ，s u c ha sd n aa n dp r o t e i n s , p o l y a m i n e sp l a yk e yr o l e s i nc e l lp r o l i f e r a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o n o r n i t h i n ed e c a r b o x y l a s e ( o d e ) ，w h i c hd e c a r b o x y l a t e s l - o r n i t h i n et of o r mp u t r e s c i n e , i st h er a t e - l i m i t i n ge n z y m eo ft h ep o l y a m i n eb i o s y n t h s i s t h er a p i d t u r r l o v e ro fo d cp r o t e i ni sm e d i a t e db yo m i t h i n ed e c a r b o x y l a s ea n t i z y m e ( o a z ) b yas e r i a lo f b i o c h e m i c a lr e a g t i o r l s p o l y a m i n e sa r ec a t a l i z e db yo d ea sw e l la ss - a d e n o s y l m e t h i o n i n e d e c a r b o x y l a s e ( a m d ) ，s p e r m i d i n es y m h a s e ( s r m ) a n ds p e r m i n es y n t h a s e ( s i n s ) s p e r m i d i n e s p e r m i n en 1 一a c e t y l t r a n s f e r a s e ( s a t ) ，p e r o x i s o m a ln 1 一a c e t y l s p e r m i n e s p e r m i d i n e o x i d a s e ( p a o x ) a n ds p e r m i n eo x i d a s e ( s m o x ) a l em a i n l yi nc h a r g eo fp o l y a m i n em e t a b o l i s m i n t h i ss t u d y , t h ee x p r e s s i o no fp o l y a m i n er e l a t e dg e n e si nm o u s eu t e r u sd u r i n gp e a - i m p l a n t a t i o n p e r i o dw a se x a m i n e db yi ns i t uh y b r i d i z a t i o n , r e a l - t i m er t - p c ra n dw e s t e r nb l o t b yu s i n gm o u s e m o d e l so fp s e u d o p r e g n a n c y , d e l a y e di m p l a n t a t i o na n do v a r i a nh o r m o n et r e a t m e n t s ，t h er e g u l a t i o n o nt h ee x p r e s s i o no fp o l y a m i n e - r e l a t e dg e n e si nu t e r u sw e r ea l s od e t e r m i n e d t h ee f f e c t so fo d eo r p o l y a m i n el e v e l so nc e l lp r o l i f e r a t i o na n dt h ee x p r e s s i o n so fo t h e rp o l y a m i n e - r e l a t e dg e n e sw e 他 i n v e s t i g a t e di nc u l t u r e du t e r i n ec e l l s t h ei m p o r t a n c eo fo d ea c t i v i t yi ne m b r y oi m p l a n a t i o nw a s s t u d i e db yt r e a t i n gp r e g n a n tm i c ew i t h a - d i f l u o r o m e t h y i o r n i t h i n e ( d f m o ) ，as p e c i f i ci n h i b i t o rf o r o d c o u rr e s u l t ss h o w e dt h a tb o t hu t e r i n eo d em r n aa n dp r o t e i nl e v e l sw e r es t r o n g l ye x p r e s s e da t i m p l a n t a t i o ns i t e so nd a y5o fp r e g n a n c y t h ee x p r e s s i o np a t t e r no fo a z 1i nu t e r u sd u r i n gd a y s1t o 5o fp r e g n a n c yw a sq u i t es i m i l a rt oo d e t h ee x p r e s s i o nl e v e l so fs r r n , a m d l ，s a ta n ds m o xw e r e a l s ou p - r e g u l a t e da ti m p l a n t a t i o ns i t e s h o w e v e r , t h e r ew e r en od e t e c t a b l es i g n a l so fs m sa n dp a o x m r n a si nu t e r u s i nt h eu t e r u so nd a y5o fp s e u d o p r e g n a n c yo ru n d e rd e l a y e di m p l a n t a t i o n , t h e e x p r e s s i o ns i g n a l so fo d c ，o a z l ，s r m , a m di ，s a ta n ds m o xw e r eh a r d l yt ob ed e t e c t e d , b u tt h e r e w e r es t r o n ge x p r e s s i o ns i g n a l so ft h e s eg e n e sa f t e rt h ea c t i v a t i o no fd e l a y e di m p l a n t a t i o n i nt h e o v a r i e c t o m i z e dm i c et r e a t e dw i t he s t r o g e na n d o rp r o g e s t e r o n e , o d em r n ae x p r e s s i o ns i g n a l s w e r es t r o n g l yd e t e c t e di nu t e r u s ，b u tt h e r ew e r ei i od e t e c t a b l es i g n a l so fo d ee x p r e s s i o nw h e n c o - t r e a t e dw i t he s t r o g e no rp r o g e s t o n er e c e p t o ra n t a g o n i s t s i ne s t r o g e n - t r e a t e dg r o u p , o a z lm r n 参 s i g n a l sw e r ee v i d e n t l yd e t e c t e di nu t e r u s ，b u tn o ti nc o n t r o lo re s t r o g e nr e c e p t o ra n t a g o n i s t - t r e a t e d g r o u p b e s i d e s , t h e r e w e r on o e x p r e s s i o ns i g n a l so fo t h e rp o l y a m i n e - r e l a t e dg e n e si n 东北农业大学农学博士学位论文 h o r m o n e - t r e a t e du t e r u s i nc u l t u r e du t e r i n ec e l l s ，o a z lm r n al e v e lw a se n h a n c e da f t e rt h eo v e r e x p r e s s i o no f o d e s a t e x p r e s s i o nl e v e lw a sa l s ou p - r e g u l a t e da f t e ra d m i n i s t r a t e db ye x o g e n o u ss p e r m i d i n eo rs p e r m i n e a t t e ra d m i n i s t r a t i o no fd f m o ，t h ep r o l i f e r a t i o na c t i v i t yo fu t e r i r 硷s t r o m a lc e i l sw a sd e c r e a s e d , w h i l et h ee x p r e s s i o nl e v e lo f c e l lc y c l er e g u l a t o rp 2 1w a si n c r e a s e d 1 1 把n u m b e r so f t h em i c ew i t h i m p l a n t a t i o ns i t e sw e r ed e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l ya f t e ri n j e c t i n gm i c ew i t hd f m od u r i n gd a y3 a n d o r4o fp r e g n a n c y t h ea c t i v a t i o no fd e l a y e di m p l a n t a t i o nw a sa l s oi n h i b i t e db yd f m o t r e a t m e n t n e v e r t h e l e s s ，t r a n s 一4 - m e t h y l c y c l o h e x y l a m i n e , as p e c i f i ci n h i b i t o rf o rs r m , h a dn oe f f e c t o ne m b r y oi m p l a n t a t i o n 1 1 h ee x p r e s s i o nl e v e lo fa m dla ti m p l a m t = i o ns i t e sw a sh i g i l l yi n d u c e d a t t e rt h ei n j e c t i o n so fd f m o 。a n da m d 1m r n al e v e lw a sa l s ou p - r e g u l a t e db yd f m ot r e a t m e ni n c u l t u r e du t e r i n ec e l l s h o w e v e r i t se x p r e s s i o nl e v e lw a sd e c r e a s e da f t e rt h eo v e r e x p r e s s i o no f0 d c o rp u t r e c i n et r e a t m e n t t h e s ed a t ad e m o n s t r a t e dt h a tt h ee x p r e s s i o nl e v e l so fo d e ，o a z l ，s r m , a m d l ，s a ta n ds m o x w e r es p e c i f i c a l l yu p - r e g u l a t e da ti m p l a n t a t i o ns i t e si nab l a s t o c y s t d e p e n d e n tm a n n e r , s u g g e s t i n g t h e i ri m p o r t a n tr o l e si ne m b r y oi m p l a n t a t i o n f u r t h e r m o r e ，u t e r i n ee x p r e s s i o n so fo d ca n do a z l w e r ec o n t r o l e db ys t e r o i dh o r m o n e s i nc u l t u r e de n d o m e t r i a lc e l l s ，e x p r e s s i o nl e v e l so fo a z l ，s a t a n da m dlw e r er e g u l a t e db yo d eo rp o l y a m i n e sl e v e l f i n a l l y , 廿l ee m b r y oi m p l a n t a t i o nw a s i n h i b i t e ds i g n i f i c a n t l yb yt h ei n j e c t i o no fd f m o ，i n d i c a t i n gt h a to d ea c t i v i t yi se s s e n t i a lf o r i m p l a n t a t i o n i nc o n c l u s i o n , o u r r e s u l t s s u g g e s t t h a tt h ec o o r d i n a t e d e x p r e s s i o n s o f p o l y a m i n e - r e l a t e dg e n e s i nm o u s eu t e r u s d u r i n ge a r l yp r e g n a n c ym a yb ei m p o r t a n t f o r i m p l a n t a t i o n k e yw o r d s ：m o u s e ，u t e r u s ，i m p l a n t a t i o n , p o l y a m i n e ，o d e c a n d i d a t e ：z h a oy u e c h a o s p e c i a l i t y ：b a s i cv e t e r i a n r y 独仓f j 声明与学位论文版权使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。 与我一周工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示谢意。 学位论文作者签名：1 ，( 森嵋日期：b 。譬年g 月纡日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 学位论文作者签名：7 飞炎够 日期：加男彩凡夕日 导师 签名： 日期：沙眸肛自 前言 1 前言 1 1 胚胎着床及其分子调控 1 1 1 胚胎着床 胚胎着床( e m b r y oi m p l a n t a t i o n ) 是指哺乳动物胚胎由输卵管进入子宫以后，通过一系列 细胞与分子水平上的相互作用，与子宫内膜相互识别、黏附，并建立紧密联系的过程。胚胎 着床分为定位、黏附以及侵入等过程( m a k r i g i a n n a k i sa n dm i n a s ，2 0 0 7 ；o e h n i n g e r , 2 0 0 8 ) 。在 着床前以及启始阶段，子宫内膜发生许多重要的生理变化，如细胞增殖分化以及血管生成等； 同时胚胎进一步发育，具备着床潜能( i m p l a n t a t i o nc o m p e t e m ) ，并在分子水平与子宫内膜进 行互动联系。这些过程对于着床的顺利进行是至关重要的。 在小鼠，发情周期大约为4 天。在妊娠第1 4 天( 检阴道栓日为第l 天) 期间，卵巢分 泌的孕酮和雌激素协同作用，促进子宫内膜上皮和基质相继进行增殖；第4 天上午，子宫进 一步分化进入接受态( r e c e p t i v i t y ) ，此时若存在具有活性的胚泡则启动着床。这一开放状态 只能持续很短的时间( 约1 4 2 4 小时) ，称为着床窗口( i m p l a n t a t i o nw i n d o w ) ( p a r i ae ta j ，1 9 9 3 ； c h e n ge ta l ，2 0 0 1 ) 。在第4 天晚上，胚泡开始粘附于子宫腔上皮，并诱导其凋亡，而着床胚 泡周围的基质细胞则迅速增殖，并开始蜕膜化( d e c i d u a l i z a t i o n ) ，同时着床位点血管通透性 增加；第5 天上午，这些发生蜕膜化的基质细胞继续增殖；到了第5 天下午，随着初级蜕膜 区的发育( m m a r yd e c i d u a lz o n e ) ，这些细胞的增殖活性已经减弱( t a nv ta l ，2 0 0 2 ) 。随着蜕 膜化过程的不断深入，蜕膜区延伸至系膜侧，在此区域将进行胎盘化( p l a c e n t a t i o n ) 过程， 并最终建立功能性胎盘，为发育中的胚胎提供营养( t o r r ye ta l ，2 0 0 7 ；d e ye ta l ，2 0 0 4 ) 。 胚胎着床是哺乳动物生殖过程中妊娠建立和维持的关键环节。目前有关胚胎着床机理方 面的研究日益受到关注，成为生殖生物学、发育生物学的热点问题。在人类，早期流产主要 是由于围着床过程中发生的缺陷所致，这在当今世界范围内已成为社会问题。目前人口增长 虽仍十分迅速，但却有15 的夫妇因为不孕而没有子女( t a p i ae ta l ，2 0 0 8 ；w a n ga n dd e y , 2 0 0 6 ) 。尽管在人工辅助生殖技术方面取得了长足的进步，尤其是体外受精以及胚胎移植技术 已日趋成熟，但妊娠率直只有2 0 3 0 ，这很可能是无法准确判断子宫何时处于接受态所致。 另外，在着床阶段进行药物避孕安全而有效。因此，全面而深入地阐明胚胎着床机理，对于 提高家畜的繁殖率、治疗人类的不孕症、以及开发新型避孕措施和防治生殖相关疾病方面等 具有重要的理论意义。 东北农业大学农学博十学位论文 1 1 2 胚胎着床的分子调控 ( 1 ) 卵巢类固醇激素 目前认为，小鼠早期妊娠阶段，卵巢雌激素和孕酮等可诱导子宫内膜的结构及功能发生 显著变化，有利于胚胎着床入，建立接受态( b a g c h ie ta l ，2 0 0 1 ) 。然而，雌激素和孕酮在着 床过程中的作用是不同的。例如，在有些动物体内，胚胎处于休眠状态，游离于子宫中，着 床延迟进行，称为延迟着床( d e l a y e di m p l a n t a t i o n ) ，是深入研究着床的分子机制一个良好的 模型。延迟着床一般分为三个阶段：进入延迟着床，持续延迟着床以及延迟着床的激活。将 早期妊娠第4 天上午的小鼠的卵巢切除，可诱导胚泡进入休眠状态。持续注射孕酮可维持延 迟着床，而注射雌激素则可激活胚胎结束延迟着床( y o s h i n a g aa n da d a m s 19 6 6 ；v a nv o o r h i s a n dd o k r a s 2 0 0 8 ) 。 雌激素 用低剂量雌激素处理小鼠可延长着床窗口开放时间；而较高剂量处理，雌激素能导致窗 口开放时期子宫内环境失调，并且着床相关因子基因表达异常( m a e t a l ，2 0 0 3 ) 。雌激素对于 子宫内膜接受态如此重要，主要是因为雌激素通过其受体( e s t r o g e nr e c e p t o r ，e s r ) 能够对许 多着床相关基冈的表达进行调控。 e s r 存在两种亚型，包括e s r l 和e s r 2 ，虽然都具有类固醇激素核受体超家族的典型结构， 但由于基本蛋白结构不同，它们的转录因子活性仍存在很大差别( h a l t , 1 9 9 9 ；s h i a ue ta t , 2 0 0 2 ) 。在雌激素经典的配基依赖型作用机制中，雌激素与e s r 结合可对其进行激活，随后在 一些辅助因子的作用下e s r 同靶基因启动子上的雌激素反应元件( e s t r o g e n r e s p o n s ee l e m e n t ， e i 迮) 结合，进而调节其转录活性。然而近期研究表明，在没有e r e 存在的情况下，e s r 仍 能调节一些基因的表达，即e r e 非依赖型机制( d e m a y oe ta l ，2 0 0 2 ) 。例如，在一些受雌激 素调控的靶基因启动子上存在g c 富含序列，e s r s p l 复合物可与这些序列结合，并诱导靶基 因转录活性( m c k e n n ae ta l ，1 9 9 9 ) 。除此之外，雌激素作用机制实际上还包括配基非依赖型 机制和细胞表面非基因组效应的信号传导机制等( d e m a y oe ta t , 2 0 0 2 ) 。 通过研究e r s l 敲除和e r s 2 敲除小鼠发现，e s r l 在子宫e s t 活性中发挥主导作用。将正 常胚胎移植到雌激素处理过的假孕的e s r l 敲除小鼠子宫中，着床不能进行，说明e s r l 活性 对于着床是必需的( h e w i t te ta l ，2 0 0 2 ) 。尽管如此，e s r l 敲除小鼠子宫中却能够正常进行蜕 膜化( c u r t i s 融a 1 1 9 9 9 ；h e w i t ta n dk o r a c h , 2 0 0 3 ) ，并且e s r l 敲除后，同源盒a1 0 ( h o m e o b o x a 1 0 ，h o x al o ) 和孕酮受体( p r o g e s t e r o n er e c e p t o r ，p g ) 等蜕膜关键基因的表达没有受到影 响( h e w i t te ta l ，2 0 0 2 ) 。这些结果说明，雌激素在蜕膜化反应过程中并不起重要作用。当用 高剂量雌激素处理延迟着床小鼠时，子宫中环氧合酶2 ( p r o s t a g l a n d i n e n d o p e r o x i d es y n t h a s e2 ， p 哆2 ) 、白血病抑制因子( 1 e u k e m i ai n h i b i t o r yf a c t o r ，l i f ) 、肝素结合的表皮生长因子 ( h e p a r i n - b i n d i n ge p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r ，h b e g f ) 、h o x a l 0 以及双调蛋白( a m p h i r e g u l i n ，a r g ) 2 前言 m 等着床关键基因的表达均发生异常( m ae ta l ，2 0 0 3 ) 。另外，利用基因芯片技术，可以在基因 组水平上建立一个子宫中受雌激素调节的基因图谱，这有助于我们深入理解雌激素通过怎样 的分子机制参与着床。例如，在雌激素处理6 小时的小鼠子宫中，有6 1 6 个基因的表达发生 变化，其中有2 9 9 个上调：雌激素处理1 2 小时后，则有6 3 8 个基因的表达发生变化( h o n ge t a l ，2 0 0 4 ) 。通过比较延迟着床与延迟着床激活的子宫内膜中基因表达的变化情况，发现延迟 着床激活的子宫内膜中有1 2 8 个基因上调，有i 0 1 个基因下调( r e e s ee ta l ，2 0 0 1 ) 。有趣的是， 在着床过程中孕酮对g s r 活性还具有调节作用( k u r i h a r ae ta l ，2 0 0 7 ) 。虽然目前对雌激素参与 胚胎着床的分子机制做了大量研究，但由于雌激素作用途径的复杂性，仍存在许多问题尚待 解决。 孕酮 孕酮在哺乳动物建立和维持妊娠过程中起着至关重要的作用。孕酮在早期妊娠过程中的 主要作用有：( 1 ) 调节子宫分化进入接受状态：( 2 ) 促进胚胎与子宫建立相互联系：( 3 ) 促 进子宫内膜基质细胞的增殖与分化，为胚胎发育创造有利环境( b a g c h ie ta l ，2 0 0 5 ) 。在啮齿 类，黏附前子宫基质普遍发生水肿，子宫腔因而闭合并有利于胚胎与子宫腔上皮之间进行黏 附反应。正常妊娠或假孕过程中，整个子宫腔的闭合并不需要胚泡存在，单独孕酮处理即可 使子宫腔闭合：而缺失孕酮子宫腔则不能够闭合( d e y e ta l ，2 0 0 4 ) 。 孕酮在子宫中是通过孕酮受体来发挥作用的。p 蓼有p g r a 和a g r b 两个亚型，均由同一个 基因编码。p 蓼蛋白具有典型的核受体超家族成员结构：配体结合区、d n a 结合区和转录激 活区( l e ee ta l 。2 0 0 6 ) 。p g r a 基因敲除小鼠卵巢功能异常，不能进行蜕膜反应，妊娠失败， 同时子宫腔上皮发生异常增殖；这些表型与p g r a 和p g r b 双敲除小鼠的很接近。而p r b 基因 敲除鼠只表现出乳腺结构发育异常( m u l a e j e r i e e v i ee ta i , 2 0 0 0 ) 。这些结果说明，在子宫中孕 酮主要通过p g r a 来发挥作用。近年研究发现，p 矿的转录活性需要与核受体辅助激活因子 ( n u c l e a rr e c e p t o rc o , a c t i v a t o r ，n c o a ) 家族成员共同作用来完成( g e h i ne ta l ，2 0 0 2 ) 。n e o a l 敲除小鼠的蜕膜反应存在明显缺陷( c h e o ne ta l ，2 0 0 2 ) ，而n c o a 2 和n e a 0 3 敲除并没有表现 出这样的异常，说明n e o a l 主要参与介导子宫中的孕酮孕酮受体途径。此外，f k 5 0 6 结合 蛋白4 ( f k 5 0 6b i n d i n gp r o t e i n4 ，f k b p 5 2 ) 也能够通过辅助p g r a 的转录活性在小鼠胚胎着床 过程中发挥重要作用( t r a n g u c he ta l ，2 0 0 5 ) 。 近年来发现，在胚胎着床过程中许多基因的表达受孕酮调节。如成形素家族成员 h e d g e h o g ( h h ) 、w m 原癌基因和骨成形蛋白( b o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i n ) 等，它们对于子 宫内膜接受态和胚胎着床十分重要。新近发现i n d i a nh e d g e h o g 以及转录因子g l i l 3 参与的 途径在小鼠子宫接受态的建立中是必需的，而这一途径正是受孕酮调节的。此外，h o x a l o 、 两性调节蛋白以及结缔组织生长因子( c o n n e c t i v et i s s u eg r o w t hf a c t o r ) 等也作为孕酮调节的 关键基因在着床以及蜕膜化过程中发挥重要作用( w a n ga n dd e y , 2 0 0 6 ；v i t i e l l oe ta 1 2 0 0 7 ) 。 用p 伊的拮抗剂r u 4 8 6 处理小鼠后发现，有7 8 个子宫接受态相关基因的表达发生显著下调 ( c h e o ne ta 1 2 0 0 2 ) 。 3 东北农业大学农学博士学位论文 ( 2 ) 与着床相关的其它分子 除雌激素和孕酮外，着床窗口的开放和维持、着床启动以及蜕膜化等过程还需要许多在 早期妊娠子宫中呈时空特异性表达的基因的参与，使胚泡和子宫内膜之间在分子水平上建立 紧密联系。以下将以l i f 和p t g s 2 等胚胎着床关键分子为例对此进行简要介绍。 自血病抑制因子 l i f 是一个糖蛋白类细胞因子，属于白介素6 ( i n t e r l e u k i n 6 ，1 1 6 ) 家族成员。l i f 同其受 体( l i fr e c e p t o r ，l i f r ) 结合，同时白介素6 信号信号转导因子g p l 3 0 ( i n t e r l e u k i n6s i g n a l t r a n s d u c e r ，g p l 3 0 ) 作为伴侣分子共同进行信号转导。另外，信号转导及转录活化因子 ( t r a n s d u c e r a n da c t i v a t o ro f t r a n s c r i p t i o n ，s t a t ) 是g p l 3 0 信号途径下游的重要分子，而l i f 及 其受体途径对其表达具有调节作用。l i f 途径参与调节许多细胞的生长和分化，其中包括胚胎 干细胞( e m b r y os t e mc e l l s ) 。 目前研究已经证明，l i f 对于人类及小鼠子宫接受态的建立极为关键( d i m i t r i a d i se ta t , 2 0 0 7 ；d i n ge ta l ，2 0 0 8 ；w h i t ee ta l ，2 0 0 7 ) 。小鼠中，在妊娠第天4 上午l i f 表达于子宫腺体， 而在该天夜里则表达于基质细胞中，提示l i f 可能参与着床窗口的开放以及随后的着床启动 过程( s t e w a r t e t a t , 1 9 9 2 ) 。在人类，l i f 在着床时期子宫中的表达水平也较高( d e y e t a l 2 0 0 4 ) 。 l i f 基因敲除后，小鼠胚泡处于休眠状态，不能启动着床( s t e w a r te ta l ，1 9 9 2 ) 。另外，将g p l 3 0 的s t a t 结合位点缺失后，也能够导致着床失败( e r n s te ta 1 2 0 0 1 ) 。尽管如此，l i f 参与胚胎 着床的具体机制还不十分清楚，有人认为l i f 似乎能调节子宫蜕膜中白细胞与着床胚泡之间 的反应( w a n g a n dd e y , 2 0 0 6 ) 。此外还发现，l i f 敲除小鼠子宫中与着床及蜕膜化密切相关的 同源盒基因m s h 1 i k e l ( m s x l ) 和h o x a l 0 表达异常( d a i k o k ue ta 1 2 0 0 4 ) 。 近来通过基因敲除技术，发现肿瘤抑制因子p 5 3 ( t u m o rs u p p r e s s o rp r o t e i np 5 3 ，p 5 3 ) 在 胚胎着床过程中发挥重要作用，而这和l i f 途径密切相关。h u 等( 2 0 0 7 ) 发现，p 5 3 敲除雄 性小鼠没有表现出生殖异常，但雌性小鼠p 5 3 基因敲除后，胚胎着床位点数目、妊娠率以及 仔鼠重量都明显下降。这些结果表明，p 5 3 在雌性生殖中发挥重要作用，而l i f 正是作为p 5 3 的下游分子来参与其中的，因为p 5 3 基因活性的丧失可直接导致l i f 在子宫中表达及功能下 降。另外一方面，用l i f 处理p 5 3 敲除的雌鼠对着床具有恢复作用。在p 5 3 基因上广泛地存 在着基因多态现象( p o l y m o r p h i s m ) ，这对于p 5 3 的转录活性具有重要影响。而在人p 5 3 蛋白 第7 2 个氨基酸残基存在一个特殊的多态现象，即脯氨酸代替精氨酸，这和妇女着床失败密切 相关( k a ye ta l ，2 0 0 6 ) 。h u 等( 2 0 0 7 ) 对于p 5 3 的这项令人意外的重要发现，为我们研究胚 胎着床分子机理提供了新思路。 环氧合酶2 在着床启始阶段的一个明显标志是子宫内膜血管通透性增强。目前认为，这一过程和前 列腺家族( p r o s t a g l a n d i n ，p g ) 密切相关( d e ye ta l ，2 0 0 4 ；g a oe ta l ，2 0 0 7 ；p a k r a s ia n dj a i n , 2 0 0 7 ) 。 p g 是含有个五元环及两个脂肪酸侧链的二十碳脂肪酸，分布广泛，在多种生理和病理过 程中发挥重要作用。p t g s 是合成p g 的终端限速酶，包括两种同工分子：组成型表达的p 罾l 4 前言 皇鲁暑皇量皇量皇量鼍i - -i _m l - - 。i i ! ! 皇曼詈! 量皇曼昌曼曼量喜 和诱导型表达的p t g s 2 。在早期妊娠小鼠子宫，p t g s 2 表达于着床胚泡附近的子宫腔上皮和基 质中。p t g s 2 敲除雌性小鼠不孕，在排卵、受精、着床和蜕膜化等过程中存在缺陷，同时p t g s l 可发挥一定补偿作用( l i r ae ta l ，1 9 9 7 ) 。p t g s 2 源的前列腺环素( p g l 2 ) 是着床位点分泌的主 要p g ，向p t g s 2 敲除小鼠注射p g l 2 类似物可在定程度上恢复着床。p g l 2 可通过激活过氧 化物酶体增殖激活因子受体6 ( p e r o x i s o m ep r o l i f e r a t o ra c t i v a t o rr e c e p t o rd e l t a ，p p a r d ) 来参与 调节着床过程( w a n ge ta l ，2 0 0 7 ) ，而p p a r d 在着床位点的表达方式与a t g s 2 类似( l i r aa n dd e y , 2 0 0 0 ) 。在l i f 敲除小鼠子宫中，p t