二代测序技术在非小细胞肺癌中的临床应用.ppt

NGS技术在非小细胞肺癌精准治疗中的应用,目录,1,2,3,DNA测序技术简介,非小细胞肺癌精准治疗概述,NGS检测技术贯穿非小细胞肺癌精准治疗全程,DNA测序技术简介,PART01,DNA测序技术的发展历程,一代测序技术,二代测序技术(NGS),三代测序技术,化学降解法双脱氧链终止法（Sanger法）荧光自动测序技术杂交测序技术,Roche公司的454测序技术Illumina公司的Solexa技术ABI公司的SOLiD技术Life公司的IonTorrent技术,Helicos公司的Heliscope单分子测序仪PacificBiosciences公司的SMRT技术OxfordNanoporeTechnologies纳米孔单分子测序技术,孙海汐,王秀杰.DNA测序技术发展及其展望J.科研信息化技术与应用,2009(03):18-29.,20世纪中叶至20世纪末,2005年至今,2008年至今,各大DNA测序技术的比较,DNA二代测序技术（Nextgenerationsquencing，NGS）的应用,A,B,D,E,C,2009年，NGS用于罕见遗传病分子病因学研究和诊断,遗传病,2008年首次报道NGS应用于急性髓细胞性白血病，此后NGS被广泛应用于肿瘤领域；2014年，NGS技术应用于血浆ctDNA检测；2017年11月，FDA批准首个肿瘤多癌肿多基因检测平台MSK-IMPACT；2017年12月，FDA式批准了首个NGS体外诊断（IVD）上市,肿瘤,2013年，NGS应用于人类胚胎细胞非整倍体筛查的临床前研究,胚胎植入前遗传学诊断与筛查,2008年，华大基因尝试用NGS检测胎儿游离DNA2010年，基于NGS的无创产前筛查开始进入临床,无创产前DNA检测,非小细胞肺癌精准治疗概述,PART02,在中国，肺癌的发病率及死亡率均居第一位,陈万青，等.2013年中国恶性肿瘤发病和死亡分析J.中国肿瘤2017，26（1）：1-7,肺癌从单病种组织分型分子分型的演变,肺癌分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)两大类，NSCLC约占85%，主要分为肺腺癌、肺鳞癌和大细胞癌等。肺腺癌约占NSCLC40%-50%，肺鳞癌约20%-30%，大细胞癌约1.5%NSCLC不再是一个疾病，而是一组疾病，需要分类治疗，分子分型是关键,XuYetal.,TherClinRiskManag.2016May24;12:807-16Shamesetal.,JPathol.2014Jan;232(2):12133LiT,etal.JClinOncol.2013Mar10;31(8):1039-49.,HerbstRSetal.,Nature.2018Jan24;553(7689):446-454,欧美人群与中国人群NSCLC的分子特征有所不同,HerbstRS等2018年1月发表于Nature的综述中指出欧美人群中：肺腺癌中常见激活突变位于PI3K/AKT/mTOR和RAS/RAF两大信号通路，包括癌基因EGFR、KRAS、ERBB2/3、MET、ALK、RET、ROS、BRAF等。失活突变包括抑癌基因TP53、KEAP1和NF1等肺鳞癌中常见激活突变包括癌基因FGFR1-3、PIK3CA、KRAS、AKT、BRAF等，较少见EGFR扩增。失活突变包括抑癌基因TP53、CDKN2A,欧美人群与中国人群NSCLC的分子特征有所不同,Oncotarget.2016Jul5;7(27):41691-41702.,A.1770例中国NSCLC患者测序结果显示常见激活突变包括癌基因EGFR、KRAS、ALK、ERBB2(HER2)、MET、RET、BRAF、ROS1等。其中EGFR突变比例为50.3%，占据NSCLC突变半壁江山，远高于欧美人群27%,B.904例非吸烟肺腺癌患者测序结果显示常见激活突变包括癌基因EGFR、ALK、KRAS、ERBB2(HER2)、MET、RET、BRAF、ROS1等。其中EGFR突变比例高达74.5%，表明EGFR基因在中国肺腺癌患者中至关重要,肺癌进入精准治疗时代：根据分子分型决定治疗方案,DeborahBetal.,JAMAOncol2018Apr01;4(4).,NGS二代测序,ddPCR数字PCR,ARMS-PCR,FISH荧光原位杂交,IHC免疫组化,01.,02.,03.,04.,05.,临床常用的分子检测诊断技术,用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究,扩增阻碍突变系统(ARMS)，利用PCR引物的3端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性PCR扩增引物；只有在引物3碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带，野生型的不扩增,通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交，并在荧光显微镜下观察分析其结果的一种分子细胞遗传学技术,通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交，并在荧光显微镜下观察分析其结果的一种分子细胞遗传学技术,在Sanger测序方法的基础上，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息,临床常用的分子检测诊断技术优劣势比较,CAP、IASLC及AMP三大权威机构推荐由单基因检测发展为多基因检测,JMolDiagn.2013Jul;15(4):415-53.JMolDiagn.2018Mar;20(2):129-159.,2013,2018,近年NCCN指南均建议进行广泛基因检测,传统分子检测方法存在局限性，NGS平台能够全面满足NSCLC现有分子检测诊断需求,NGS检测技术贯穿非小细胞肺癌精准治疗全程,PART03,NGS检测贯穿非小细胞肺癌精准治疗全程,NGS+ctDNA有助于肿瘤的早期发现,JillianPhallenetal.,SciTranslMed.2017Aug16;9(403),Jillian运用基于NGS平台的目标错误校正测序(TEC-Seq)方法，对ctDNA的序列变化进行超灵敏的直接评估发现：健康人群中未检出肿瘤特异性基因突变；以健康人作为对照，乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌患者都检测到了肿瘤特异性突变；早期肿瘤就能够检出肿瘤特异性基因突变；检测肿瘤特异性基因突变与癌症的临床分期呈正比Jillian认为基于NGS平台的TEC-Seq分析方法为早期肿瘤的无创检测提供了广泛适用的方法，可能对癌症患者的筛查和管理有用，提示ctDNA用于常见癌种早期诊断的可能性。,CSCO指南认可NGS在非小细胞肺癌分子分型的作用,中国临床肿瘤学会指南工作委员会，中国临床肿瘤学会原发性肺癌诊疗指南2018版,NGS有助于分析非小细胞肺癌分子分型演讲，指导后续治疗,英国TRACERx肺癌研究计划的首个成果2017年发表于新英格兰医学杂志，其中提到：NSCLC腺癌“进化”的早期：诸如EGFR、MET、BRAF和TP53之类基因的突变/扩增往往发生在克隆水平；这些基因往往与NSCLC的形成有关，属于驱动基因NSCLC“进化”的晚期：75%的肿瘤出现了亚克隆水平的各种变异，而且这些变异还位于肿瘤的不同区域；是造成肿瘤内部异质性的原因,M.Jamal-Hanjanietal.,NEnglJMed.2017Jun1;376(22):2109-2121,早期,晚期,NGS指导非小细胞肺癌个体化用药及疗效预测,Tsaoetal.,JThoracOncology.Vol.11No.5:613-638,DeborahBetal.,JAMAOncol2018Apr01;4(4).,晚期非小细胞肺癌药物治疗靶向、免疫、化疗三分天下，此时基于NGS平台的多基因检测优势明显,NGS指导非小细胞肺癌个体化用药及疗效预测,RizviNA,HellmannMD,etal.Science,2015,348(6230):124-128,Rizvi对非小细胞肺癌(NSCLC)进行全外显子测序，发现肿瘤中更高的非同义突变负荷(H-TMB)人群有更好的无进展生存期(PFD)，并且对PD-1单抗(pembrolizumab)有持久的反应(DCB),NGS能够帮助发现非小细胞肺癌耐药机制及判断预后,KeEE等纳入224名EGFR突变并获得EGFR-TKI耐药的晚期NSCLC患者，分析T790M突变、MET扩增、组织学转化、KRAS、PIK3CA突变、ALK融合等耐药机制，其发现：19-del缺失组的T790M突变（50.4%）显著比L858R突变组（36.5%）高；T790M突变的患者中观察到明显的OS益处，中位OS36.0个月；在调整T790M基因型的多变量分析中，EGFR突变亚型不再被认为是显著的；结果报道：EGFRT790M高比例突变对于Exon19缺失比L858R突变的患者有更好的存活率，预后更好。,KeEE,etal.,JThoracOncol.2017Sep;12(9):1368-1375.,NGS+ctDNA早期提示肿瘤复发,ChaudhuriAA，etal.,CancerDiscov.2017Dec;7(12):1394-1403.,ChaudhuriAA等采用深度测序(CAPP-seq)循环肿瘤DNA(ctDNA)分析方法，对40例I-III期肺癌患者和54名健康成人的255份样本进行了癌症个性化监测，其发现：94%的患者在治疗后的血液样本中检测到ctDNA定期接受ctDNA监测的患者，在接受根治性治疗后，第一次检测到ctDNA的时间，比CT明确提示肿瘤复发，平均提前了5.2个月ctDNA中相应基因检测，还可以用来区别到底是疾病复发还是正常术后改变,NGS正在以更高的标准，快速进入临床服务患者,FDA自2016年底至今已批准6款NGS技术产品，以期降低NGS技术产品潜在的检测错误和解读错误风险，保证该类产品检测的安全性、有效性,2016.12.19FoundationFocusCDxBRCABRCA1/2晚期卵巢癌Rucaparib,2017.6.22OncomineDxEGFR、ROS1、BRAF非小细胞肺癌吉非替尼、克唑替尼、达拉菲尼、曲美替尼,2017.6.29PraxisExtendedRASPanelKRAS(exons2,3,4)NRAS(exons2,3,4)转移性结直肠癌帕尼单抗,2017.11.15MSK-IMPACTTMFFPE样本的468个基因MSI、MMR所有实体瘤补充诊断,2017.12.1FoundationOneCDxFFPE样本的3