（分析化学专业论文）几种化学生物传感器的制备及在分析中的研究应用.pdf

博士学位论文 摘要 2 1 世纪是环境科学、生命科学以及材料科学的世纪，这些科学的基础研究 和高技术开发都需要分析科学的支持，同时也对分析科学提出了新的挑战。基于 不同化学修饰电极作为化学生物传感器的电化学技术具有装置简单、廉价、响 应快速以及检测灵敏度高等特点，日益得到人们的重视。本文在构建新型化学修 饰电极作为化学生物传感器方面开展了一系列研究，取得了一些很有价值的成 果。本论文的主要研究工作如下： 1 通过将d n a - n i 2 + 复合物，多壁碳纳米管和壳聚糖以复合膜的方式修饰了 玻碳电极制成一种新型的化学传感器，研究了该复合膜对于甲醇的电化学氧化的 协同催化。d n a ，多壁碳纳米管和壳聚糖组成的复合修饰膜是固定电催化活性 物质金属镍离子的很好载体。制备的d n a n i 2 + 多壁碳纳米管壳聚糖修饰电极 在碱性电解质中对甲醇的电化学氧化具有较好的催化能力。该修饰电极在甲醇浓 度为0 2m m o l l j 到5 om m o l l 1 之间能够对甲醇进行定量检测，信噪比为3 时 检测限为1 0 “i n o l l ，响应时间在3 秒之内。此外，该传感器具有优良的稳定性。 2 通过将头孢克肟( c e f ) 与二价金属镍离子络合物固定在壳聚糖膜中制备 了甲醇传感器。该传感器是基于复合修饰膜对甲醇电化学氧化具有催化能力的原 理构建而成。构建的c e f n i 2 + 壳聚糖修饰玻碳电极在碱性电解质中具有好的催 化能力。而且在循环伏安法研究中发现，该修饰电极对于甲醇的第二步氧化具有 非常好的电催化能力。同时，该修饰电极用作甲醇传感器时，能够在2 0 岬o l l d 到1 2 彻o l l 。的浓度范围内对甲醇进行定量检测，信噪比为3 时检测限为5 2 4 岬o l l - l 。此外，该传感器具有很好的稳定性。 3 通过将d n a n i 2 + 复合膜用恒电位法直接电沉积到玻碳电极表面构建了 修饰电极，并对修饰电极上d n a 膜的作用进行了详细的讨论。固定在d n a 直 接电沉积膜中的金属镍离子对于碱性电解质中甲醇的电化学氧化具有优良而且 稳定的电化学催化能力。d n a 膜不仅能促进反应物甲醇分子扩散到膜内的电化 学催化活性位点上，而f j l 还能够使那些对电极具有毒化效应的甲醇氧化中间产物 充分的反应并更容易扩散到溶液中。因此，直接电沉积d n a 膜是金属镍离子的 一个理想载体，固定在其中的催化剂镍催化效率高。在碱性甲醇燃料电池中，应 用该类修饰膜来修饰电池阳极上的催化剂，能够既保证甲醇分子的充分氧化，又 保证电池阳极巧、= 容易被甲醇氧化的中间产物所毒化，从而极大的提高碱性甲醇燃 料电池的能量转化效率。 几种化学牛物传感器的制备及在分析中的研究应用 4 将( 丁烷一1 ，4 一双十二烷基二甲基溴化铵)( b d d a ，c 1 2 c 4 c 1 2 ) 与聚烯 丙基胺盐酸盐( p a h ) 制备成一种新型的复合修饰膜。该修饰膜能够促进固定在 其中的血红蛋白分子( h b ) 与玻碳电极之间的电子转移。在o 1m o l l 1p h = o 7 的磷酸盐电解质中，血红蛋白在修饰电极上出现对定义很好准可逆的氧化还原 峰，式电位为一o 1 5 8v 。该修饰电极对过氧化氢的还原具有催化作用，能够作为 过氧化氢传感器，线性检测范围为5 1 4i i m o l l o 到2 0 0 岬o l l 。 5 构建了多壁碳纳米管d 环糊精复合物修饰碳离子液体电极，在阳离子表 面活性剂溴化十六烷基吡啶( c p b ) 共存体系中，对二酚类同分异构体混合物进 行了同时测定。二酚类同分异构体混合物在该修饰电极上的响应灵敏度以及选择 性在有c p b 共存的条件下被增强了。微分脉冲伏安( d p v ) 谱图上，三种异构 体在修饰电极上的氧化峰电位分别为对苯二酚o 0 2 4v ，邻苯二酚0 1 4 0v 和间 苯二酚0 5 2 0v ，说明三种异构体能够被很好的区分检测。对苯二酚检测线性范 围为1 2x 1 0 。7m o l l 。1 到2 2 1 0 弓m o l l ，检测限4 l0 - 8m o l l ；邻苯二酚为7 o 1 0 7m o l l 。1 到1 o 1 0 。3m 0 1 l 一，检测限8 0 l o 。8m 0 1 l ；间苯二酚为2 6 1 0 击 m o l l d 到9 0 1 0 4m o l l ，检测限9 o 1 0 一m o l l 一。 6 通过串联式压电体声波传感器( s p q c ) 监测溶菌酶蛋白与表面活性剂杂 化的变性与复性过程。溶菌酶蛋白先与十二烷基苯磺酸钠( s d b s ) 杂化发生变 性，然后被十六烷基三甲基溴化铵( c t a b ) 复性。溶菌酶蛋白在变性和复性过程 中使得溶液的电导率发生相应变化，溶液电导率的变化能够通过s p q c 传感器进 行实时监测。结果表明s p o c 传感器技术在实时监测蛋白质与表面活性剂的杂化 中，是一种很便利的分析手段。 关键词：化学修饰电极；化学生物传感器；甲醇电催化氧化；d n a n 2 + 复合 物；甲醇传感器；g e m i n i 表面活性剂；碳纳米管 博士学位论文 a b s t r a c t e n v ir o 【1 n l e n t a ls c i e n c e ，1 i f es c i e l l c ea n dm a t 喇a l ss c i e n c ea r ed o m i n a t i n gt h e2 1s t c e n 劬了；a l lt l eb a s i cs t u d i e sa 1 1 dh i 曲- t e c hd e v e l o p m e n ti nt h es c i e l l t i f i ca r e an e e dt h c s u p p o no ft 1 1 ea i l a i y t i c a ls c i e l l c e ，w h i c hb r o u 曲tf o n a r dn e wc h a l l e n g e st oi t b a s e d o nm e c h e m i c a n y m o d i f i e de l e c t r o d e sa s c h e m o 厂b i o s e n s o r s ，e l e c 订o c h e m i c a l v o l t 猢e t 可h a ss e v e r a ja d v a n t a g e si n 廿1 a tt h ei n s 打u m e l l ti ss i m p l ea n ds u i t a b l e 南r c o n s t n j c t i n gi l l e x p e n s i v ea n dp o n _ a b l ed e t e c t o r s ，w h i c ha r o s e st h er e s e a r c hw 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eb yu s i n gd i r e c te l e c t r o d e p o s i t e dm c t h o d t h er o l eo fd n am 锄b r a i l ew a s s t u d i e di nd e t a i l t h em c k e li o n si m m o b i l i z e di nt h ed n am e 珈b r a l l ee x h i b i t e da n e x c e l l e l l ta n ds t a b l ec a t a l ”i ca c t i v 时t om ee l e c 仃。一o x i d a i i o no fm e t h a n 0 1i na l k a l i n e m e d i u m i tw a si n d i c a t e dt h a tt h ed n am e n l b r a n ew o u l dn o tb l o c km em e t h a n o l m o l e c u l e sd i f 如s ei n t ot 1 1 e c a t a l ”i c a c t i v es i t ei i lt 1 1 i sm o d i 6 e dm e l l l b r 觚e f u r t h e 咖o r e ，i tc o u l dm a k eo x i d a t i o ni n t e n n e d i a t ep r o d u c t sw h i c hm a yp o i s o nt h e a c t i v es i t er e a c ts u 伍c i e i l t l y 趾dd i f m s eo u to ft 1 1 ec a t a l y s tl a y e rm u c he a s i e r a sa r e s u l t ，t h ed n a m 锄b r a n ew a s 锄i d e a lc a r t i e rf o rt h en ii o ni m m o b i l i z i n g ，a i l dt h e u t i l i z a t i o ne f 右c i e l l c yo 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对数极化曲线公式，阐述了电流密度与该电流密度下的电极电位和无电流通过时的 电极电位差值之间的关系。2 0 世纪5 0 年代，多种电化学方法和实验技术报道不断， d e l a h v 【l 】系统地提出了各类电化学测试方法，f r u m k i n 【l 】等提出了旋转环盘电极的方 法等。从6 0 年代开始，h e i n e m e n 等人【2 】把光谱技术和电化学方法结合在同一电解 池中工作，提出了光谱电化学。l a l l e 和h u b b 棚【3 】于1 9 7 3 年开辟了改变电极表面结 构以控制电化学反应过程的新概念，这个实验有力地说明了吸附在电极表面上的官 能团能够发生表面配合反应，并且改变电极电位可调控其配合能力，标志着化学修 饰电极的萌芽。1 9 7 5 年w a t k i n s 【4 】和m o s e s 【5 】分别独立地报道了按人为设计对电极表 面进行化学修饰的研究，这标志化学修饰电极的正式问世。m l 】r r a y 小组研究出用共 价键合进行电极表面修饰的通用方法，并首次提出“化学修饰电极”这一名词，对这 一领域的早期研究产生了强烈的影响。他们的研究说明，电极表面可按设计进行人 工修饰、赋予电极更优良或特定的功能，从而使电化学获得了更有意义的进展。 化学修饰电极已经成为当前电化学领域的研究热点，它开创了从化学状态上人 为控制电极表面结构的领域，突破了传统电化学中只限于研究裸电极电解液界面的 范围。研究者以电导、电位、电流和电量等电参数与被测物含量的关系作为计量的 基础，通过对电极表面分子( 有机物、无机物、金属、聚合物和生物物质) 的修饰( 多 元、多层、多组分、微型化和阵列化等1 ，可按意图给电极预定功能，以便在电极上 有选择地进行预期反应，在分子水平上实现了电极功能的设计。研究这种人为设计 和制作的电极表面微结构及其界面反应，不仅推动了电极过程动力学理论的发展， 同时它显示出的催化、光电、电色、表面配合、富集和分离、开关和整流、立体有 机合成、分子识别、搀杂和释放等效应和功能，使整个化学领域显示出有吸引力的 发展前景。化学修饰电极为化学和相关边缘学科开拓了个创新的和充满希望的广 阔研究领域【6 j 。 几种化学生物传感器的制备及在分析中的研究应用 1 1 2 化学修饰电极的制备 电化学反应是在电极表面进行的，如何改善现有电极的表面性能，成为电化学 工作者研究的重要课题。事实上，诸如电极表面多孔化，抛光，热处理，氧化还原 处理等表面处理方法，以及通过吸附、电析等手段在电极表面引入一种物质的方法 都不是“化学修饰电极”。直到上世纪7 0 年代，人们才开始有目的地在电极表面引入 具有特定功能的化合物，正式确立“化学修饰电极”这一概念。最初对修饰剂的要求 是：被修饰分子层既要保持原有的性质，又要使修饰剂牢固的覆盖在电极表面。我 们把通过共价键合、吸附、聚合、电化学共沉积或自组装等手段，有目的地将具有 功能性的物质引入电极表面，赋予电极新的、特定功能的过程称为电极表面的化学 修饰【7 1 。它把电化学技术同化学的、结构的、以及修饰层的一些优势有机的结合起 来。从本质上看，化学修饰电极用于定量分析是一种把分离、富集和测定三者合而 为一的理想体系，在提高选择性和灵敏度方面具有裸电极无可比拟的优越性。化学 修饰电极就是用化学或物理的方法对电极表面进行修饰，形成具有预期特定功能的 膜，以完成对电极的功能设计。因此，化学修饰电极的制备是开展这个领域研究的 关键。修饰方法的设计，操作步骤的合理性及优劣程度，对化学修饰电极的活性， 重现性和稳定性有直接影响，可以认为它是化学修饰电极研究和应用的基础【8 】。其 中，采用什么方法修饰是需解决的首要问题，因为修饰方法的可靠性，直接影响到 化学修饰电极的重现性和稳定性，进而影响到化学修饰电极的理论研究和实际应用。 1 1 2 1 吸附法 当电极浸到溶液中时就发生了吸附，这是固体溶液界面的一种自然现象。吸附 法就是通过非共价作用将修饰试剂固定在固体基质表面【9 】。吸附法主要分为化学吸 附法、自组装膜法和涂渍法三种方法。 ( 1 ) 化学吸附法 石墨基体表面碳原子可以通过共轭大兀键电子和含有大的共轭体系的有机基团 作用，把修饰试剂不可逆地吸附到电极表面上来。若该物质无电活性，则可利用它 与电活性物质反应达到修饰目的，也可以先两者结合再修饰。m a s c i n i 等【1 0 】利用附 加一定的电位可使未衍生化的寡聚核苷酸探针吸附于石墨电极上，这种方法比较简 单，不需要试剂或特殊的核苷酸修饰。其主要缺点是有非特异性吸附，且在杂交条 件下核酸容易从基质上解吸。由于是多点吸附，碱基被固定后杂交活性较差。m o s e r 等通过改变基质修饰性涂层及控制引入带电荷基团，对非特异性吸附有较好的抑 制作用。刘有芹掣1 2 l 研究了血红素修饰玻碳电极的制备及作用机理，发现血红素在 玻碳电极表面呈现两种状态一单体及二聚体，它们对h 2 0 2 的电化学还原均有良好 2 博士学位论文 的催化作用。 ( 2 ) 自组装膜法 自组装膜法是构膜分子通过分子间及其与基体材料间的物理化学作用而自发形 成的一种热力学稳定、排列规则的单层或多层分子膜。以这种方式修饰电极的方法 叫做自组装膜法。常用的构膜材料有：含硫有机物、脂肪酸、有机硅、烷烃及二磷 酯等五大类。 目前研究的最多的构膜材料要数含硫有机物。研究表明含硫有机物在a u 表面 自组装成膜分为两个步骤：第一步吸附过程很快，膜的自组装完成8 0 9 0 ，受 有机物活性基团与基体材料表面的反应速度控制；第二过程为表面膜的重整过程， 从无序态到规则排列，形成二维膜，花费时间较长。与组装膜的混乱度、链上的不 同基团及其在基体材料表面的移动性能有关。d i n g 等【1 3 】采用循环伏安法研究了硫醇 自组装金电极和裸金电极在k 3 f e ( c n ) 6 】瞄【f e ( c n ) 6 4 。】探针溶液的电化学性质。 结果发现随着裸金电极在硫醇溶液中浸泡时间的延长，电极的氧化还原峰变得越来 越钝，经过2 h 后，组装有硫醇分子的金电极较其组装前在k 3 【f e ( c n ) 6 3 - 】 瞄 f e ( c n ) 6 4 - 探针溶液的氧化还原峰几乎消失，表明硫醇分子在裸金电极表面形成 了致密的自组装膜。b i k a s h 等人【1 4 】应用s 0 1 g e l 法将3 巯基丙基三甲氧基硅烷( m p t s ) 和脱氢酶固定到金电极上，再在膜上混入纳米金颗粒制成传感器，成功地应用于烟 酰胺腺嘌呤二核苷酸( n a d h ) 的检测。 长链的脂肪酸( c 。h 2 n + i c o o h ) 在金属表面形成单分子层膜，其原理基于酸碱 反应，羧酸阴离子与表面阳离子形成离子键。o g a w a 等【1 5 】在1 9 8 5 年首先发现了脂 肪酸在a 1 2 0 3 表面的自组装膜现象。有机硅在含羟基的基体表面，自组装膜形成聚 硅氧烷，通过s i o s i 键连在硅烷醇上【1 6 1 。烷烃通过s i c 键共价键合在硅表面，形成 单分子膜。l i n d f o r d 等【1 7 】首次用载有h 原子的硅表面( h s i ( 1 1 1 ) ) 自组装成烷烃单 分子膜。二磷酯多层分子膜的构建是基于四价的过渡金属离子的二磷酯盐的不溶性 质。该类盐中羟基基团连在磷酯盐两侧。用烷烃链取代羟基，并向磷酯盐两侧扩展， 二磷酯形成膜结构。l e e 等人【1 8 】首先发现z r 4 + 与业烷基二磷酯自动吸附形成自组装 膜。 ( 3 ) 涂渍法 涂渍法就是将溶解在适当溶剂中的聚合物涂覆于电极表面，待溶剂蒸发干后， 生成涂膜结合在电极表面，从而达到化学修饰的目的。具体方法主要有三种：( a ) 将电极浸入修饰液中，取出后附着于电极表面的溶液干了以后形成修饰膜；( b ) 用 微量注射器汲取已知一定量的修饰液注射到电极表面，等修饰液干了以后形成修饰 膜：( c ) 电极在修饰液中旋转，使修饰液附着于电极表面，修饰液干了以后形成修 3 几种化学牛物传感器的制备及在分析中的研究应用 饰膜。上述三种方法中，( b ) 方法涂膜的量可以控制。 将聚合物与电活性物质同时制成涂膜液，然后通过涂渍法制备的化学修饰电极， 在许多领域都有应用。通过此方法可将具有氧化还原中心的聚合物、具有离子选择 性和透过性的聚合物、配位分子、高分子电解质、具有光敏效应的聚合物、导电性 共轭高分子、粘土类无机高分子等材料涂渍于电极上，制备具有不同性能的化学修 饰电极。 吸附法制备的修饰电极，存在简单、直接的优点，但是主要问题是吸附层的量 重现性不好，而且吸附的修饰剂容易脱落。但在严格控制实验条件下，它还是可以 获得重现性较好的结果。 1 1 2 2 共价键合法 共价键合法是通过化学反应将修饰试剂共价结合到电极表面，从而形成修饰膜 的方法。简单的说就是首先将电极表面进行化学的或物理的预处理，然后将修饰物 分子与电极表面的活性基团在适当条件下进行化学反应，从而使修饰物分子固定于 电极表面形成化学修饰电极。 ( 1 ) 电极的预处理 电极的预处理就是通过化学或者物理的方法，在电极进行共价键合修饰之前将 电极的表面预处理为我们所需要的状态，如带上某些化学基团。例如对于石墨或玻 碳电极，就是将电极抛光清洗之后，在强氧化剂或空气中加热氧化，使其表面产生 羧基、羟基、羰基、酸酐等含氧基团。或者将电极用氩等离子侵蚀，以消除电极表 面的含氧基团，使表面的碳原子完全裸露，处于高活性状态，接下来即可进行氧化 处理或直接与伯胺类物质反应进行修饰。此方法产生的含氧基团浓度高，因此电极 的活性高，但是缺点就是操作较复杂。对于金属电极如金电极可先用a 1 2 0 3 ( 0 3 0 6 岬0 1 l 1 ) 悬浊液抛光，然后依次用浓硝酸、稀王水及二次蒸馏水洗净，再浸入 1m o l l jh 2 s 0 4 溶液中5m i n 后，在电位0 到+ 1 5v ( v s s c e ) 下循环伏安扫描约 1 0m i n 左右，然后从电解液中取出电极用二次蒸馏水洗净，再用丙酮洗涤干净。此 时电极表面就含有羟基活性基团。s n 0 2 等金属氧化物电极可以先用庚烷等溶剂回流 或在空气中加热至4 5 0 。c 除去表面油污，然后浸泡在热盐酸中数小时，取出后依次 用二次蒸馏水、丙酮洗涤干燥，从而使表面获得活性羟基基团。 ( 2 ) 共价键合修饰 对于已经预处理好的石墨、玻碳电极，可先将表面的含氧基团与酰氯试剂接触， 再与胺类( r - n h 2 ) 作用生成肽键来固定r 化学活性基团。也可将电极表面的羧基与 l i a l h 4 试剂作用，使之转变为o h 基团，然后与含有化学活性基团r 的有机硅化合物 作用，通过生成硅氧基( s i o r ) 引入活性基团r 。如果电极表面含羧基较多，可以 4 博士学位论文 通过促进剂双环己基碳二亚胺( d c c ) 的促进作用生成肽键来固定化学活性基团r 。 此外，经氩等离子侵蚀活化后的电极也可直接与胺类作用，将r 固定于电极表面。将 化学活性基团r 键合到电极表面后，也能再和电活性物质作用，达到修饰目的。金属 及其氧化物电极可以先与有机硅化合物作用，把含r 化学活性基团的物质键合到电极 表面，再利用电活性基团与化学活性基团r 作用，将电活性基团修饰到电极上去。 m i l l a n 等【1 9 】使用n 一羟基琥珀酰亚胺( n h s ) 和水溶液的碳二亚胺( e d c ) 作为偶联活 化剂，成功将s s d n a 共价结合到经过氧化预处理的玻碳电极表面。实验结果表明 s s d n a 是通过鸟嘌呤g 和胞嘧啶c 与玻碳电极表面的o 酰基异脲共价结合。h v u l l 等【2 0 】 先使用胱胺将金电极胺基化，然后将经1 0 4 氧化后带有大量醛基的葡萄糖氧化酶和带 有许多氨基的树枝状的聚酰胺基胺交替键合固定到金电极表面，形成三维的层状结 构。该方法制备的修饰电极制作方法简单，而且修饰膜的厚度和修饰电极的灵敏度可 通过改变实验条件进行控制，并且可以不仅仅将一种而是将多种蛋白酶固定到修饰电 极上。 1 1 2 3 电化学聚合法 将预处理好的电极放入含有一定浓度的聚合物单体和支持电解质的体系中，通 过电化学氧化还原引发，使电活性的单体就地在电极表面发生聚合，生成聚合物膜， 达到修饰目的的方法称为电化学聚合法。由于化学修饰电极表面有许多氧化还原中 心，因此又被称为氧化还原聚合物化学修饰电极。 常用的电聚合方法有恒电流法、恒电位法和循环伏安法。其中，恒电流法应用 广泛，因为使用该法可根据聚合过程中的聚合电量估算出聚合物薄膜的厚度，实验 结果重现性相对较好；恒电位法由于在试验进行中无法 空制电聚合反应的速度，直 接影响到电极的重现性相对较差；循环伏安法能获得良好的聚合物膜修饰电极，并 能根据连续循环伏安图现场实时观察聚合物膜的形成，便于了解和控制聚合膜的生 成过程。随着循环扫描周数的增加，伏安图上相应峰电流不断变化是形成聚合物膜 的特征。d i a z 等人在1 9 7 9 年首次报导了使用电化学的方法氧化吡咯，从而在电极 表面形成电聚合物聚吡咯( p p y ) 。他们随后又采用类似的电聚合方法在电极表面修 饰了聚噻吩( p 1 1 1 ) 、聚苯胺( p a n ) 及其相应的衍生物等【2 l 】。h u 等人【2 2 】使用电聚 合方法将苯胺和氨苯砜单体同时电聚合在p t 电极上，生成一层聚苯胺( p o l v 锄i l i n e ) 聚氨苯砜( p o l y s u l f o n e ) 组成的复合电聚膜。该修饰电极对抗坏血酸的氧化具有很好