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电化学发光传感器新近展 郭颖 摘要本论文分为两部分：综述和研究报告。第一部分对电化学发光的发展概 况，电化学发光传感器的响应机理以及电化学发光传感器的固定化方法作了综述。 第二部分在研究报告中，我们以鲁米诺电化学发光体系为代表基于化学修饰碳糊 电极技术为基础，探索了直接将发光试剂鲁米诺固定于碳糊电极内构建电化学发 光传感器这一研究思想的可行性和分析应用。 电化学发光传感器或电致化学发光传感器( e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c eo r e l e c t r o g e n e a t e dc h e m i l u m i n e s c e n c e n s o r ) 是电化学发光分析法与化学修饰电极技 术相结合而构建的一类实验装置。它既保留了电化学发光分析法的优点又克服了 在以往的电化学发光分析中由于选择性不好且使用较复杂的光学系统和溶液型电 化学发光试剂，使电化学发光分析法的推广应用受到限制的不足，拓宽了电化学 发光分析法的应用面，近年来引起人们极大的研究兴趣。 目前，分析研究者正致力于电化学发光传感器的固定化研究，电化学发光传 感器的固定化是指传感层中分子识别物质的固定化，即将参与化学发光反应的试 剂直接或间接的固定于电极表面。固定化技术的发展是提高传感器性能的关键因 素之一，也是分析研究者竟相研究和探索的目标。经过几十年的不断研究、探索。 目前已经建立了各种不同的固定化方法，归纳起来主要有四类：溶胶一凝胶( s 0 1 g e l ) 法，n a t i o n 膜法，l - b ( l a n g m u i r - b l o d g e t t ) 膜法和自组装( s a ) 膜法。本文的综述 部分对电化学发光分析的发展概况，电化学发光传感器的响应机理以及电化学发 光传感器的固定化方法进行了评述，主要针对不同的固定化方法近十年来在电化 学发光传感器中的应用进行了总结。 研究报告由三部分组成。我们以鲁米诺电化学发光体系为代表基于化学修饰 糊电极技术为基础，探索了直接将发光试剂鲁米诺固定于碳糊电极内构建电化学 发光传感器这一研究思想的可行性和分析应用。 第一部分为过氧化氢电化学发光传感器研究，我们的具体研究工作包括以下 两个方面： 1 提出了基于鲁米诺和醋酸纤维素修饰碳糊电极构建过氧化氢电化学发光传 感器的新方法。在最佳实验条件下，该传感器具有重现性好，抗干扰能力强和选 择性好等优点，过氧化氢浓度在4 0 x 1 0 6 - - 4 o x l 0 4 m o l l 范围内与相对电化学发光 强度呈线性关系。该方法测定过氧化氢的检出限为1 6 x l o - 6 m o l l ，相对标准偏差 为1 7 ，相关系数为0 9 9 7 8 。 2 基于吸附作用将鲁米诺固定于硅胶上，结合醋酸纤维素修饰碳糊电极而构 建过氧化氢电化学发光传感器。在最佳实验条件下，过氧化氢浓度在 4 o x l o 击o o x l o - s m o l l 范围内与相对电化学发光强度呈线性关系。该方法测定过氧 化氨的检出限为4 3 x l o t m o l l ，相对标准偏差为1 2 ，相关系数为0 9 9 0 1 。 第二部分为联氮电化学发光传感器研究，基于鲁米诺通过电价键可以有效、 稳定的固定在阴离子交换树脂上这一现象，设计出一种简便、快速、高选择性的 联氨电化学发光传感器。在最佳实验条件下，该传感器具有重现性好、选择性高、 使用寿命长、成本低等特点，联氨浓度在4 o x l 0 1 4 o x l 0 6 9 m l 范围内与相对电化 学发光强度呈线性关系。该方法测定联氨的检出限为2 3 x l o 。7 9 m l 相对标准偏差 为1 4 ，相关系数为0 9 9 4 8 。 第三部分为异烟肼电化学发光传感器研究，通过化学修饰的方法将直接参与 电化学发光反应的试剂鲁米诺固定于电极表面，结合醋酸纤维素修饰碳糊电极构 建异烟肼电化学发光传感器。在最佳实验条件下，该传感器具有重现性好、选择 性高等优点，异烟肼浓度在4 0 x 1 0 6 - 4 o x l o s g m l 范围内与相对电化学发光强度呈 线性关系。该方法测定异烟肼的检出限为4 6 x l o 。7 9 m l ，相对标准偏差为1 2 ， 相关系数为0 9 9 8 5 。 关键词；电化学发光传感器；化学修饰碳糊电极；鲁米诺 i i t h e r e c e n t l yd e v e l o p m e n t s o fe l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c es e n s o r s i na n a l y t i c a l a p p l i c a t i o n g u o y i n g a b s t r a c t ：t w op a r t sa r ei n c l u d e di nt h i st h e s i s n l ef i r s tp a r ti n v o l v e st h eg e n g r a l s i t u a t i o no fe l e e t r o c h e m i n e s c e n c e ( e c ”，s u c h a s i t s p r i n c i p l e ，t y p e s a n dt h e i m m o b i l i z a t i o nm e t h o d so ft h ee c l r e a g e n t s i nt h es e c o n dp a r to f t h i st h e s i s ，t h r e e d i f f e r e n tm e t h o d sf o ri m m o b i l i z i n gl u m i n o io nt h es u r f a c eo f t h ec a r b o np a s t ee l e c t r o d e i r ed e v e l o p e dt of a b r i c a t e h y d r o g e np e r o x i d e h y d r a z i n e a n di s o n i a z i de c ls e n s o r s 1 h y d r o g e np e r o x i d ee l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c e s e n s o r 1 1an o v e le l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c e ( e e l ) s e n s o rf o rt h ed e t e r m i n a t i o no f h y d r o g e np e r o x i d eh a sb e e nd e v e l o p e db yi m m o b i l i z i n gl u m i n o la n d c e l l u l o s ea c e t a t e f i l mo nt h es u r f a c eo f t h ec a r b o np a s t ee l e c t r o d e c o m p a r e dt ot h a to f t h ec o n v e n t i o n a l e e lm e t h o df o rh y d r o g e np e r o x i d e ，t h ep r e s e n t e ds e n s o rh a sa d v a n t a g e so fh i g h e r s e l e c t i v i t y , g o o dr e p r o d u c i b i l i t y u n d e rt h eo p t i m u me x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n sd e v e l o p e d ， t h es e n s o rr e s p o n d sl i n e a rt oh y d r o g e n p e r o x i d ec o n c e n t r a t i o n i nt h er a n g e4 0 x 1 0 也4 o x 1 0 m o l l n 赡d e t e c t i o nl i m i ti s1 6 x l o * 6 m o l l a n dt h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o no f 1 7 f o r8m e a s u r e m e n t so f 4 0 x 1 0 - 5 m o l l h y d r o g e n p e r o x i d es t a n d a r ds o l u t i o n 1 2an o v e l e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n e e ( e c l ) s e n s o r f o r h y d r o g e np e r o x i d e i s d e s c r i b e d i ti sp r e p a r e db yc o - i m m o b i l i z a t i o no fl u m i n o la n dc e l l u l o s ea c e t a t ef i l mo n t h es u r f a c eo ft h ec a r b o np a s t ee l e c t r o d e u n d e rt h eo p t i m u me x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s d e v e l o p e d ，l h cs e n s o rr e s p o n d sl i n e a rt oh y d r o g e np e r o x i d ec o n c e n t r a t i o ni nt h er a n g e 4 x 1 0 乜4 x 1 0 s m o l l 1 1 1 ed e t e c t i o nl i m i ti s4 3 x l o 7 m o l l a n dt h er e l a t i v es t a n d a r d d e v i a t i o no f1 2 f o r8m e a s u r e m e n t s 2 h i g h l y s e l e c t i v ee l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c es e n s o rf o rh y d r a z i n e a n e l e c t r o c h e m i l u m i n e s e e n c e ( e c l ) s e n s o r w i t h h i g h e rs e l e c t i v i t y , g o o d r e p r o d u c i b i l i t y a n df a s tr e s p o n s e t i m eh a sb e e nd e v e l o p e d t h es e n s o rw 淞b a s e do nt h e i m m o b i l i z a t i o no fl u m i n o li n t ot h ea n i o n e x c h a n g e rr e s i nb yt h es 仃o n ge l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o no nac a r b o np a s t ee l e c t r o d e u n d e rt h eo p t i m u me x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s d e v e l o p e d ，t h e s e n s o r r e s p o n d s l i n e a rt o h y d r a z i n e e o n c e n t r a t i o ni nt h e r a n g e 4 0 x 1 0 7 , - 4 0 x 1 0 g m l n 坞d e t e c t i o nl i m i ti s2 3 x 1 0 - 7 # m e a n dt h er e l a t i v es t a n d a r d d e v i a t i o no f1 4 f o r8m e a s u r e m e n t s 3 t h ee l e e t r o c h e m i l u m i n e s c e n e es e n s o rf o rl s o n i a z i d i l l a n e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c e o z c l ) s e n s o r f o rt h ed e t e r m i n a t i o no fi s o n i a z i dw a s f a b r i c a t e du s i n gc o - i m m o b i l i z a t i o no fl u m i n o la n dc e l l u l o s ea c e t a t ef i l mo nt h es u r f a c e o ft h ec a r b o np a s t ee l e c t r o d e u n d e rt h eo p t i m u me x p e r i m e n t a lc o n d i 6 0 n sd e v e l o p e d ， t h es e n s o r r e s p o n d s l i n e a rt oi s o n i a z i dc o n c e n t r a t i o n i nt h e r a n g e 4 o x l o 0 x 1 0 - s g m l t h ed e t e c t i o nl i m i ti s4 6 x 1 0 7 9 m l ，a n dt h er e l a t i v es t a n d a r d d e v i a t i o no f1 2 f o r8m e a s u r e m e n l s k e y w o r d s ：e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c es e n s o r ；c h e m i c a l l y m o d i f i e d c a r b o np a s t ee l e c t r o d e ；l u m i n o l i v 第一部分综述 电化学发光传感器新进展 一、引言 电化学发光，或称电致化学发光( e l e c t r o e h e m i l u m i n e s e e n e eo re l e c t r o g e n e r a t e d c h e m i l u m i n e s c e n c e ) 是电极反应的产物之间或电极产物与体系中某组分进行化学 反应产生光辐射的过程，是化学发光与电化学相结合的产物。近年来，电化学发 光分析法与化学修饰电极技术结合而构建的电化学发光传感器引起人们广泛关 往。赵常志【l 】、朱果逸【2 】对这一领域的研究发展作过介绍。 电化学发光传感器是通过化学修饰的方法将参与化学发光反应的试剂直接或 间接的固定在工作电极上而构建的一类实验装置泛称为电化学发光传感器或电致 化学发光传感器( e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c eo re l e e t r o g e n e r a t e dc h e m i l u m i n e s c e n c e s e b s o r ) 。由于电化学发光传感器既保留了电化学发光的优点又克服了在以往的电 化学发光分析中由于选择性不好且使用较复杂的光学系统和溶液型电化学发光试 剂，使电化学发光分析法的推广应用受到限制的不足，拓宽了电化学发光分析法 的应用面，实现仪器的小型化和增加方法的实用性，近几年来日益受到人们重视， 目前已成为国内外分析化学发展的热点之一。本文就电化学发光发展概况，电化 学发光传感器的响应机理，电化学发光传感器的固定化方法作一简要概述。 二、电化学发光发展概况 电化学发光或电致化学发光分析方法( e c l ，e l e c t r o e h e m i l u m i n e s c e n c eo r e l e c t r o g e n e r a t e dc h e m i l u m i n e s c e n c ea n a l y s i s ) ，是对电极施加一定的电压进行电化 学反应，用光电倍增管等普通光学手段测量发光光谱和强度从而对物质进行痕量 分析的一种方法【3 5 】。是化学发光方法与电化学方法相结合的产物。它既保留了 化学发光方法所具有的优点，同时还具有许多化学发光法无可比拟的优点，如电 发光反应过程控制性强、发光区域确定更有利于发光信号的检测而获得更高的灵 敏度、许多反应活性高但不稳定( 如自由基和反应中间体等) 的物质可以应用于 电化学发光分析之中，从而开拓出新的发光分析特性。在二十世纪的8 0 年代以后 该方法发展非常迅速，被认为是2 1 世纪分析化学最具有发展前景的方向之一。 电化学发光现象可以追溯到1 9 世纪，早在1 9 2 9 年，h a v e r y 在电解碱性鲁米 诺溶液时，成功地在施加较低电压( 2 s v ) 的情况下，发现了在阴阳两极上的发光 现象，从此揭开了电化学发光现象和研究的序幕【6 】。然而，在该现象发现后的三 十多年间，由于研究手段的缺陷，电化学发光的发展速度缓慢，在这一阶段 k u w a n a ，f a u l k n e r ，b a r d ，h e r c u l e s 等人做出了突出的贡献，他们研究了大量芳 香族化合物的电化学发光，并对其机理进行了深入的探讨 7 1 0 。 2 0 世纪6 0 年代，电子技术的迅速发展，为化学发光和电化学发光的研究提 供了有力的工具，人们开始有能力研究e c l 的反应机理等基础理论问题。1 9 6 3 年，k u w a n a 等人利用脉冲电压研究了p t 电极上鲁米诺电化学发光的动力学和发 光机制( 1 1 1 3 1 ，便入们对鲁米诺电化学发光反应的机理有了更深入的认识和了解。 与此同时，还发现了一些稠环芳香烃的电化学发光现象，对红莹烯，芘类化合物， 呋喃，吲哚类以及蒽和它的衍生物等的电化学发光体系机理的研究是当时的研究 热点之一。 2 0 世纪7 0 年代，随着研究手段的增多，电化学发光研究的范围也越来越广， 这时期电化学发光仪器和电极系统也有了很大的改进，多种脉冲信号以及旋转 环盘电极的使用【1 4 - 1 6 都使电化学发光机理研究更为简单。同时除了研究芳香族 化合物电化学发光机理外，还发现了许多电化学发光新体系 1 7 1 8 1 ，从而拓宽了 电化学发光的应用范围。 直到8 0 年代，才有人对电化学发光在有机物、无机物分析中的应用作了评述 1 9 - 2 0 ，电化学发光开始进入实际分析应用之中，如开展了膜修饰电极 2 h 、表 面活性剂对e c l 的影响1 2 2 及h p l c e c l 联用技术f 2 3 之4 】等研究工作。这一时期 b a r d ，i s m a i l 等人做出了突出的贡献。b a r d 在研究了大量的钌联毗啶类化合物的 电化学发光后提出了钌联毗啶作为免疫分析标记物的可能性，印度的i s m a i l 等人 则开辟了电生物发光( e l e e t r o b i o l u m i n e s e e n e e ) 的新领域 2 5 - 2 7 ，i k a r i y a m a 等人 【2 8 提出了均相电化学发光免疫分析法。8 0 年代末，有人提出电化学发光成像法 ( e c l i m a g i n g ) 的新概念，研究了非均相电极表面电化学活性物质的浓度分布情 况1 2 9 3 1 ，以及盘电极上非均匀性电流密度的分布特性 3 2 】，为用电化学发光方 法研究电化学反应机理提出了新的思路。 进入9 0 年代后，随着电化学发光仪器装置、电极材料的进一步发展以及与其 它技术的结合。电化学发光进入了实际应用阶段。光透电极( r 【d ) 的使甩及其与 光导纤维技术的结合，使电化学发光信号的检测更为简便 3 3 3 4 1 ，微电极及超微电 极的使用，使电化学发光分析法适用于生物活体分析d s l ；b a n da r r a y 电极、超声 技术开始应用于电化学发光分析研究之q 6 1 3 6 3 7 1 ，使电化学发光分析越来越进入 实际应用领域。电化学发光与其它技术和方法的结合更加拓宽了电化学发光分析 法的应用范围。以电化学发光分析法作为p c r 的检测分析方法已有报道【3 8 4 2 】， 而且电化学发光分析方法与p c r 技术结合，实现了一些病毒( 如h i v ) 的测定【4 3 】， 电化学发光分析法还被用作高效液相色谱的检测器 4 4 1 ，实现了电化学发光与分离 技术的联用，章竹君等首次将电化学发光与溶出伏安法结合，提出了电位溶出化 学发光分析( e l e c t r o c h e m i c a ls t r i p p i n gc h e m i l u m i n e s c e n c ea n a l y s i s ) 新方法【4 5 ，4 6 】 由于结合了化学发光法和电位溶出分析法二者的优点，无论灵敏度和选择性比两 种方法都有很大的提高，他们提出的电生试剂化学发光分析( c h e m i l u m i n e s c e n c e a n a l y s i sw i t he l e e b o g e n e r a t e dr e a g e n t s ) 已成功的用于过氧化氢、异烟肼、潘生丁、 l 一多巴胺、安乃近、肾上腺素等的测定，还提出了电化学在线调节能量转移化学发 光和以电化学氧化代替化学氧化进行能量转移型化学发光反应的科学研究新思 想，使得电化学发光的分析范围被拓宽。 经过半个多世纪的发展，电化学发光分析技术已经在微流控分析系统，微阵 列光化学传感器，电化学发光传感器，纳米粒子的性质表征和分析特性的开发以 及生物芯片分析等研究领域取得了定的进展。 国内自从张帆等对电化学发光做过介绍 4 7 】以来，安镜如 4 8 5 0 、王伦 5 l 】等 也曾作过评述。陈国南等 5 2 1 对金属配合物和原子簇的电化学发光及其应用作了评 述。王鹏等 5 3 5 4 对电化学发光免疫技术的研究进展作了综述，章竹君【5 5 】综述了 电位溶出电化学发光的进展，徐国宝等 5 6 t 对电化学发光的应用作了较全面的评 述。同时国内也展开了电化学发光方面的研究工作。已在许多方面如电化学发光 机理研究、电化学免疫分析和药物分析等方面取得了一定的进展，并被广泛用于 环境科学、生命科学、医学科学等研究领域。 目前，电化学发光分析正处在一个快速发展的阶段，与其他技术和各种方法 的结合将使电化学发光更具有活力和实用性。近年来电化学发光与化学修饰电极 技术结合而构建的电化学发光传感器是电化学发光分析中的研究热点，国内、外 一些专家和学者致力于这方面的研究，取得了一系列新的研究成果。 三、电化学发光传感器的响应机理 在电化学发光研究中，通过化学修饰的方法将参与化学发光反应的试剂直接 或间接的固定在电极上丽构建的一类实验装置泛称为电化学发光传感器或电致化 学发光传感器( e l e c t r o e h e m i l u m i n e s e e n c eo re l e e t r o g e n e m t e dc h e m i l u m i n e s c e n c e s e n s o r ) 。由于电化学发光传感器既保留了电化学发光的优点又克服了在电化学发 光分析中往往由于选择性不好且使用较复杂的光学系统和溶液型电化学发光试 剂，使电化学发光分析法的推广应用受到限制的不足，拓宽了电化学发光分析法 钓应用面，实现仪器的小型化和增加方法的实用性，近几年来日益受到人们重视。 电化学发光传感器一般由传感器探头、光纤、电解池、防光干扰的黑箱构成， 在探头中工作电极一般由铂、金等作为基体材料将各种电化学发光活性试剂固定 化在这些材料上制成不同用途和性能的工作电极。电化学发光传感器的响应机理 是电化学发光反应，电化学发光是通过电极对含有化学发光物质的某化学体系施 加一定的电化学信号( 包括电压或电流) ，以致产生某种新物质，该物质能与体系 3 中存在的化学物质反应或自己进行分解反应，反应不但提供足够的能量，而且还 能产生合适的发光体弗接受该反应的释放能量，形成激发态发光体，当激发态发 光体返回基态时便发出与该发光体性质相一致的发射光。据报道，能够进行电化 学发光的物质有很多，其中联吡啶钌( r u ( b p y ) 3 2 + ) 及其衍生物与鲁米诺( 1 u m i n 0 1 ) 在电化学发光传感器中应用最为广泛。 1 联毗啶钌电化学发光传感器的响应机理 电化学发光传感器的响应机理是电化学发光反应。近年来，联吡啶钉及其衍 生物的电化学发光作为一种灵敏度高，选择性好的分析方法 5 7 6 0 1 。已广泛应用 于草酸盐 6 q 、烷基胺1 6 2 、氨基酸 6 3 】、n a d h 6 4 - 6 5 、以及有机酸 6 6 1 的测定。 其中联吡啶钉( r u ( b p y ) 3 2 + ) 电化学发光体系倍受关注【6 7 】。它与三丙胺、草酸盐、 氨基酸的电化学发光机理如下： 图1 为r u ( b p y ) ，的化学结构式 1 1 r u ( b p y ) 3 a 体系发光机理 r u ( b p y ) 3 2 + t p a 体系发光机理被认为如下【6 8 】； r u ( b p y ) ；+ 一r u ( b p y ) + + e r u ( b p y ) s s + + t p a r u ( b p y ) + + t p a + t p a + t p a + + e t p a + 。_ + t p a + h 十 r u ( b p y ) s s + + t p a 一 r u c b w 强+ 】。 【r u ( b p y ) + 】一r u c o p y ) + + h v 首先是r u ( b p y ) 3 2 + 在电极上被氧化成r u ( b p y ) 3 ”，r u o a p y ) 3 3 + 进一步与分析物反 应产生中间态自由基离子，由于该自由基具有很强的还原性从而与r u o a p y ) 3 3 + 发生 进一步电子转移反应生成r u ( b p y ) 3 h ，r t l ( b p y ) 3 3 + - 与r u ( b p y ) 3 l + 再反应生成激发态的 r u ( b p y ) 3 2 ”，激发态的r ( b p y ) 3 2 + 返回基态时发出橙色光。这样就可以通过联吡啶 钌的e c l 测定t p a 的含量。r u ( b p y ) 3 2 + c 2 0 4 2 - 体系的e c l 机理【6 9 】和上述机理相 4 ，lr。，。j 似。 1 2 ，r u c o p y ) 3 “，氨基酸体系发光机理 联毗啶钌与氨基酸的电致化学发光反应如下： 玛c h r c o o + o h 幔n c h r c 0 0 。+ h 2 0( 1 ) r u ( b p y ) 3 ”一a u ( b p y ) l ”+ e ( 2 ) 珥n c h r c 0 0 。十r u ( b p y ) 】”一丑，n c h r c o o + 弛( b p y ) ，”( 3 ) i l z + n c h r c o o 。+ a u ( b p y ) 】3 + 一h n = c r c o o 。+ r u ( b p y ) ，”+ 2 h +( 4 ) r h ( b p y ) 3 ”一r n ( b p y ) ，“4 - h v( 5 ) h n = c r c o o 。+ h z o r c o c o o + n h 3( 6 ) 根据这一机理，如果把联吡啶钌固定化在工作电极上制备成电化学发光传感 器，在一定条件下就会对一定的氨基酸响应，以发光强度的大小可以定量测定分 析物中的氨基酸。 2 鲁米诺电化学发光传感器的响应机理 3 - 氨基邻苯二甲酰胺俗称鲁米诺( 1 u m i n 0 1 ) ，该体系具有发光效率高、试剂稳 定、价格便宜、毒性小、反应在水相中进行等优点而受到人们的广泛关注。鲁米 诺e c l 反应机理主要有以下两种： 2 1 1 u m i n o i - h 2 0 2 体系电化学发光反应机理 s a k u r a 等 7 0 】对鲁米诺与过氧化氢在铂电极表面的电化学发光机理进行了较 为仔细的研究，他们的研究指出：鲁米诺的电氧化产物( 一种自由基) 与过氧化 氢在相同电解电位下的氧化产物超氧阴离子自由基之间的化学发光反应是该电化 学发光反应的关键步骤，其发光机理见下图。 s 2 2 1 u m i n o i 与溶解氧的电化学发光反应机理 有关鲁米诺与溶解氧的电化学发光反应机理研究一直是电化学发光工作者关 心、研究的重点问题之一，这主要是该电化学发光反应所产生的发光信号是鲁米 诺电化学发光体系在水溶液中进行时背景发光信号的主要来源，也是影响水溶液 中鲁米诺电化学发光体系分析特性的关键。h a a p a k k a 等的研究结论如下 7 卜7 2 ： “”鬯”“ 。- 三+ 6 o ：， 。d 日 0 7 - 簌l i 州+ 2 h 。 ，g 四、电化学发光传摩器的同定化方法 电化学发光传感器的固定化是指将各种电化学发光活性分子固定在工作电极 上，并用各种方法加以修饰。提高它们的选择性和实用性。固定化技术的发展是 提高传感器性能的关键因素之一，也是世界各国竟相研究和探索的目标。经过几 十年的不断研究、探索，目前已经建立了各种不同的固定化方法，归纳起来主要 有四类：溶胶一凝胶( s o l g e l ) 法，n a t i o n 膜法，l - b ( l a n g m u i r - b l o d g e t t ) 膜法和自 组装( s a ) 膜法。 1 溶胶凝胶法 溶胶- 凝胶( s o l - g e l ) 法是将金属醇盐( 如正硅酸乙酯t e o s ) 等原料配制成均 匀的胶悬体，在饱和条件下经水解缩聚生成溶胶( s 0 1 ) ，然后经过蒸发干燥再转变 为凝胶( g e l ) 将被固定物包埋在溶胶凝胶三维网络中。近年来，1 g e l 技术已在薄 膜、复合功能材料、纤维、高溶点玻璃及陶瓷材料的制备方面都已展现出了广阔 的应用前景。由于溶胶凝胶( s 0 1 g e l ) 材料具有化学惰性、物理刚性、高热稳定性及 轻微的溶胀性，目前溶胶凝胶( s 0 1 g e l ) 法已发展成为一种非常有前途的构建电 化学发光传感器的固定化方法。 1 1 溶胶凝胶体的制各 溶胶凝胶的制备方法有 7 3 1 ： 6 r 纷 一专 晦鳟鳟 a 胶体溶液的凝胶化： b 醇盐或硝酸盐前驱体的水解聚合，继之超临界干燥凝胶； c 醇盐前驱体的水解聚合，再在适宜环境下干燥、老化。 水解和缩合溶胶凝胶过程由三步反应组成( 如图2 所示) 。1 金属醇盐或半 金属醇盐前驱体先发生永解反应，形成羟基化的产物和相应的醇( 常用的前驱体 有低分子匿的硅酸甲酯( t m o s ) 、硅酸乙酯( t e o s ) 、钛酸丁酯等) ：2 未羟基化 的烷氧基与羟基或两羟基间发生缩合形成胶体状的混合物，该状态下的溶液被称 为溶胶。3 水解和缩合过程常是同时进行的，最后胶粒间发生聚合、交联，使溶 液粘度逐渐增大，将其它生物组分捕获于干凝胶内。 水卿m r h4 - x n 2 0 + m f o h h + x r o h m 譬s i t i 。 】1 3 , z r , c c s n r o h + 1 _ r r _ r 一邺 l i l i i j 浆台卜甲一卜i i l 叫一卜1 r p d hiil i 图2 溶胶凝胶过程示意图 1 2 溶胶凝胶固定化方法的特点 溶胶凝胶法有一些明显的优点：( 1 ) 光透性强，本身的荧光低，利于吸光和 荧光测量；( 2 ) 溶胶凝胶制备工艺简单；( 3 ) 化学、光学、热力学及机械稳定性 好；( 4 ) 可与多种有机、无机试剂相容；( 5 ) 溶胶一凝胶的物理化学性质如孔径、 黏度、成型形状、化学组成、导电性、亲水性以及机械强度等易于控制；( 6 ) 可 适用于任何类生物组分的固定化，可以较好的保持蛋白质表面微观结构的整体性 和方向均一性，从而对生物组分的话性和稳定性的损伤较小。这些特点已使溶胶一 凝胶技术成为目前应用最广泛的固定化方法之一，己用到几乎所有类型的光学生 物传感器中，包括吸收光、荧光、室温磷光及化学发光等体系。 1 3 溶胶凝胶固定化方法在电化学发光传感器中的应用 溶胶凝胶( s o l - g e t ) 法以其特有的优势日益受到关注，应用也日益广泛深入，目 前溶胶凝胶( s o l g e l ) 技术己广泛应用于电化学发光传感器的设计。d v o r a k 等【7 4 】首 次采用溶胶一凝胶技术将联吡啶钌固定在s i 0 2 凝胶膜内，研究了联吡啶钌的电化学 和光化学活性，但并没有进行联毗啶钉的电化学发光研究。z h a o 等【7 5 】首先用三联 吣 一 mf o一 ；ml 一 | t l m 1 俨 一 lmf 一 裔鳊 吡啶合钌偶联高分子化合物壳聚糖，然后将这一含有电化学发光活性试剂的高分子 化合物涂在铂和玻璃碳电极上，最后再以溶胶凝胶法( s 0 1 g e lm e t h o d ) 覆硅胶膜于 电化学发光高分子活性膜上，制备成电化学发光( e c l ) 传感器( 图3 ) ，该传感器可 用于生化样品中草酸的高选择性测定，线性范围为0 1 1 0 m m o l l ，检出限为 o 0 2 m m o l l 。如果在溶胶一凝胶法制备硅胶膜的过程中根据需要加入各种功能性分 子，还能改变和提高传感器的分子识别能力 7 6 1 。此外，z h a o 等 7 7 1 还发现利用溶 胶一凝胶法覆膜不仅能保护电化学发光试剂的活性，而且还会延长工作电极的使用寿 命，他们又基c h i t o s a n 与s o l - - g e l 复合物为固定化材料，固定r u ( b p y ) 3 2 + 于电极表面， 明显的提高了传感器的寿命，但灵敏度却因s o l - - g e l 膜的存在而受到影响。董绍俊 等提出了基于s o l - - g e l 与聚阴离子电解质的复合膜修饰电极方法来解决这一问题， 也取得了很好的分析特性 7 s 1 。此外，董绍俊等 7 9 1 提出了将r u ( b p y ) 3 2 + 固定在疏水 性强的聚4 苯基磺酸钠，s i 0 2 复合材料上的新方法，提高了电化学发光传感器的稳定 性。k h i i t l t i o v 等【8 0 】在凝胶的形成过程中掺进具有离子交换功能的聚合物n a f i o n 制 成n a t i o n 硅复合材料并用于制备联吡啶钌电化学发光( e c l ) 传感器，与单纯的 n a t i o n 膜传感器相比。该传感器的稳定性和发光强度都有所提高，对三丙胺的测定 范围为1 0um 0 1 i , - - l m m o y l ，检出限为0 1h m o l l 。董绍俊等【8 1 】还将r u ( b p y ) 3 2 + 固 定于e a s t m a n - a q 5 5 d ，硅复合膜中制成了联吡啶钌电化学发光传感器，该传感器有很 高的选择性和稳定性，已成功的用于草酸盐、三丙胺( t p a ) 、氯丙嗪( c p z ) 的测定。 c o l l i n s o n 8 2 等将联毗啶钌、还原剂超微电极一起包埋在凝胶载体中组成全固态结构 的电化学发光系统，为在束缚环境中分子的扩散行为和评价被包埋试剂与硅基体之 间的表面相互作用提供了新的研究手段。朱国逸 8 3 1 等利用溶胶凝胶技术首先提出 s o l - g e l 碳糊电极，将修饰有g o d 的石墨粉固定在硅酸盐网状结构中，结合 l u m i n o l - h 2 0 2 电化学发光( e c l ) 体系构建了葡萄糖光纤电化学发光生物传感器。 此外，他们【8 4 】还将生物分子物质g o d 和s o l - g e l 溶液均匀混合后直接滴涂到玻碳电 极表面，以l u m i n o l 电化学发光和f i a 技术结合制备了葡萄糖光纤电化学发光生物 传感器。其后，h u a n g 等 8 5 1 将g o x 固定于s o l g e l 中，结合g o x 催化葡萄糖产生的 h 2 0 2 抑制r u c a p y ) s ”- t p a 体系的电化学发光制成了高选择性的葡萄糖电化学发光传 感器，该传感器用于血清和饮料中葡萄糖分析。取得满意结果。l e e 等【8 6 】研究了 r u ( b p y ) 3 ”被固定在t i o g n a t i o n 凝胶膜中的电化学和电化学发光行为。 3 01 1 1 1 i 1 ， 4 图3 电化学发光传感器，4 固化层，5 硅胶层，6 电极基板 2 n a f i o n 膜法 n a t i o n 是一种含电离基团的全氟化碳聚合物，是常用的制备电极薄膜的高分 子材料，具有优良的化学稳定性、机械强度和离子传输功能，对大多数有机金属 阳离子有很高的交换系数，能抗生物毒化，在电分析化学中应用较为广泛。b a r d 等 首次将n a t i o n 修饰于石墨电极表面，并基于n a t i o n 与r u ( b p y b ”之间的静电作用 将发光试剂固定修饰于电极表面，研究了固定化发光试剂的电化学发光行为【8 7 】。 研究结果指出：当向电极施加正负阶跃电解信号时，修饰电极在纯电解液中( 即 没有复合电化学发光反应试剂) 能给出强的电化学发光信号，这说明修饰电极表 面的r u c o p y ) 3 2 + 能在激发电信号的作用下产生r u ( b p y ) 3 ”和r u ( b p y ) 3 i + 且两者能 迸一步在膜中扩散反应而产生化学发光。在b a r d 等人修饰发光反应试剂方法的基 础上，n i e r n a n 等人 8 8 】较详细的研究了r u ( b p y ) 3 2 + n a t i o n 膜电化学发光传感器的 分析特性。研究结果指出；固定化的r u c o p y ) 3 ”能在电极表面快速的进行电化学发 光循环使用，不但节省了使用纯试剂进行流动注射电化学发光分析时试剂的消耗， 而且还给分析操作过程带来了极大的方便，该传感器测定了流动体系中草酸、烷 基胺和n a d h ，线性范围达4 个数量级，并分另q 研究了p h 值、离子强度等对电化 学发光强度的影响。e g a s l 晒r a 等【8 9 】将r u c o p y ) 3 2 + n a i l o n 膜修饰铂电极置于光导纤 维的对面，以光纤作为收集和传输光信号的器件，因此可用于远距离测定。由于 该传感器体积较小，可以进行活体分析。他们【9 0 】还利用c 0 2 传感器对草酸的选择 性，与r u ( b p y ) 3 2 + n a t i o n 膜结合用于草酸测定。与直接将r u c o p y ) 3 2 + 固定在电极上 构建的电化学发光传感器相比，该传感器的选择性有了很大的提高，可用于蔬菜 和尿液中草酸的测定。m a r t i n 等【9 l 】将葡萄糖脱氢酶同定在控制多孔玻璃珠 ( c o n t r o l l e dp o r o u sg l a s sb e a d s c p g ) 上，( 依据r u ( b p y ) 3 ”能与铺酶( n a d h ) 反 应产生化学发光，许多能与n a d + 反应生成n a d h 的物质都能以此反应进行定量 测定) ，采用r u c o p y h 2 + ，n a t i o n 膜电化学发光传感器测定了葡萄糖。此外，他 f 1 1 9 2 1 9 n j 时 ，* u - 、_ 还采用e a s t m a n - a q 聚合物将葡萄糖脱氢酶、乳酸脱氢酶等固定在铂电极表面，然 后在聚合物，酶膜上覆盖一层r u ( b p y ) 3 z + ，n a t i o n 膜，制各了电化学发光生物传感器， 并已成功的用于葡萄糖、乳酸等的测定。但由于n a f i o l l 膜对分析物的传质速度慢 且膜材料本身所提供的一些疏水微环境对发光反应的负面影响，使这一固定化方 法在传感器中的应用受到一定的限制。 3 l b 膜法 l b ( l a n g m u i r - b l o d g e t t ) 膜是将具有脂肪疏水端和亲水基团的双亲分子溶 于挥发