（分析化学专业论文）无胶筛分毛细管电泳相互作用分析及毛细管电泳手性拆分.pdf

重庆人学硕士学位论文 中文摘要 摘要 本论文主要由两个部分组成，第一部分是无胶筛分毛细管电泳相互作用分析。 针对某些药物的电泳淌度与蛋白相近，迁移时间窗口很小的问题。本文利用线性 高分子聚合物对大分子物质的筛分作用，通过改变大分子蛋白的电泳淌度，扩大 迁移时间窗口，将无胶筛分毛细管电泳成功地运用于相互作用分析中。建立了测 定具有相似淌度的药物与蛋白之间结合常数的模型，进一步发展了毛细管电泳相 互作用分析方法。 1 、淌度比与溶液的粘度无关，将淌度比的方法用于相互作用分析的数学计算 模型中，有效扣除了由于筛分介质的加入带来的粘度变化的影响。 2 、以线性聚丙烯酰胺为筛分介质，采用无胶筛分毛细管电泳测定了扑尔敏与 牛血清白蛋白( b s a ) 之间的结合常数，并与常规区带电泳的实验结果进行对比， 两种方法的结果基本一致。 3 、采用葡聚糖为筛分介质，分别测定了吲哚美辛和伊贝沙坦( 均与b s a 淌 度相近) 与b s a 之间相互作用的结合常数。 论文的第二部分是毛细管电泳手性拆分，以b 一环糊精作为手性选择剂，研究 了手性药物扑尔敏和西布曲明的毛细管电泳分析方法。 l 、测定了不同p h 条件下扑尔敏对映体与b 环糊精相互作用的结合常数，讨 论了结合常数与分离选择性的关系。针对理论计算出的对映体淌度差达到最大时 所需的p 环糊精最佳理论浓度值与达到最大分离度所需的b 环糊精浓度值之间存 在一定偏差的现象，结合分离度的定义，推导了分离度与对映体淌度之间的关系。 2 、首次采用毛细管电泳方法，以b 环糊精为拆分剂对西布曲明对映体成功地 进行了手性分离。系统讨论了各影响因素( 包括拆分剂种类及浓度、缓冲液p h 及 组成、毛细管内径) 对分离度的影响，并进行了实验条件的优化。在优化的条件 下，考察了西布曲明消旋体及各对映体的线性范围和检测限，建立起西布曲明及 各对映体定量分析的毛细管电泳方法。测定了手性环境中西布曲明对映体与b 环 糊精相互作用的结合常数，为进一步开展西布曲明对映体药理药效的研究提供了 一种有效可行的分析方法。 关键词：无胶筛分电泳，相互作用分析，结合常数，毛细管电泳，手性拆分 重庆大学硕士学位论文 英文摘要 a b s t r a c t t h e p a p e r i sm a d e u po f t w op a r t s ，t h ef i r s tp a r ti sn o ng e lc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s i n t e r a c t i o n a n a l y s i s s i n c em i g r a t i o n t i m ew i n d o wi st o o s m a l l ，c a p i l l a r y z o n e e l e c t r o p h o r e s i sp e a k s h i f tm o d e lc a n te x a c t l ym e a s u r et h ei n t e r a c t i o nb e t w e e n d r u ga n d p r o t e i n w h i c hh a v es i m i l a rm o b i l i t i e s t h em e c h a n i s mo fm o l e c u l a r s i e v i n g o f e n t a n g l e dp o l y m e r s o l u t i o ni nn o n g e lc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sm g c e ) w a s c i t e di nt h e p a p e r i no r d e rt oe x p a n dm i g r a t i o nt i m ew i n d o w , e n t a n g l e dp o l y m e rw a su s e dt o c h a n g et h em o b i l i t yo fp r o t e i ni nt h eb u f f e rs o l u t i o n t h em o d e l o fi n t e r a c t i o na n a l y s i s b e t w e e np r o t e i na n dl i g a n dp o s s i n gs i m i l a rm o b i l i t i e sw a se s t a b l i s h e db yn g c e t h i s m e t h o df l l r t h e rd e v e l o p e dt h ea n a l y t i c a lm e t h o d so f c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i si n t e r a c t i o n a n a l y s i s 1 s i n c em o b i l i t yr a t i oi s i n d e p e n d e n to fv i s c o s i t i e s i tw a si n t r o d u c e d t ot h e c a l c u l a t i o nm o d e lo f c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i si n t e r a c t i o na n a l y s i s ，i no r d e r t oe f f i c i e n t l y e l i m i n a t et h ee f f e c to f v i s c o s i t i e so f e n t a n g l e d p o l y m e r s o l u t i o n 2 l i n e rp o l y a c r y l a m i d ew a su s e da ss i e v i n gp o l y m e rt od e t e r m i n et h eb i n d i n g c o n s t a n tb e t w e e nc h l o r p h e n i r a m i n ea n db o v i n es e r u r ua l b u m i n ( b s a ) i nc o n t r a s tw i t h n g c e ，c a p i l l a r yz o n ee l e c t r o 。p h o r e s i s w a sa l s ou s e dt om e a s u r eb i n d i n gc o n s t a n t b e t w e e n c m o r p h e n i r a m i n e a n db s a t h er e s u l t so ft w om e t h o d sw e r ea l m o s t c o n s i s t e n t 3 d e x t r a nw a su s e da s s i e v i n gp o l y m e rt o d e t e r m i n et h e b i n d i n gc o n s t a n t s b e t w e e ni n d o m e t h a e i n ，a n db s a ，i r b e s a r t a na n db s a s e p a r a t e l y , w h i c hw e r es i m i l a r w i t hm o b i l i t i e s t h es e c o n dp a r ti se h i r a ls e p a r a t i o no fc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s t h ee n a n t i o m e r i c s e p a r a t i o n s o fc h l o r p h e n i r a m i n ea n ds i b u t r a m i n eb yc a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i su s i n g p c y c l o d e x t r i n ( p c d ) a st h ee h i r a ls e l e c t o rw e r es t u d i e d 1 b i n d i n gc o n s t a n t sb e t w e e n t h ee n a n f i o m e r so f c h l o r p h e n i r a m i n ea n dp c dw e r e s t u d i e da td i f f e r e n tp h t h er e l a t i o n s h i po fr e s o l u t i o na n db i n d i n gc o n s t a n t sw a s d i s c u s s e d s i n c et h ec o n c e n t r a t i o no fb - c da tw h i c ht h ed i s c r i m i n a t i o no fe n a n t i o m e r i c m o b i l i t i e sw a sm a x i m a lw a si n c o n s i s t e n tw i t ht h ec o n c e n t r a t i o no f 1 3 - c da tw h i c ht h e r e s o l u t i o no ft w oe n a n t i o m e r sw a so p t i m a l ，t h ep a p e rd i s c o v e r e dt h er e l a t i o n s h i po f r e s o l u t i o na n dt h e m o b i l i t yo f t w o e n a n t i o m e r s 2 t h ee n a n t i o m e r i cs e p a r a t i o no fs i b u t r a m i n eb yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i su s i n g i i 重庆大学硕：学位论文英文摘要 b c d f i et h ec h i r a ls e l e c t o rw a ss m d i e d t h ee f f e c t s o n e n a n t i o s e p a r a t i o nw e r e i n v e s t i g a t e d a n dt h et w oe n a n t i o m e r sc o u l db e s e p a r a t e dw e l l u n d e rt h eo p t i m a l o p e r a t i o nc o n d i t i o n s ，t h e l i n e a r c o n c e n t r a t i o n r e g i o n a n dt h el o w e s t d e t e c t i v e c o n c e n t r a t i o no fs i b u t r a m i n ew e r es m d i e d t h e q u a n t i t a t i v ea n a l y t i c a lm e t h o do f s i b u t r a m i n ea n di t se n a n t i o m e r sw e r eb es e tu p u n d e r o p e r a t i o nc o n d i t i o n s ，t h eb i n d i n g c o n s t a n t so f t w oe n a n t i o m e r sa n db - c dw e r es t u d i e d k e y w o r d s ：n o ng e lc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，i n t e r a c t i o n a n a l y s i s ，b i n d i n gc o n s t a n t ， c a p i l l a r , e l e c t r o p h o r e s i s ，c h i r a ls e p a r a t i o n i i i 重庆大学硕士学位论文1 引言 1引言 1 1 相互作用分析 自然界中各种分子间的相互作用广泛存在，如蛋白与药物、蛋白与蛋白、酶 与底物、抗原与抗体、手性分子与手性选择剂等。分子生物活性的多样性是由于 它在不同环境下与其它分子的作用形式和作用程度不同所导致的。因此研究分子 间的相互作用对于以生命科学和环境科学为代表的现代前沿科学具有重要意义。 近年来，相互作用研究的领域不仅仅局限于化学领域，而是向其他领域不断 扩大，包括生命科学、环境化学、分子生物学、超分子化学、配位化学等前沿领 域【”。这里的“相互作用”是指相当于分子层次的物质间各种力的相互关系。按照 物质与物质间的作用方式，相互作用可以归纳为共价作用、非共价作用和剪切作 用。其中，非共价作用又可以分为：静电结合、氢键作用、范德华力、疏水作用、 离子键作用等【2 j 。在常用的实验方法中，相互作用的一方视为受体，而另一方被 称成为配体。相互作用分析( i n t e r a c t i o na n a l y s i s ，i a ) 则是获得受体与配体间相互 作用前后化学的、物理化学的、生物学的、以及分子生物学性质的变化信息的方 法，是表征与测量受、配体相互影响的一种方法。受、配体之间的相互作用有多 种表达方式，包括作用方式、结合的配比、结合常数、结合位点及自由能变等参 数，其中结合常数是表征相互作用强弱最重要的参数之一，它可以作为很多方面 的评价指数，有重要而现实的意义【3 】。 相互作用分析在国内外都是较为热门的研究课题，所采用的研究方法较多， 仪器分析方法为其中热点，此外还有热力学、分子力学、量子化学方法。不但一 些经典的仪器分析方法如电化学法 4 1 、平衡透析法【5 l 、各种光谱法 6 】、量热法【7 】、 n m r 法【g 】、高效液相色谱法【9 】越来越多地应用于相互作用的研究，而且一些比较 新的分析方法也开始应用于相互作用研究如毛细管电泳法【”12 1 、表面等离子体基 元共振法【l3 1 、原子力显微镜法【1 4 1 等。 1 2 毛细管电泳相互作用分析 毛细管电泳作为种高效的分离分析手段，被应用于相互作用分析的研究中， 称为毛细管电泳相互作用分析( c e 认) 。c e i a 将毛细管电泳作为淌度测量的精密 仪器，基于游离的受体与配体的电泳淌度的不同，以及受体或配体作用前后电泳 淌度的变化，从而获得热力学和动力学的参数。利用毛细管电泳研究相互作用的 方法很多，如h u m m e l d r e y e r 法、空位峰法、配体分离法、前沿分析法和峰漂移 方法等。其中应用比较多的是峰漂移法。夏之宁等f 1 5 1 用峰漂移法评价重金属离子 重庆大学硕士学位论文1 引言 与配体的相互作用，在对无紫外吸收的金属和配体的测量时，采用了间接紫外检 测。另外，他没有采用以往以配体的总浓度来代替游离配体浓度的做法，通过精 确求解得出配体在缓冲液中的游离浓度。 c e i a 除了各种方法可以运用，各种分离模式也能够运用在相互作用的测定 中。项顺峰等【“，”惜鉴胶束电动毛细管色谱分离中性溶质分子的原理，在中性主 体与中性客体相互作用体系中加入阴离子表面活性剂分子胶束作为荷电竞争配 体，建立了中性超分子间相互作用的模型。v a d i m 等【l8 】为了避免蛋白质在毛细管 壁上的吸附，采用峰漂移方法与胶束电动毛细管色谱操作模式相结合，通过研究 生物素结合蛋白a c t i n a v i d i n 与生物素标记寡核苷酸之间的结合能力，以此建立了 检测a c t i n a v i d i n 的方法。 1 3 毛细管电泳研究药物与蛋白之间的相互作用 随着现代生物学和分子生物学的发展，药物分子与蛋白之间的相互作用越来 越引起人们的关注。药物分子与蛋白质之间的相互作用研究内容主要包括：药物 蛋白质结合常数、结合位点的数目和结合位点的种类等f l ”。其中，结合常数是最 重要也是研究得最多的物理参数。蛋白质是生物体内具有重要生理功能的生物大 分子，血清白蛋白是血浆中最丰富的蛋白质，可以同许多内源性和外源性的化合 物结合起到存储与转运作用。药物在体内的分布直接关系到药物的选择性、药效、 毒性、消除速度以及作用持续时间的长短。影响药物在体内分布的因素很多，其 中药物与血清蛋白的结合是一个重要因素。药物在吸收后会不同程度地与血清蛋 白结合。从某种意义讲，药物与血清白蛋白的结合对血药浓度起缓冲作用。因此， 药物与血清白蛋白之间的结合常数，对于药物的吸收、转运、分布和维持血药浓 度具有重要意义【2 。通过研究血清自蛋白与药物分子的相互作用可以了解药物在 体内的作用机制，为药理毒理研究和药代动力学研究提供有效的参考依据。由于 牛血清白蛋白( b o v i n es e r u ma l b u m i n , b s a ) 和人血清白蛋白( h u m a ns e r u m a l b u m i n ，h s a ) 的结构和性质十分相似，而b s a 更价廉易得，故在研究中常使用 b s a 代替h s a 。 毛细管电泳作为研究药物与蛋白结合的手段之一，与其它分析方法相比，具 有如下的优点：高效、快速、易自动化；分离模式多变；耗样量少，对样品纯度 要求不高；可以在模拟生物体内的水溶液中进行，更接近体内的结合行为、能够 同时测定几个药物与蛋白之间的相互作用研究等，因而备受研究者的青睐。 1 4 无胶筛分毛细管电泳 1 4 1 发展概况 毛细管电泳( c e ) 有多种操作模式，每一种模式反映了不同的分离机制。毛 2 重庆大学硕士学位论文1 引言 细管凝胶电泳( c g e ) 是几种操作模式之一，它综合了c e 和平板凝胶电泳的特 点。毛细管凝胶电泳( c a p i l l a r y g e l e l e c t r o p h o r e s i s ，c g e ) 和无胶筛分毛细管电泳 ( n o n eg e lc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，n g c e ) 可以归为毛细管筛分电泳( c a p i l l a r y s i e v i n ge l e c t r o p h o r e s i s ，c s e ) ，均以样品分子大小为分离基础。其中，c g e 发展 较早。早在1 9 8 3 年，h j e r t e n 2 1 1 首次将传统凝胶电泳技术中的聚丙烯酰胺凝胶装 入内径为1 5 0i x r n 的玻璃毛细管中，对多种蛋白质进行分离，取得了很好的分离效 果。c g e 的分离效率很高，塔板数可以达到1 0 7 m 。但凝胶毛细管柱制备困难、 寿命短、进样端易堵、重现性差、柱子易被污染，难以清洗，且凝胶在聚合过程 中易出现气泡。此外，毛细管凝胶柱在电泳过程中也可能产生气泡，因而限制了 高电压的使用。鉴于凝胶毛细管柱的种种缺陷，许多人开始探索使用低交联或无 交联的聚丙烯酰胺柱，或者采用其它的线性高分子水溶液来代替凝胶柱的使用。 朱明德【2 2 提出在缓冲液中加入纤维素衍生物，以甲基纤维素为筛分介质对d n a 片段做了很好的分离，在蛋白质分离和分子量的测定等方面也取得了初步的结果， 由此拉开了n g c e 的序幕。线性高分子水溶液的采用避免了凝胶柱繁琐的制柱过 程，操作简便，且可选择的线性高分子种类较多因而n g c e 近年来运用十分广泛。 1 1 4 _ 2 无胶筛分毛细管电泳的特点 无胶筛分的基本设想是采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联的聚丙 烯酰胺凝胶。这种线性聚合物溶液仍然具有按分子量的大小分离组分的分子筛作 用，只是不在柱内作交联反应，避免了气泡的形成，比凝胶柱便宜、制作简单。 采用无胶筛分介质的突出优点是 2 3 , 2 4 ：潜在的水溶性高分子很多，具有广阔 的发展余地；筛分介质可以随时更换；每次电泳后可将筛分介质从毛细管内排出， 表1 1 无胶筛分毛细管电泳与平板电泳及毛细管凝胶电泳比较 t a bl 1 c o m p a r i s o n s b e t w e e n n g c e ，p a g ea n d c g e 3 重庆大学硕士学位论文1 引言 重新装柱，增加了重现性，且样品成分不会滞留于柱内污染分离体系。表1 1 将 n g c e 与传统的平板电泳和c g e 进行了比较。由此可以看出，无胶筛分毛细管电 泳的分离效率一般比c g e 差，但其重现性优于一般的凝胶电泳。所以说无胶筛分 电泳是以分离效率为代价来代替繁琐的制柱过程。 1 4 3 无胶筛分毛细管电泳中溶质的迁移模型陋2 7 】 安格斯通模型( o g s t o n m o d e l ) 该模型假设筛分介质是由相互连接的无规则的网络组成，它的平均孔径为f 。 溶质的迁移就像一个半径为岛的刚性球形粒子，匙 f 时，这个模型就不适用了。 当r 。 r 时，有： l g m = 一k r c + l g z o( 1 3 ) 其中，。，是筛分介质的浓度为c 时蛋白的相对淌度，。为自由溶液中的相 对淌度，足r 为阻滞系数( r e t a r d a t i o nc o e f f i c i e n t ) ，它与筛分介质的交联度及蛋白 4 重庆人学硕士学位论文 1 引言 质的形状和大小有关。上式为蛋白质迁移方程，也称为f e r g u s o n 方程，它表明蛋 白质的淌度与筛分介质浓度呈线性关系。 爬行模型( r e p t a t i o n m o d e l ) 安格斯通模型假设溶质分子为一不可变形的球形粒子，然而像d n a 这样有 弹性的大分子当当r f 仍然继续迁移，这只能由第二种迁移模型来解释。假设网 络用固定的障碍0 1 ，0 2 ，来描述，溶质分子是以一个从头道尾解开的线圈， 像线形链条在给定网络中运动，不能进入这些障碍中，但可以象蛇一样在其间穿 行，称为“爬行”。迁移分子被假定是在一个想象的管道里，在单位时间里，管道 的一部分迷失在尾端而新的一部分又在头部被创造。在零电场下的极限情况下有： “；!( 1 4 ) n 1 3 为分析物的重复单元，上式表示在低电场强度下，溶质的电泳淌度与质量成 反比。 图1 2 爬行模型 f i g1 2t h e i l l u s t r a t i o no f r e p t a t i o nm o d e l 偏倚的爬行模型( b i a s e dr e p t a f i o nm o d e l ) 安格斯通模型和爬行模型都没有考虑电场的影响。针对电场强度，偏倚的爬 行模型对爬行模型进行了改进。假设在强电场作用下，溶质被拉伸，电场越强， 溶质被拉伸的越长。在极限情况下溶质成为棒状，此时： ；足( 三+ 卢：) ( 1 5 ) 胛 k 为常数，厂是f 、溶质电荷和稳定性的函数。由此可见，当电场强度和溶质 分子变大时，对分子大小的依赖关系减弱。因此分子量很大的分子也能分离。 1 4 4 无胶筛分毛细管电泳的筛分介质 线性聚丙烯酰胺( 1 i n e rp o l y a c r y l a m i d e ，l p a ) 聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺( a c r y l a m i d e ，a c t ) 单体与交联剂二甲叉双丙烯 酰胺( n ，n - m e t h y l e n e b i s a c r y l a m i d e ，b i s ) 聚合而成。聚合反应是在一些能提供游离 5 重庆大学硕士学位论文 1 引言 基的催化氧化还原系统中完成的，这种体系主要有两种：过硫酸铵( a p s ) 一四甲基 7 , _ - - 胺( t e m e d ) 化学聚合系统和核黄素( r i b o f l a v i n ) t e m e d 光聚合系统。其中前 者是通过t e m e d 的氨基催化a p s ，使其形成游离基氧以激活聚合单体。 聚丙烯酰胺在一定范围内透明，有弹性，孑l 径较小，具有明显的分子筛效应， 能使较小的蛋白按分子量的大小得到分离。聚丙烯酰胺是一类电中性物质，易成 孔聚合，其孔径一般在3 3 0n _ r n 。孔径的大小一般由单体和交联共聚单体的浓度 和聚合程度决定，单体和交联剂的浓度分别用r 和c 表示： r ：a c r ( g ) + b i s ( g ) 1 0 0 矿( m ) c ： 丝熊 。1 0 0 a c r ( g ) + b i s ( g ) ( 1 6 ) ( 1 7 ) 式中：噶冲溶液的体积；t _ 一两个单体的总百分浓度即凝胶浓度；c 一交联度 增加交联度或降低丙烯酰胺的量都能加大孔径；反之，减少交联剂的量或增 加丙烯酰胺的量均能使孔径变小。因此，可以通过控制几c 的大小，改变凝胶 孔径的大小，从而对被分离组分起到分子筛的作用。 凝胶柱的分辨率极高，最高柱效可以达到1 0 7 m 。但凝胶柱在制各和使用的 过程中存在一些问题：1 ) 由于凝胶浓度大，在制柱过程中丙烯酰胺聚合时体积发 生收缩，或者在使用过程中高电压的使用常常产生一些气泡。气泡会中断电路， 影响凝胶柱的寿命。2 ) 由于气泡的形成，导致制备柱子的重复性低。3 ) 这种柱 子只能用电动力进样，用压力进样会破坏柱子中凝胶的状态。4 ) 毛细管的进样端 容易被堵塞，管端的凝胶容易变干折裂，因此需要定期修剪毛细管。 为了克服上述问题，制备无气泡、寿命长的凝胶柱，人们尝试采用不加入交 联剂的聚丙烯酰胺作为筛分介质。非交联聚合的线性聚丙烯酰胺( l p a ) 最初是 由h j e r t e n 2 s 】引入的，即是无交联剂b i s 存在下聚合。聚合时体积收缩小，既可以 保证凝胶的机械强度，又避免气泡的产生，延长了管子的寿命。张振中【2 9 】等采用 浓度为4 的短链l p a 分离了2 8 个d n a 片段。短链l p a 的特性粘数和分子量均 比长链聚丙烯酰胺的小，当浓度在5 以下时，可以自动填充到毛细管内，解决了 聚丙烯酰胺胶粘度大难以填充毛细管的问题。 纤维素衍生物( c e l l u l o s ed e r i v a t i v e s ) 纤维素分子是一种以b 1 ，4 葡萄糖苷为基本结构单元的线性大分子。每一个葡 萄糖基有三个可取代羟基，这些羟基所形成的氢键使纤维素分子间的相互作用力 相当大而不能溶于水。当其它基团通过化学反应取代羟基后，可以得到一系列的 纤维素衍生物。这些衍生物是分子量上万的高分子聚合物，具有可溶性，化学性 质稳定，其主链结构在苛刻的条件下才发生断裂，它的水溶性与取代基的种类， 分子量及取代度有关。取代基中羟基越多，水溶性越好。 6 重庆人学硕士学位论文 1 引言 1 ) 甲基纤维素( m e t h y lc e l l u l o s e ，m c ) m c 是纤维素的甲基醚，有良好的水溶性，在冷水中溶胀并溶解成粘度高、 透明度好的溶液。当加热其溶液至沸腾时则产生沉淀，但冷却后能重新溶解成为 透明胶体溶液。m i c h a e l 等 30 l 以o 0 1 的甲基纤维素溶液作为筛分介质，采用脉冲 场毛细管电泳分离了7 5 2 3 0 0 0 个碱基对的核酸片段。其中l k b d n a 和 x d n a h i n d i i i 片段达到了基线分离。 2 ) 羟乙基纤维素( h y d r o x y e t h y lc e l l u l o s e ，h e c ) h e c 是用羟乙基h o ( c h 2 ) 2 取代羟基上氢原子生成的一种非离子型衍生物。 它的溶液有表面活性、粘性和溶盐性。赵涛等f 3 1 以h e c 为筛分介质，采用未涂 敷的毛细管在较短的时间内对1 3 个d n a 片段进行了分离。他们指出，采用未涂 敷的毛细管时，由于电渗流的存在使分离机理与安格斯通模型不同。d n a 片段在 电渗流的推动下向负极移动，而d n a 片段带负电其电泳方向与电渗流方向相反。 因而较大的d n a 片段电泳淌度较小，迁移时间较短。当温度升高时，h e c 分子 在筛分溶液中运动活跃，造成“筛孔”孔径减小，而有助于短链d n a 片段的分离。 j a n e t 3 2 】在h e c 的缓冲液中对聚苯乙烯磺酸盐进行了分离，并与凝胶排阻色谱进 行了比较。实验发现，采用h e c 作为筛分介质，分辨率、分离效率和分析速度均 优于凝胶排阻色谱。 3 ) 羟丙基甲基纤维素( h y d r o x y p r o p y lm e t h y l c e l l u l o s e , h p m c ) 羟丙基甲基纤维素实际上是一种经环氧丙烷( 甲基氧环烷) 改性的纤维素， 所以它仍具有与m c 相似的冷水溶性和热水不溶性的特征。h p m c 是一种非离子 型醚，它在水的介质中不离子化，它对于酸和碱，一般来说是比较稳定的，在p h 值为2 1 2 范围内不受影响【3 3 。任吉存等以h p m c 为筛分介质，将c e l i f 用于 d n a 片段及基因扩增产物的分离检测，建立了一种快速、灵敏的d n a 片段及基 因扩增产物分离检测的方法。 聚乙二醇( p o l y e t h y l e n eg l y c o l ，p e g ) 聚乙二醇( p e g ) 为一种亲水、电中性的线性高分子聚合物，其单体形式是： h o ( c h 2 0 c h 2 ) 。o h ，主要是用作表面活性剂和溶剂。从其单体结构可以看出：它 为开链多醚，人们通常称其为开链冠醚口”。由于其结构的特殊性，它可以和许多物 质发生氢键相互作用。通常，在电泳缓冲液中加入聚乙二醇作为添加剂，主要作用 为：低浓度时，可抑制缓冲液中样品与毛细管壁的吸附，从而提高c e 的分离效率 以及分析的重现性：高浓度时，可以作为分子筛，用于分离尺寸不同的分子或颗粒。 张振中【3 刨等以聚乙二醇2 0 0 0 0 为筛分介质对6 种蛋白质进行分离，取得了良好的分 离效果。r a d k o 【3 u 以聚乙二醇为筛分介质，探讨了线性高分子聚合物溶液分离不同 分子量蛋白质的分离机理，得出了蛋白质淌度与筛分介质浓度的关系式。 7 重庆大学硕士学位论文 1 引言 葡聚糖( d e x t r a n ) 葡聚糖凝胶是经环氧氯丙烷交联，具有立体网络结构的多糖类物质，其物理 化学性质比较稳定，但它的孔径较小，特别是经过酰基偶联后，凝胶膨胀使孔径 进一步减小【3 引。葡聚糖在溶于水后可形成粘稠状物质，其孔的大小由聚合物的缠 绕状态决定，未成胶的葡聚糖可流动，易于更换，并且其在低紫外区的吸收很低， 有利于蛋白的灵敏检测。b a r r y 等【39 l 采用低紫外吸收的葡聚糖溶液，以2 1 0 n m 为 检测波长，分离了不同聚合度的聚乙二醇和乙氧基表面活性剂，实验发现，被分 离样品的分子量与其迁移时问程良好的线性关系，同时与基质辅助质子化飞行时 间质谱作比较，两种方法的结果基本一致。 混合筛分介质的使用 除了上述筛分介质的使用，人们还常常将两种筛分介质联合使用。两种筛分 介质互相补充，获得了比采用单一筛分介质更好的分离效果。王园朝【4 0 采用羟乙 基纤维素和聚吡咯烷酮( p v p ) 混合组成的筛分介质，在涂敖聚硅氧烷的毛细管 柱上研究了l a m b d ad n a 厄c o ri + h i i l d i i1 3 个片段的分离。混合筛分介质与单一 的羟乙基纤维素相比，p v p 的加入不仅改变了筛分介质孔径的大小，还可以抑制 毛细管内壁对d n a 的吸附，降低电渗流，改善了分离选择性。羟乙基纤维素、 蔗糖和硼酸在溶液中会形成“互穿网络”无胶筛分介质，显著提高了分离效率。陈 洪 4 l 】等将该方法应用于决定鳝鱼性别基因p c r 扩增产物的分离与鉴定，取得了较 好的结果。靳艳【4 2 】将葡聚糖作为羟丙基甲基纤维素筛分体系的添加剂，改善了改 体系在低浓度时分离d n a 时的能力。同时还比较了甘油、甘露醇和葡聚糖对 h p m c 筛分体系分离效能的改善。其中，葡聚糖的五元环状结h p m c 链的修饰作 用更为明显，因而对分离效能的提高也最为显著。 1 5 毛细管筛分电泳相互作用分析 毛细管凝胶电泳和无胶筛分毛细管电泳统称为毛细管筛分电泳( c s e ) 。毛细 管电泳的多种分离模式均可运用于相互作用分析的测定。将c s e 运用于相互作用 分析的研究，称为毛细管筛分电泳相互作用分析( c s e i a ) ，其中包含的两种模 式又分别称为c g e i a 和n g c e i a 。c s e i a 将生物配体的专一性识别与毛细管 筛分电泳的高分辨率结合到一起，增加了毛细管筛分电泳的多样性，广泛应用于 核酸片段和d n a 碱基对的特异性识别、免疫分析、蛋白相互作用、血清中药物 的分析等研究中。 c s e i a 是将配体加到筛分介质中作为运行缓冲液，筛分介质可以是能更换的 线性高分子水溶液，也可以是在毛细管中固化的凝胶基质。分析物作为样品进样， 分析物与配体间发生相互作用，从而引起被分析物的迁移时间发生改变。c s e i a 8 重庆火学硕+ 学位论文 1 引言 中将配体引入筛分介质中主要有以下三种方式1 4 3 】： ( 1 ) 溶入配体法( s o l u b i l i z e dl i g a n dm e t h o d ) ：将配体加入凝胶缓冲液中，形 成可溶解的配体，配体在凝胶缓冲液中可以有限制的移动( 图1 3 a ) ： ( 2 ) 嵌入配体法( m a e r o l i g a n dm e t h o ：以聚丙烯酰胺凝胶为例，将大配体加 到丙烯酰胺溶液中，凝胶聚合之后大配体就嵌入凝胶基质中( 图1 3 b ) ； ( 3 ) 化学键合配体法( c h e m i c a l l yb o u n dl i g a n dm e t h o d ) ：将配体直接化学键合 于凝胶基质上( 图1 3 c ) 。 a ) s o l u b i l i z e dl i g a n d b ) m a c r o l i g a n dc ) c h e m i c a l l yb o u n dl i g a n d 图1 3 毛细管筛分电泳中配体的引入方式 f i g1 ，3r e p r e s e n t a t i o n so f a f f i n i t yl i g a n d si nc s e a k a s h i 4 4 1 等将c s e i a 应用于寡聚核昔酸序列的特异性识别。根据脱氧胸苷 酸( d t ) 与聚乙烯基腺嘌呤( p v a d ) 的碱基互补，采用嵌入配体法，利用嵌有 p v a d 大配体的聚丙烯酰胺凝胶分离脱氧胸苷酸和寡聚脱氧核苷酸。c e s i a 的也 可以应用于手性药物的分离与分析。b i r n b a u m 4 5 】采用戊二醛与牛血清蛋白共价交 联，作为手性选择试剂填充到毛细管中。为了避免蛋白带来的高背景吸收，他们 运用了部分填充技术，即将含有蛋白的缓冲液只充满检测窗口前的一段毛细管。 基于左旋与右旋色氨酸与蛋白质的相互作用不同，成功地分离了色氨酸对映体， 扩展了基于相互作用的毛细管筛分电泳的应用，为研究弱亲和作用提供了一种分 离选择性更高的方法。 对于嵌入配体法和化学键合配体法，需要将配体聚合或化学键合到凝胶基质 中，制作过程繁琐，操作复杂。相比之下溶入配体法更方便简单，只需将配体加 入筛分介质的溶液中即可利用筛分介质的分子筛分效应，达到分离或测定的目的。 h a u p t 4 6 1 等为考察小分子金属离子如c u 2 + 与蛋白的相互作用，将c u 2 + 转化为亚氨 二醋铜( i i ) 加入到聚k , z 醇中作为运行缓冲液，将蛋白作为样品进样。此时， 蛋白的电泳淌度将发生明显变化。采用无胶筛分毛细管电泳方式，他们测定了胰 凝乳蛋白酶、核糖核酸酶与c u 2 + 的亲和常数k b 。g u t t m a n l 4 7 1 等采用溶入配体法将 带有正电荷的小分子溶入凝胶基质中作为亲和配体，改变了d n a 片断的迁移时 间和不同尺寸d n a 分子的选择性，从而提高了d n a 片断的分离能力。 9 重庆大学硕士学位论文1 引言 1 6 本课题研究的目的、意义及突破 前面已述及，研究药物与蛋白之间的结合常数可以了解药物在体内的作用机 制，为药理研究和药代动力学研究提供有效的参考依据。对于那些具有相近电泳 淌度的药物与蛋白，由于迁移时间窗口很小，采用般的c e i a 区带电泳模式无 法准确测定配体药物的淌度变化，因此采用这种方法无法进行结合常数的测定。 如何填补c e i a 在测量具有近淌度的受、配体之间结合常数的空白，正是本研究 的重点和难点。 针对这种情况，在本实验小组前期研究的基础上，本课题提出利用无胶筛分 毛细管电泳和峰漂移模型，建立测定具有相似淌度的配体与大分子受体之间结合 常数的方法和模型。通过向缓冲液中加入线性高分子作为筛分介质，利用筛分介 质在缓冲液中形成的分子筛网络，对分子量较大的蛋白产生一定拦截，起到分子 筛的作用，而分子量较小的配体能够自由通过。由此通过改变蛋白的电泳淌度从 而拉大检测窗口，有效地测定淌度相近的配体与蛋白的之间结合常数。本研究以 牛血清白蛋白( b s a ) 作为受体，分别以线性聚丙烯酰胺和葡聚糖为筛分介质测 定了几种药物分子与b s a 的结合常数。此外，为了解决由于筛分介质的加入引起 缓冲液粘度变化，本研究采用淌度比的方法求解结合常数，有效扣除了粘度改变 带来的影响。 本研究的主要目的和意义在于将毛细管电泳相互作用分析的对象扩大到具有 相似淌度的受、配体间，建立一种能够测定具有相似淌度或迁移时间窗口很小的 物质间相互作用的方法和模型。为进一步采用毛细管电泳研究两个复杂体系中彼 此组分之间、复杂体系与另一复杂体系中某一组分之问、复杂体系与复杂体系之 间的相互作用奠定了基础。 1 0 重庆人学硕士学位论文 2 理论基础 2 理论基础 2 1 电泳淌度 毛细管电泳( c e ) 是一种以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样 品中离子或带电粒子按照其表观淌度和( 或) 分配系数的差异而实现快速分离分析 的技术 4 8 。荷电的粒子置身于电场e 中，其受到电场力r 的作用： 只= q e( 2 1 ) 其中口是荷电粒子的有效电荷，e 是电场强度。粒子在电场力的作用下要发生 运动，粒子以速度v 运动时，就要受到一个与运动方向相反的粘滞阻力凡的作用： 兄= f v 其中厂是平动摩擦系数，与带电粒子( 离子) 的形状大小有关， 中的运动的速度。当荷电粒子在毛细管中以速度恒定运动时： v = q e f 对于球形离子，由s t o r k e s 定理得： f = 6 n r r ( 2 2 ) v 是离子在电场 ( 2 3 ) ( 2 4 ) ”是介质的粘度，是表观流体动力学半径。则： ，：堕( 2 5 ) 6 m r 用荷电离子的z e t a 电势( 善= q e r ) 来表示离子的迁移速度，则： v ；旦e( 2 6 ) 6 n r 占为介电常数。由此可见，荷电粒子在电场中的迁移速度，除了与电场强度和 介电性质有关外，还与粒子的有效电荷及其大小形状有关。电泳速度与外加电场 强度有关，电泳中常用淌度来描述荷电粒子的电泳行为与特性。电泳淌度口定义 为单位电场强度下离子的平均电泳速度： = v e( 2 7 ) 由此得到淌度的计算式： 2 ；。f l ( 2 _ 8 ) 其中，t 为离子从进样端迁移至检测窗口所需的时间，为毛细管的有效长度， 即从进样端至检测窗口的距离，上为毛细管的总长，矿为运行电压。测定一定电压 重庆大学硕士学位论文2 理论基础 下离子在毛细管中的迁移时间，根据式2 8 可以求出离子在该条件下的电泳淌度。 根据定义的不同，电泳淌度可以分为绝对淌度、表观淌度和有效淌度。 绝对淌度( a b s o l u t e m o b i l i t y ，k t d ) 是指在无限稀释时单位电场强度下离子的平均迁移速度，它是该离子在一定 溶液中的一个特征的物理常数，不同的离子有着各自特征的绝对淌度。例如，h + 的绝对淌度为3 6 2 1 0 c r l l 2 v s d 有效淌度( e f f e c t i v e m o b i l i t y ，f ) 实际上，我们不可能在无限稀释而又没有其它离子的影响下进行工作，因此 引入有效淌度的概念。有效淌度是实验测出的离子淌度，它是所有产物的离解度 ( 珥) 和分子的第i 离子形式的绝对淌度( 卢) 乘积之和： = 口，麒 ( 2 9 ) i 从其定义可以看出，。取决于许多因素，包括离子半径、溶剂化作用、介电 常数、溶剂粘度、离子形状、电荷、p h 、离解度和温度等。 袁观淌度( t p p a r e t l tm o b i l i t y ，肛。) 在电泳过程中，电泳与电