（应用心理学专业论文）慢性应激对大鼠空间学习记忆影响机制的研究.pdf

浙江理工大学学位论文版权使用授权书 川| i | | i | | f i | i i | 1 1 1 1 i | | | i i i | i | i i | l | i i | 删 17 4 7 4 2 2 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权浙江理工 大学i f j 丁以将本学位论文的伞部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫捕等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位沦文属于 学位论文作者签名： 保密u，在 不保密f 乳。 请 日期：2 0 1 0 年5 月 1 1 日 年解密后使用本版权书。 指导教师签名：f 争r 乙纱 日期：2 0 1 0年5 月1 1 日 浙江理工大学硕士学位论文 慢性应激对大鼠空间学习记忆影响机制的研究 摘要 目的：采用孤养与慢性轻度不可预见性应激( c u m s ) 相结合建立慢性复合应激大鼠模 型，通过行为学检测、组织形态学和分子生物学相结合的方法，研究慢性应激对大鼠空间 学习记忆行为和海马、额叶脑区神经细胞粘附分子( n e u r a lc e l la d h e s i o nm o l e c u l e ，n c a m ) 及 生长相关蛋( g r o w t ha s s o c i a t e dp r o t e i n 4 3 ，g a p 一4 3 ) 表达的影响，以及n c a m 、g a p 一4 3 表 达变化与应激性行为效应之间的相：互关系，以探讨慢性应激对大鼠空间学习记忆影h 向可能 的中枢机制。 方法：( 1 ) 动物模型：连续3 5 天慢性轻度不可预见性应激结合孤养方法建立慢性复合 应激大鼠模型。将1 6 只雄性s d 大鼠随机分为正常对照组和应激模型组( n = 8 ) 。造模期间对 照组大鼠正常饲养，模型组给予3 5 天的应激刺激。( 2 ) 动物行为指标：观测实验过程中两 组大鼠的体重变化，以o p e n f i e l d 法和双瓶蔗糖水消耗实验来评定大鼠应激后的行为变化， 作为模型是否建立成功的依据。学习记忆行为指标采用m o r r i s 水迷宫和y 迷宫。( 3 ) 脑区 组织形态观察：在确认模型建立成功的基础上处死解剖大鼠，全脑固定，切取双侧海马、 额叶脑区，h e 常规染色，光镜下( x4 0 0 ) 观察两组大鼠海马各亚区及额叶脑区神经细胞形态 变化，计神经细胞数，并分析各脑区神经细胞数与m o r r i s 水迷宫、y 迷宫各项学习记忆行 为指标间的相关性。( 4 ) 蛋白表达检测：用免疫组织化学方法研究两组大鼠海马各亚区、 额叶脑区中n c a m 、g a p 4 3 蛋白表达的变化，运用i p p 图像分析系统测定免疫反应产物的 平均光密度，并分析各脑区n c a m 、g a p 一4 3 蛋白表达水平与m o r r i s 水迷宫、y 迷宫各项 学习记忆行为指标问的相关性。 结果： 1 、慢性应激对大鼠空间学习记忆等行为的影响：模型组大鼠的体重增长量、糖水摄入 量占总饮水量的百分比均明显减少p 0 0 1 ) ；旷场实验中的水平穿越格子数、站立次数均明 显减少p 0 0 1 ) ，中央格停留时间、粪便粒数均增加p 0 0 5 ) ，与对照组相比，差异具有显 著性，表明本研究慢性复合应激大鼠模型建立成功；m o r r i s 水迷宫实验中，模型组大鼠的5 天训练平均潜伏期延长p 0 0 1 ) ，平台穿越次数明显减少( f 0 0 1 ) ；y 迷宫实验中，模型组 大鼠第二天的主动回避反应次数明显减少( p o 0 1 ) ，与对照组相比，差异均有统计学意义。 2 、慢性应激对大鼠海马各亚区、额叶脑区组织形态和神经细胞数的影响： 光镜下( 4 0 0 ) 组织形态观察：模型组大鼠海马c a l 区锥体阳性细胞层较薄，排列稀 浙江理工人学硕十学位论文 疏紊乱，细胞胞体缩小，细胞间隙大；而对照组大鼠的海马c a l 区锥体细胞清晰完整，分 布紧密规则，有明显大量的神经纤维。模型组大鼠海马c a 3 区锥体细胞排列稀疏散乱，细 胞间隙增宽，细胞丢失、数量减少，细胞质染色淡；而对照组大鼠的海马c a 3 区锥体细胞 排列整齐，细胞质染色深。模型组大鼠海马d g 区颗粒细胞水肿，呈空泡样变性、缺失， 细胞层较薄，细胞间隙大，排列稀疏；而对照组大鼠的海马d o 区颗粒细胞清晰完整，分 布面积大且密集。模型组大鼠额叶颗粒细胞核浓染，固缩，伴有胶质细胞增牛聚集成堆， 位于坏死的神经细胞附近；而对照组大鼠的额叶颗粒细胞形态及分布未见异常。 模型组海马c a l 区、c a 3 区锥体细胞数均有减少仞 o 0 5 ) ，齿状回d g 区颗粒细胞数 明显减少p 0 0 1 ) ，与对照组大鼠村j 比，差异具有显著性；而额叶脑区颗粒细胞数组间无显 著性差异。 3 、慢性应激对大鼠海马各亚区及额叶脑区n c a m 、g a p 4 3 蛋白表达的影响： 模型组大鼠海马c a 3 区、d g 区n c a m 蛋白表达水平低，均呈阴性反应，额叶脑区 n c a m 免疫组化结果呈弱阳性反应，对照组均为阳性反应；测量免疫反应产物平均光密度 进行半定量分析，模型组与对照组相比差异均显著 0 0 1 ) 。 模型组大鼠海马d g 区g a p 一4 3 免疫组化结果有弱阳性反应，对照组呈强阳性反应；测 量免疫反应产物平均光密度进行半定量分析，模型组与对照组相比差异具有显著性 ( f o 0 1 ) 。 4 、两脑区神经细胞数及n c a m 、g a p 4 3 蛋白表达量与m o r r i s 水迷宫、y 迷宫各项学 习记忆行为指标之间、n c a m 和g a p 一4 3 蛋白表达量之间的相关性分析： 海马c a i 区、c a 3 区、d g 区细胞数与y 迷宫第二天主动回避反应次数之间均呈显著 正相关p o 0 1 ；p 0 0 5 ；p o 0 5 ) ，海马d g 区细胞数与y 迷宫第一天学习次数之间呈显著 负相关0 o 0 5 ) ；海马c a 3 区及额叶脑区n c a m 表达量与水迷宫5 天训练平均潜伏期之问 均呈显著负相关( f 0 0 5 ) ，海马c a 3 区n c a m 表达量与y 迷宫第二天主动回避反应次数之 间呈显著正相关p o 0 1 ) ；海马d g 区g a p 4 3 表达量与水迷宫平台穿越次数之间呈显著正 相关p 0 0 5 ) 。 海马d g 区g a p 4 3 的表达量、海马d g 区及额叶脑区n c a m 的表达量与海马c a 3 区 n c a m 的表达量均呈显著正相关( 正o 0 5 ) ；海马d g 区g a p 4 3 的表达量与海马d g 区n c a m 的表达量呈显著正相关孵0 0 1 ) 。 i i 浙江理工大学硕士学位论文 结论： l 、慢性应激损伤大鼠空问学习记忆能力，不但妨碍学习过程( 空间记忆的获得巩固) ， 而且影响空间记忆的提取重现。 2 、慢性应激改变大鼠海马及额叶神经细胞形态结构和数量，且海马各区神经细胞数与 大鼠空问学习记忆行为指标之问具有相关性，提示慢性应激损伤大鼠空间学习记忆可能与 海马及额叶脑区神经元变性凋亡或迟发性神经元死亡有关。 3 、慢性应激模型大鼠海马及额叶n c a m 、g a p 4 3 蛋白的表达均下降，两指标之间有 相关性；且两蛋白表达水平与大鼠空间学习记忆行为指标之间亦呈显著j f 相关，推测大鼠 海马及额叶n c a m 、g a p 4 3 蛋白的表达下降可能足慢性应激损伤大鼠空间学习记忆能力的 分子机制之一。 关键词：神经细胞粘附分子；生长相关蛋白；慢性应激；海马；额叶；学习记忆 i i i 浙江理工人学硕十学位论文 e f f e c to fc h r o n i cs t r e s so ns p a t i a ll e a r n i n ga n dm e m o r yi na d u l tr a t a b s t r a c t o b j e c t i v e ：c o m b i n i n gi s o l a t i o nw i t hc h r o n i cu n p r e d i c t a b l em i l ds t r e s s ( c u m s ) e s t a b l i s ht h e c h r o n i cm u l t i p l es t r e s sr a t m o d e l ，u s i n gt h e b e h a v i o r a lt e s t i n g ，h i s t o l o g i c a lo b s e r v e da n d m o l e c u l a rb i o l o g ym e t h o d ，s t u d yt h ee f f e c to fc h r o n i cs t r e s so nt h er a t s p a t i a ll e a r n i n ga n d m e m o r ya n dt h ee x p r e s s i o no fn e u r a lc e l la d h e s i o nm o l e c u l e ( n c a m ) a n dg r o w t h - a s s o c i a t e d p r o t e i n ( g a p 一4 3 ) i nh i p p o c a m p u sa n df r o n t a lb r a i n ，a sw e l la st h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h e c h a n g eo fe x p r e s s i o no fn c a m ，g a p - 4 3a n ds t r e s sb e h a v i o r , t oe x p l o r et h em e c h a n i s mo ft h e e f f e c t so fc h r o n i cs t r e s so ns p a t i a ll e a r n i n ga n d m e m o r y m e t h o d s ：( 1 ) a n i m a lm o d e l ：ac o n t i n u o u s3 5d a y so fc h r o n i cu n p r e d i c t a b l em i l ds t r e s sw i t h i s o l a t e dr a i s e de s t a b l i s ht h ec h r o n i cm u l t i p l es t r e s sr a tm o d e l 16m a l es p r a g u e d a w l e yr a t sw e r e r a n d o m l yd i v i d e di n t on o r m a lc o n t r o lg r o u pa n ds t r e s sm o d e lg r o u p ( n = 8 ) t h ec o n t r o lg r o u pr a t s w e r en o r m a lf e dd u r i n gt h ep e r i o do fe s t a b l i s hm o d e l ，w h i l et h em o d e lg r o u pw e r eg i v e n35d a y s o ft h es t r e s ss t i m u l u s ( 2 ) a n i m a lb e h a v i o ri n d i c a t o r s ：o b s e r v i n gt h eb o d yw e i g h to ft h et w o g r o u p r a t sd u r i n ge x p e r i m e n tp r o c e s s ，u s i n gt h eo p e n - f i e l dm e t h o da n dd o u b l eb o t t l e so fs u g a rw a t e r c o n s u m p t i o nt oe v a l u a t et h ec h a n g e so fb e h a v i o ra f t e rs t r e s s ，a st h es t a n d a r do ft h em o d e lw h e t h e r t oe s t a b l i s h u s i n gm o r r i sw a t e rm a z ea n dym a z ee x a m i n et h ec a p a b i l i t yo f l e a r n i n ga n dm e m o r y i nr a t ( 3 ) b r a i nt i s s u e sm o r p h o l o g yo b s e r v a t i o n ：a tt h eb a s i so ft h es u c c e s si ne s t a b l i s h i n gc h r o n i c s t r e s sr a tm o d e l ，a l lr a t sw e r ed e e p l ya n e s t h e t i z e da n da n a t o m i z e d ，w h o l eb r a i nw e r ef i x e dw i t h c o l d4 p a r a f o r m a l d e h y d e ，c u tt h eb i l a t e r a lh i p p o c a m p u sa n df r o n t a lb r a i na r e a s ，h es t a i m n g ， u s i n gl i g h tm i c r o s c o p e ( x 4 0 0 ) o b s e r v et w og r o u pr a t so fm o r p h o l o g i c a lc h a n g e so fn e u r o n si n v a r i o u sh i p p o c a m p u ss u b r e g i o n sa n df r o n t a lc o r t e x ，c o u n tt h en u m b e ro fn e u r o n s ，a n da n a l y s i so f t h ec o r r e l a t i o nw i t ht h en u m b e ro fn e u r o n si nb r a i nr e g i o n sa n dt h eb e h a v i o ri n d i c a t o r so fm o r r i s w a t e rm a z ea n dym a z e ( 4 ) p r o t e i ne x p r e s s i o na s s a y ：u s i n gi m m u n o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i n g t e c h n i q u e d e t e r m i n e dt h e c h a n g e so fn c a m ，g a p 一4 3e x p r e s s i o n i n s u b r e g i o n o fr a t h i p p o c a m p u s ，p r e f r o n t a lb r a i nr e g i o n s ，t h e nu s i n gi p pi m a g ea n a l y s i ss y s t e m ，m e a s u r e dt h em e a n o p t i c a ld e n s i t y o ft h ei m m u n er e a c t i o n p r o d u c t s ，a n da n a l y s i so ft h ec o r r e l a t i o nw i t ht h e e x p r e s s i o nl e v e l so fn c a m ，g a p 一4 3a n dt h eb e h a v i o ri n d i c a t o r so fm o r r i sw a t e rm a z ea n dy m a z e i v 浙汀理 入学硕士学位论文 r e s u l t s ： ( i ) e f f e c t so fc h r o n i cs t r e s so ns p a t i a ll e a r n i n ga n dm e m o r ya n do t h e rb e h a v i o r ：w e i g h tg r o w t h a n dt h ep e r c e n t a g eo ft h ea m o u n to fs u g a ri n t a k ei nt o t a lw a t e ri n t a k e i nm o d e lg r o u pw e r e s i g n i f i c a n t l yr e d u c e d 0 01 ) ；i no p e n f ie l de x p e r i m e n t s ，c o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o lg r o u p ，t h e m o d e lg r o u po ft h eh o r i z o n t a lm o v ed i s t a n c ea n ds t a n d i n gt i m e sw e r es i g n i f i c a n t l yr e d u c e dp n d ，) ， t h er e s i d e n c et i m ei nc e n t r a la r e a , d e j e c t ag r a i n sh a di n c r e a s e dp n ) ，t h ed i f f e r e n c ew a s s i g n i f i c a n t ，i n d i c a t i n gt h a tt h ec h r o n i cm u l t i p l es t r e s sr a tm o d e lb u i l d i n gs u c c e s s f u l ；i nm o r r i s w a t e rm a z et e s t ，t h em o d e lg r o u p ，t h ea v e r a g el a t e n c yp e r i o do f5d a y st r a i n i n go b v i o u s l yd e l a y e d p n0 nt h en u m b e ro ft h r o u g hp l a t f o r m ss i g n i f i c a n t l yr e d u c e dp nd j ) ；i nym a z ee x p e r i m e n t ， t h em o d e lg r o u po ft h en u m b e ro fa c t i v ea v o i d a n c er e s p o n s ea tt h en e x td a yr e d u c e d ( p o o o ， c o m p a r e dw i mc o n t r o lg r o u p t h ed i f f e r e n c e sw e r es t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t ( 2 ) t h ei m p a c to fc h r o n i cs t r e s so nt h em o r p h o l o g ya n dt h en u m b e ro fn e u r a lc e l l so fr a t h i p p o c a m p u ss u b - r e g i o n ，f r o n t a lc o r t e xb r a i n ： l i g h tm i c r o s c o p e ( x 4 0 0 ) m o r p h o l o g yo b s e r v a t i o n ：m o d e lg r o u p ，t h ep o s i t i v eh i p p o c a m p a lc a l p y r a m i d a lc e l ll a y e rg r o w t ht h i n n e r , a r r a n g e m e n tw e r es p a r s ea n dd i s o r d e r , t h ec e l lb o d ys h r i n k ， c e l lg a pl a r g e ；w h i l et h ec o n t r o lg r o u po fr a t sh i p p o c a m p u sc a1 p y r a m i d a lc e l l sw e r ec l e a ra n d c o m p l e t e ，t h ed i s t r i b u t i o nw e r et i g h ta n do r d e r , t h e r ea r eo b v i o u s l yal a r g en u m b e ro fn e r v ef i b e r s m o d e lg r o u p ，h i p p o c a m p a lc a 3p y r a m i d a lc e l l s ，a r r a n g e m e n tw e r es p a r s e l ys c a t t e r e d ，c e l lg a p w i d e n e d ，c e l ll o s s ，c y t o p l a s m i cs t a i n i n gw e r ew e a k ；w h i l et h ec o n t r o lg r o u po fr a t sh i p p o c a m p u s c a 3p y r a m i d a lc e l l s ，a r r a n g e di no r d e r , t h ec y t o p l a s ms t a i n e dd a r k m o d e lg r o u p ，h i p p o c a m p a l g r a n u l ec e l l si nd g a r e ae d e m a , s h o w e dv a c u o l a ra n dd e g e n e r a t i o n ，d e l e t i o n ，c e l ll a y e ri st h i n n e r , c e l lg a pw i d e n e d ，a r r a n g e m e n ts p a r s e ；w h i l et h ec o n t r o lg r o u po fr a t sh i p p o c a m p u sg r a n u l ec e l l s i nd ga r e ac l e a ra n dc o m p l e t e ，t h ed i s t r i b u t i o no fa r e aw e r el a r g ea n dd e n s e m o d e lg r o u pt h e n u c l e io fg r a n u l e sc e l l si nr a tf r o n t a lc o r t e xw e r ed e n s e l ys t a i n ，c o n d e n s a t i o n ，a c c o m p a n i e db y p r o l i f e r a t i o no fg l i ac e l l sg a t h e r e d ，n e a rb yt h en e c r o t i cn e u r o n s ；w h i l et h ec o n t r o lg r o u po ff r o n t a l c o r t e xg r a n u l e sc e l l ss h o w e dn o r m a lm o r p h o l o g ya n dd i s t r i b u t i o n a st h en u m b e ro fn e u r o n s ，m o d e lh i p p o c a m p a lp y r a m i d a lc e l l si nc a 1a n dc a 3a r e aw e r e r e d u c e dp n 酊) ，g r a n u l ec e l l si nd e n t a t eg y r u sd e c r e a s e d0 d d 耽c o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o l r a t s ，t h ed i f f e r e n c ew a ss i g n i f i c a n t ；t h ep r e f r o n t a lc o r t e xg r a n u l ec e l l ，t w og r o u p sw e r en o s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e v 浙江理jr = 大学硕士学位论文 ( 3 ) e f f e c to fc h r o n i cs t r e s so nt h ee x p r e s s i o no fn c a m ，g a p 4 3i nh i p p o c a m p u ss u b r e g i o na n d f r o n t a lc o r t e xb r a i nr e g i o n s ： m o d e lg r o u p ，t h en c a m p r o t e i ne x p r e s s i o nl e v e li nh i p p o c a m p a lc a 3a n dd g a r e a sw e r el o w , n a m e l yb o t hn e g a t i v er e a c t i o n ，n c a mi m m u n o h i s t o c h e m i c a lr e s u l t si nt h ef r o n t a lb r a i na r e a s s h o w e daw e a kp o s i t i v er e a c t i o n ，w h i l et h ec o n t r o lg r o u pw e r eb o t hp o s i t i v er e a c t i o n ；m e a s u r i n g t h ei m m u n er e a c t i o n p r o d u c t sa v e r a g eo p t i c a ld e n s i t ym a k es e m i q u a n t i t a t i v ea n a l y s i s ，t h e d i f f e r e n c eb e t w e e nt h em o d e lg r o u pa n dt h ec o n t r o lg r o u pw e r em a r k e d nd n m o d e lg r o u p ，t h ei m m u n o h i s t o c h e m i s t r yr e s u l t so fg a p 一4 3i nh i p p o c a m p a ld ga r e aw e r ew e a k p o s i t i v er e a c t i o n ，w h i l et h ec o n t r o lg r o u ps h o w e ds t r o n gp o s i t i v er e a c t i o n ；m e a s u r i n gt h ei m m u n e r e a c t i o np r o d u c t sa v e r a g eo p t i c a ld e n s i t ym a k es e m i q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s ，t h em o d e lg r o u p c o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u pd i f f e r e n c ew a ss i g n i f i c a n t nd ，) ( 4 ) t h ec o r r e l a t i o na n a l y s i so ft h en u m b e ro fn e u r o nc e l l s ，e x p r e s s i o nl e v e lo fn c a m ，g a p 一4 3 i nt h et w ob r a i nr e g i o n sa n dt h eb e h a v i o ri n d i c a t o r so fm o r r i sw a t e rm a z ea n dy m a z e ，a sw e l la s t h ee x p r e s s i o nl e v e lb e t w e e nn c a ma n dg a p 4 3 ： t h er e l a t i o nb e t w e e nt h ec e l ln u m b e ri nh i p p o c a m p a lc a l ，c a 3 ，d ga r e aa n dt h ef r e q u e n c yo f a c t i v ea v o i d a n c er e s p o n s et h en e x td a yi nym a z ew e r eb o t hs i g n i f i c a n t l yp o s i t i v e l yc o r r e l a t e d ( p d d ，；p n d 5 ；p n d 5 ) ，t h er e l a t i o nb e t w e e nt h ec e l ln u m b e ri nh i p p o c a m p a ld ga n dt h et i m e s o fl e a r n i n gd u r i n gt h ef i r s td a yi nym a z ew a ss i g n i f i c a n t l yn e g a t i v e l yc o r r e l a t e dp n ) ；t h e r e l a t i o no fn c a me x p r e s s i o ni nt h eh i p p o c a m p a lc a 3a sw e l la si nt h ef r o n t a lb r a i na n dt h e a v e r a g el a t e n c yp e r i o do f5d a y sw a t e rm a z et r a i n i n gw e r eb o t hs i g n i f i c a n tn e g a t i v ec o r r e l a t i o n p n ) ，t h er e l a t i o nb e t w e e nn c a me x p r e s s i o ni nh i p p o c a m p a lc a 3a r e aa n dt h ef r e q u e n c yo f a c t i v ea v o i d a n c er e s p o n s et h en e x td a yi nym a z ew a ss i g n i f i c a n t l yp o s i t i v e l yc o r r e l a t e dp n d 耽 t h er e l a t i o nb e t w e e ng a p - 4 3e x p r e s s i o nl e v e li nh i p p o c a m p a ld ga r e aa n dt h et i m e so ft h r o u g h p l a t f o r mi nw a t e rm a z e a l s ow a ss i g n i f i c a n t l yp o s i t i v ec o r r e l a t i o np d - 卿 t h er e l a t i o nb e t w e e nt h ee x p r e s s i o nl e v e lo fg a p - 4 3i nh i p p o c a m p a ld ga r e a ，e x p r e s s i o no f n c a mi nh i p p o c a m p u sd ga r e aa sw e l la sf r o n t a lc o r t e xa n dt h ee x p r e s s i o nl e v e l so fn c a mi n h i p p o c a m p u sc a 3 a r e aw e r eb o t hs i g n i f i c a n t l yp o s i t i v ec o r r e l a t i o np n 卿；t h er e l a t i o nb e t w e e n t h ee x p r e s s i o nl e v e lo fg a p 一4 3i nh i p p o c a m p a ld ga r e aa n dt h ee x p r e s s i o nl e v e lo fn c a mi n h i p p o c a m p u sd g a r e aw a ss i g n i f i c a n t l yp o s i t i v ec o r r e l a t i o np - j i g 忆的形成与巩固方面2 5 7 1 。而生长相关蛋i i ( g a p - 4 3 ) 是与钙调蛋白结合的 神经组织特异性突触前膜磷酸蛋白，与引导轴突生长、调节突触形成及重塑、神经递质释 放等过程密切相关，被认为是神经元发育和可塑性的标志蛋白之一【1 2 引。n c a m 和g a p 4 3 在刺激轴突生长时协同作用，以往对它们的研究多集中于学习记忆及脑损伤修复方面的研 究，而最近研究显示，n c a m 和g a p 4 3 均参与应激反应过程【1 6 2 , 1 6 9 】，但有关海马及额叶脑 区n c a m 和g a p 4 3 是否参与慢性复合应激影响学习记忆功能的过程，国内外尚鲜有报道。 为了进一步研究n c a m 和g a p 4 3 表达的变化与慢性应激损伤的关系，本研究先建立 浙江理丁大学硕+ 学位论文 慢性复合应激大鼠模型，然后用m o m s 水迷宫和y 迷宫检测大鼠的空问学习记忆能力，再 通过组织切片h e 染色和免疫组化染色分别考察慢性应激对大鼠海马各亚区、额叶皮层的组 织细胞形态及突触功能相关蛋白n c a m 、g a p 一4 3 表达最的影响，并分别对慢性应激大鼠的 空间学习记忆能力与各脑区神经细胞数、n c a m 、g a p 4 3 蛋白表达量做相关性分析。在以 往研究的基础上，通过n o l d u s 行为分析、h e 染色、免疫组化染色等技术将行为观测、组 织形态观察和分子生物检测相结合，以探讨慢性应激对大鼠空间学习记忆影响可能的中枢 机制。 2 浙江理t 大学硕十学位论文 2 文献综述 2 1 慢性应激 竞争激烈的当今社会，人们长期处于压力环境，严重损害机体内环境而引发各种疾病， 应激与疾病的关系日益受到人们关注。美国应激研究所几十年的调查表明，应激恶化或导 致9 0 以上的疾病，包括影响脑的认知功能和精神疾病【l l 。因此，研究应激的作用机制，寻 找预防、延缓和治疗应激性疾病的有效途径，已是研究工作者关心的问题。应激( s t r e s s ) 这 一概念是h a n ss e l y e 于2 0 世纪3 0 年代提出的，指当外环境剧变时，机体内生理心理稳态 失衡而出现的综合应答状态，包括精神、神经、内分泌和免疫等方面的反应。生理范围内 的适当应激反应有利于机体的适应和生存，但若应激反应过强，持续时问过长，机体最终 对应激反应失调而导致身心损害。按持续时间长短分为急性应激和慢性应激，急性应激的 刺激持续时问短于3 0 分钟，而慢性应激指持续一个月以上的刺激。慢性应激导致正常反向 调控损伤，使交感神经系统活动过度，下丘脑垂体肾上腺皮质 ( h y p o t h a l a m i c - p i t u i t a 巧一a d r e n a l ，h p a ) 轴持续激活，从而引起慢性高糖皮质激素( g l u c o c o r t i c o i d g o ) 血症。慢性应激不但危害机体的免疫系统和心血管系统等，而且对中枢神经系统也造成 损害，与认知、情绪密切相关的脑边缘系统尤其是海马结构最易受损。海马由于富含g c 受体( g r ) ，是g c 攻击的主要靶斟2 1 ，故是介导应激反应最重要的脑区之一。大量研究表明， 慢性应激选择性损伤海马，引起海马形态功能改变，新生神经细胞死亡，树突萎缩，影响 突触可塑性的变化及神经递质的合成释放等，进而产生焦虑、抑郁情绪，影响学习记忆等 认知的基本过程【3 ，4 】。 目前国内外有关慢性应激的研究主要集中在心理精神疾病如抑郁症的发病机制及治疗 5 - 1 2 l ，慢性应激对中枢神经系统认知功能如学习记忆的影响【1 3 - 1 9 1 ，慢性应激对内分泌免疫系 统功能的影响【l o a 9 - 2 a l 等领域。就研究对象而言，组织器官的研究对象主要有大脑、心脏、肝 脏、血浆等，其中大脑脑区集中在海马结构、额叶皮层、杏仁核、纹状体、丘脑【1 0 2 5 。3 3 1 等； 分子机制研究的主要对象为神经递质及其受体【3 4 。3 8 1 、激素及其受体【1 9 , 2 4 , 3 9 - 4 1 】、神经营养因子 【4 2 4 6 1 、突触功能相关蛋白及基因【4 7 - 4 9 1 、信号转导相关蛋白及基1 困 9 , 5 0 - s 3 1 、转录翻译调控相关 蛋白及基因【5 4 - 5 6 】 和细胞凋亡相关蛋白及基因【5 0 ，5 7 1 等；就机制研究技术方法而言主要有药物 干预、组织形态光镜电镜观察、免疫组化检钡l j ( i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y ) 、蛋白印迹检测( w e s t e m b l o t t i n g ) 、原位杂交技术检测( i ns i t uh y b r i d i z a t i o n ) 、聚合酶链式反应( r t - p c r ) 、基因敲除及 转基因、m r n a 干扰等方法。 浙江理工人学硕i f ：学位论文 2 2 空间学习记忆 现代神经生理学认为，学习记忆是复杂的神经生理生化过程，学习指人或动物由练习或 经验引起，通过神经系统接受外界环境信息而较持久地影响自身行为的过程，记忆是获得的 信息或经验在脑内编码存储、加工和提取的神经活动过程，二者密切相关，是认知活动中的 重要方面。不同类型的学习记忆分属不同的记忆系统，存在着不同的信息加工和提取方式， 涉及不同的神经机制。本文涉及的啮齿类动物的空间学习记忆是一种以异我为参考点，对空 间信息加工形成认知地图的参考认知能力，是一类关于场景和事件的学习记忆，是联合型学 习中的操作式条件反射，记忆过程属于陈述性记忆，与托尔曼认知学习理论中的位置学习类 似。常用于检测空间学习记忆能力的实验装置有m o r r i s 水迷宫，放射臂迷宫，多项选择迷宫， 循环平台等，基本原理都是让动物利用空问信息作出正确的行为反应。 2 2 1 空间学习记忆的痕迹 记忆的生物学基础或记忆的储存位置称为记忆痕迹。 学习记忆痕迹分布较弥散，不同脑区可能在不同的学习记忆类型过程中的作用不同。如 海马主要负责陈述性记忆的获得和巩固，前额叶皮质主要负责工作记忆，而杏仁核主要负 责调控情绪性记忆。 以往研究中，人们认为有两个神经回路与近期的陈述性记忆有关：一条是内侧边缘环路， 即以海马为中心环节的p a p e z 回路，由大脑内侧面的隔区开始，经扣带回_ 海马旁回_ 海 马- 穹窿一下丘脑乳头体_ 乳头丘脑束_ 丘脑前核一扣带回；另一条是以杏仁核为主体的 基底外侧边缘环路：额叶眶部皮质_ 前额皮质_ 杏仁核_ 丘脑背内侧核_ 额叶眶部皮质5 引。 空间学习记忆和其它类型的学习记忆一样有很多脑区参与，通过损毁等实验，人们发现 海