（植物学专业论文）蛋白质的表达、纯化和溶液结构的研究.pdf

山东师范人学硕士论文 蛋白质的表达、纯化和溶液结构的研究 以大肠杆菌r n a 焦磷酸水解酶r p p h 蛋白为例 中文摘要 基因表达调控因其重要性日益成为生命科学领域的研究重点，其中，转录后 调控更是研究的热点之一。m r n a 降解就是通过控制翻译次数在基因表达的转 录后调控阶段发挥重要作用。在大肠杆菌中m r n a 降解包含两个阶段，第一个 阶段，m r n a 的5 端从三磷酸根形式变为单磷酸根形式。第二个阶段，核酸内 切酶降解第一个阶段生成的5 端为单磷酸根形式的m r n a 。其中，第一个阶段 是限速步骤。以前的研究表明n u d i x 水解酶家族在不同的物种中具有m r n a 降 解第一个阶段所需要的单核苷酸焦磷酸水解酶活性。近来，有研究报道大肠杆菌 n u d i x 水解酶家族的一员一p p h ( 以前称为n u d h ) ，可以从r n a 的5 端除去 焦磷酸根。多序列比对显示n u d i x 水解酶家族蛋白的n 端非常保守，并且这一 部分也是蛋白具有焦磷酸水解酶活性所必需的。然而直到目前，r p p h 生物活性 的分子机制仍然未知。 目前，蛋白质分子的结构主要通过x 射线衍射，核磁共振( n m r ) 和电镜 ( e m ) 等技术手段获得。同x 衍射和电镜技术相比，核磁共振技术具有无可比 拟的优点。第一，核磁共振技术可以在不破坏生物样品并保持在溶液状态下研究 生物大分子蛋白质的结构，这种结构能更真实反映蛋白质在正常生理活性条件下 的状态。第二，蛋白质分子在生物系统中存在不同时间尺度的运动，这种特性对 于很多生物过程是非常重要的。核磁共振技术可以得到多个时间尺度内蛋白质运 动的信息，从而研究分子结构与生物功能的关系。但核磁共振技术也存在成本较 高，周期较长，对解析较大分子量的蛋白( 3 0l a ) 时存在一些困难等缺点。 本文运用基因工程手段实现了r p p h 蛋白的克隆及其在大肠杆菌中的过量 表达，表达条件是b l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 菌种，3 5 ，0 4 m mi p t g 诱导4 小时。 然后通过阳离子柱和分子筛技术纯化蛋白。在蛋白表达纯化条件优化成熟后，在 m 9 培养基中大量表达蛋白，并且对蛋白进行了”c 和1 5 n 标记。然后运用核磁 共振技术，解析了大肠杆菌r p p h 蛋白的高分辨率溶液结构( b m r bi d ：1 6 1 2 4 ， p d bi d ：2 k d v ) 。结果显示，r p p h 具有典型三明治结构，由5 个q 螺旋和8 个p 山东师范大学硕士论文 折叠组成，表面电荷图显示结构上存在明显沟槽，且沟槽背面为正电荷聚集区。 同大肠杆菌n u d i x 家族其他蛋白相比，尽管氨基酸序列相似性不高，但三维结构 具有极高的相似性。在得到了r p p h 的结构信息后，对其生物活性的分子机制进 行了初步探讨。以前的研究显示，n u d i x 家族的蛋白表现活性需要m 9 2 + 的参与， r p p h 的m 9 2 + 滴定实验显示滴定前后r p p h 的各残基的化学位移并没有变化。底 物类似物a t p 的滴定实验显示滴定后r p p h 的部分残基的化学位移发生明显变 化，变化的区域集中在沟槽区域。以前的研究表明酵母同源蛋白d c p 2 也具有相 似的沟槽区域，并且预测这一区域为r n a 结合区域。 关键词：r p p h ，m r n a 降解，核磁共振，溶液结构 2 山东师范人学硕士论文 t h es t u d yo np r o t e i ne x p r e s s i o n ，p u r i f i c a t i o na n ds o l u t i o ns t r u c t u r e a b s t r a c t t h er e s e a r c ho ng e n ee x p r e s sr e g u l a t i o nb e c o m e sa ni m p o r t a n ta s p e c ti nt h ef i e l d o fl i f es c i e n c e ，i nw h i c hp o s t - t r a n s c r i p t i o ni sa ne v e nh o t t e ri s s u e t h em r n a d e g r a d a t i o np l a y sa ni m p o r t a n t r o l ei n p o s t t r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t i o n o f g e n e e x p r e s s i o nb yc o n t r o l l i n gt h en u m b e ro ft r a n s l a t i o nt i m e s t h em r n ad e g r a d a t i o ni n ec o l ii n v o l v e st w os t e p s t h ef i r s ts t e pi sar a t e d e t e r m i n i n gp r o c e s s ，w h i c hc o n v e r t s t h em r n a5 t e r m i n u sf r o mat r i p h o s p h a t et oam o n o p h o s p h a t e i nt h en e x ts t e p t h e e n d o n u c l e a s ec l e a v e st h em o d i f i e ds u b s t r a t e si nt h ef i r s ts t e p p r e v i o u ss t u d i e s i n d i c a t et h a tm e m b e r so ft h en u d i xh y d r o l a s ef a m i l yh a v eb e e ni d e n t i f i e di nv a r i o u s o r g a n i s m sa n ds h o w n t op o s s e s st h em o n o n u c l e o t i d ep y r o p h o s p h o h y d r o l a s ea c t i v i t y , t h ef i r s ts t e po fm r n a d e g r a d a t i o n r e c e n t l y , i tw a sr e p o r t e dt h a tr p p h ( p r e v i o u s l y n a m e da sn u d h ) i sap y r o p h o s p h o h y d r o l a s e ，am e m b e ro ft h en u d i xf a m i l y , w h i c h r e m o v e sp y r o p h o s p h a t ef r o mt h er n a5 e n d s m u l t i p l es e q u e n c ea l i g n m e n ti n d i c a t e s t h a tt h en - t e r m i n a lr e s i d u e sa m o n gt h em e m b e r so fn u d i xf a m i l ya r ew e l lc o n s e r v e d ， w h i c hi se s s e n t i a lf o rt h ep y r o p h o s p h o h y d r o l a s ea c t i v i t y h o w e v e r , t h em o l e c u l a r m e c h a n i s mo ft h e b i o l o g i c a l f u n c t i o no fr p p h ( r n ap y r o p h o s p h o h y d r o l a s e ) r e m a i n su n c l e a rt h u sf a r c u r r e n t l y , t h ex r a y , e ma n dn m r a r et h em a i nw a y si nt h es t u d yo fp r o t e i n s t r u c t u r e c o m p a r e dw i t hx r a ya n de m ，n m rp o s s e s s e si r r e p l a c e a b l ea d v a n t a g e s f i r s t l y , p r o t e i no f t e nm a k e si t sf u n c t i o ni n s o l u t i o na n dn m rc a nd e t e r m i n ei t s s o l u t i o ns t r u c t u r e t h i ss t r u c t u r ec a l lt r u l ys e to u tt h es t r u c t u r eo fp r o t e i ni nn o r m a l l y p h y s i o l o g i c a ls t a t e s e c o n d l y , n m rc a np r o v i d ed y n a m i ci n f o r m a t i o no fp r o t e i ni n v a r i o u st i m es c a l e s ，w h i c hi si m p o r t a n tt oi t sp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n s i tg i v e sm u c h i n f o r m a t i o no nt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nm o l e c u l es t r u c t u r ea n db i o l o g i c a lf u n c t i o n h o w e v e r , t h e r ea r ea l s os o m ed i s a d v a n t a g e si nn m r ，s u c ha sh i 曲c o s t ，l o n g c y c l e t i m e n o tv a l i df o rl a r g ep r o t e i n ( 3 0k d a ) r p p hi sc l o n e da n de x p r e s s e di ne c o l ib yg e n ee n g i n e e r i n g t h er p p hp r o t e i n 3 山东师范大学硕士论文 w a sp u r i f i e db yc a t i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h ya n df p l c a f t e rf i n dt h ep r o p e r c o n d i t i o n so fp r o t e i ne x p r e s s i o na n dp u r i f i c a t i o n ，w ee x p r e s st h ep r o t e i nw i t h1 3 ca n d ”nl a b e l e d w ed e t e r m i n et h es o l u t i o ns t r u c t u r eo fr p p hp r o t e i nf r o mec o l ib y n m r ( b m r bi d ：16 12 4 ，p d bi d ：2 k d v ) i tr e v e a l st h a tr p p hc o n s i s t so ff i v e a h e l i c e sa n de i g h t1 3 - s t r a n d s f o r m i n gas a n d w i c hs t r u c t u r e e l e c t r o s t a t i cs u r f a c eo f t h er p p hm o d e ls h o w st h a tt h e r ei sac h a n n e li nt h es t r u c t u r e t h ep o s i t i v e l yc h a r g e s a s s e m b l eo nt h ed o r s u ms u r f a c eo ft h ec h a n n e l t h et h r e e d i m e n s i o nr p p hs t r u c t u r e s h o w ss i g n i f i c a n ts i m i l a r i t i e st oo t h e rp r o t e i ns t r u c t u r e so fn u d i xf a m i l yi ne c o l i t h o u g ht h e yh a v el o wa m i n oa c i ds e q u e n c ei d e n t i t i e s a n dt h e n ，w ei n v e s t i g a t et h e m o l e c u l a rm e c h a n i s mo fr p p hb i o l o g i c a la c t i v i t y p r e v i o u ss t u d ys h o w st h a tm 9 2 a c t sa sac o - f a c t o ro ft h ep r o t e i n so fn u d i xf a m i l y t h ec h e m i c a ls h i f t so fa m i d e h y d r o g e na n dn i t r o g e no fr p p hd on o tc h a n g ea f t e rt h ea d d i t i o no fm 9 2 十t h ea t p t i t r a t i o ne x p e r i m e n t s ，w h i c hi sas u b s t r a t ea n a l o go fr p p h ，i n d i c a t et h a tt h ec h e m i c a l s h i f t so fr p p hc h a n g ea f t e rt h ea d d i t i o no fa t et h er e s i d u e s ，w h i c hc h e m i c a ls h i f t s c h a n g e ds i g n i f i c a n t l v ，a s s e m b l en e a rt h ec h a n n e lo ft h es t r u c t u r e p r e v i o u ss t u d y s h o w st h a tt h e r ei sa l s oac h a n n e li nt h es t r u c t u r eo ft h ey e a s th o m o l o g u ep r o t e i n d c p 2 ，w h i c hi sp r e d i c t e da sar n ab i n d i n gc h a n n e l k e y w o r d ：r p p h ，m r n ad e g r a d a t i o n ，n m r ，s o l u t i o ns t r u c t u r e 4 b m r b c o s y c s i d s s d t t e d t a f p l c h s q c i p t g m e s n o e b i o m a g r e s b a n k c o r r e l a t i o ns p e c t r o s c o p y c h e m i c a ls h i f ti n d e x 缩写表 生物磁共振数据库 ( 化学位移) 相关谱 化学位移索引 s o d i u m 4 ，4 - d i m e t h y l 一4 一s i l a p e n t a ne s u f o n a t e4 ，4 - - 甲基硅代戊磺酸钠 d i t h i o t h r e i t o l二硫苏糖醇 e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i dd i s o d i u ms a l t7 , - 胺四乙酸二钠 f a s tp r o t e i n1 i q u i dc g r o m a t o g r a p h y 快速蛋白质液相层析 h e t e r o n u c l e a rs i n g l e q u a n t u mc o h e r e n c e 异核单量子相关谱 is o p r o p y l t 3 一d t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e 异丙基一b d _ 硫代半乳糖苷 2 一( n - m o r p h o l i n o ) e t h a n e s u l f o n i ca c i d 2 一( n 一吗啉基) 乙磺酸 n u c1e a ro v e r h a u s e re f f e c t n o e s yn o es p e c t r o s c o p y p b s p d b p m s f r m s d s d s p h o s p h a t eb u f f e rs a l i n e p r o t ei nd a t ab a n k p h e n y lm e t h a n es u l f o n y lf l u o r i d e r o o tm e a ns q u a r ed e v i a t i o n s o d i u md o d e c y ls u l f a t e t o c s yt o t a lc o r r e l a t i o ns p e c t r o s c o p y 核o v e r h a u s e r 效应 n o e 谱 磷酸盐缓冲液 蛋白质结构数据库 苯甲基磺酰氟 均方根偏差 十二烷基硫酸钠 全相关谱 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如 没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名：土# 砖j 菱鄂签字璁 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权趁可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文声 解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：上 沁芬l 导师签字霭 签字r 期：2 0 0c 7 年孓月寥日 签字日期：2 0 0 彳年罗月g 日 山东师范大学硕士论文 第一章绪论 1 1 核磁共振技术综述 核磁共振( n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c en m r ) 现象是1 9 4 6 年由哈佛大学的伯 塞尔和斯坦福大学的布洛赫所领导的2 个小组，用不同的方法在各自的实验室里 观察到的【1 1 。核磁共振技术发展迅速成熟，6 0 年来，一共有四位科学家因为其在 核磁共振领域的研究获得诺贝尔奖，其中2 0 0 2 年的诺贝尔化学奖之一半授予了 k u r tw t i t h r i c h 博士，以表彰他在应用核磁共振技术获得生物大分子溶液三维结构 方面所做出的卓越贡酬2 1 。至今，核磁共振波谱技术是能够在原子分辨率下测定 溶液中生物大分子三维结构的唯一方法。同时，核磁共振技术不仅仅局限于结构 测定，它在生物学中的应用还包括如下方面：( 1 ) 研究动态的生物大分子之间以 及与配基的相互作用；( 2 ) 研究生物大分子的动态行为；( 3 ) 用固体核磁共振或液 体核磁共振技术研究膜蛋白的结构与功能；( 4 ) 研究蛋白质折叠，折叠动力学；( 5 ) 用于药物筛选与设计；( 6 ) 研究代谢组学；( 7 ) 研究活细胞中的蛋白质一蛋白质相 互作用；( 8 ) 核磁成像用于认知科学研究p - 6 3 。 1 1 1 基本原理 核磁共振( n m r ) 其物理学原理是：核自旋不为零的原子核在外磁场的作 用下，能级发生分裂，如果有一个频率和原子核高低能级间差值相同的电磁波施 加到该自旋体系，则处在不同能级上的磁性核发生受激跃迁而产生共振吸收由 于处在低能级上的核略多于处在高能级上的核，故其净结果是低能级的核吸收了 电磁波的能量跃迁到高能级上8 1 。 核磁共振实验通过发射脉冲使各种不同的核同时被激发，为了恢复平衡，各 个核通过各种方式弛豫，由此可以得到一个随时问逐步衰减的信号，称f i d ( 自 由感应衰减) 信号，它是各种核的f i d 信号的叠加，这种信号经傅里叶变化后成 为射频信号，即通常说的n m r 谱副7 】【9 】【1 0 】。谱图提供的一个基本信息就是化学位 移。不同的质子( 或其它种类的核) ，由于在分子中所处的化学环境不同，因而 在不同的磁场下共振的现象叫化学位移【1 1 1 。因此，化学位移不仅包含了原子核自 身的信息，也包含了周围结构和环境的信息，具体说影响化学位移的因素有诱导 效应、共轭效应、各相异性、范德华力、氢键和溶剂效应等【9 】【12 1 。然而由于结构 5 山东师范大学硕士论文 和周围环境的复杂性，很难直接通过化学位移得到这些信息。化学位移主要用于 区分各个原子核，即用于共振信号的指认。n m r 方法得到的另一个信息是弛豫 信息。共振发生后磁化向量从非平衡态恢复到平衡态的过程，称为弛豫。向量恢 复到平衡态有两种不同的机理，一种称为纵向弛豫过程，恢复到平衡态的弛豫时 间用乃表示。在此过程中磁能级上的粒子数要发生变化，自旋体系的能量也要变 化，它要和晶格或环境交换能量，因此也称自旋晶格弛豫过程。另一种称为横 向弛豫过程，恢复到平衡态的弛豫时间用乃表示，在此过程中自旋体系内部有能 量的耦合，它使磁化向量进动相位从有规分布趋向无规分布，但它和晶格之间不 交换能量，自旋体系的总能量没有变化，因此这个过程称为自旋一自旋弛豫过程 【9 】【1 l 】【1 2 】。弛豫现象与分子大小、运动状况以及所处的环境密切相关，目前用于得 到结构信息的最主要方法是测量n o e ( 核o v e r h a u s e r 效应) 。n o e 本质是弛豫现 象的一种，是由于两个原子核的交叉弛豫作用，一个原子核的信号饱和时，另一 个原子核的信号得到加强。n o e 强度是混合时间以及两个原子核间距的函数，当 混合时间较短时，n o e 强度与核间距离的6 次方程成反比，从而可以得到原子核 间的距离信息7 】【9 】。用于蛋白质结构计算的n o e 通常来自蛋白质中质子间的n o e 加强。核磁共振技术用于蛋白质溶液结构计算就是综合分析化学位移和n o e 数 据，从而得到一个自洽的三维结构。另外，n m r 方法还可以得到的信息有耦合 常数，谱线强度等，也可以从中得到部分结构信息7 】【9 1 。 1 1 2 实验步骤与策略 核磁共振研究蛋白通常得到蛋白质的溶液结构，其步骤可大致分为四步： 获得样品、n m r 实验和数据处理、谱峰指认、数据分析计算【_ 7 1 。 获得样品：在运用核磁共振方法进行蛋白溶液结构研究中制备能满足多维核 磁共振长时间实验要求的高稳定的蛋白质样品是开展蛋白质分子空间结构测定 工作的首要前提，在分子大小合适的条件下，对样品的要求主要是溶解度和稳定 性【l 引。在样品不会产生聚集沉淀的条件下，样品的溶解度越大越好，同时因为 用于结构测定的核磁共振实验一般要求数天时间，所以稳定性也是必需的【丌。在 溶剂的选择方面，需要保证：( 1 ) 样品在其中有高溶解度；( 2 ) 在一定的波谱范 围内没有溶剂峰；( 3 ) 样品与溶剂分子不会发生反应；( 4 ) 在做变温实验的温度 范围内保持液体状态。在溶剂中加添试剂也是保证实验顺利进行常用的手段，例 6 山东师范大学硕士论文 如添加一定浓度的盐增加溶解性，添加一定浓度的氧化性谷胱甘肽和还原性谷胱 甘肽等提供氧化还原体系和一定浓度的甘油等促进蛋白更好的折叠溶解，添加 n a n 3 防止样品管中细菌生长，添力i d t t 防止二硫键的生成【7 1 ，填充氩气等惰性气 体驱赶走核磁管中的空气利于蛋白质稳定。同时随着所研究的蛋白质分子量的增 大，1 h 化学位移重叠和线宽增加的现象会逐渐加剧，增加了蛋白质研究的难度。 为了克服这些难题，人们陆续发展了一系列的方法，如对蛋白质进行1 5 n 和1 3 c 均 匀标记、异核多维核磁共振实验等。在异核实验中，1 h 的化学位移将会沿着1 5 n 或1 3 c 的化学位移在三维甚至四维空间上得到分散，谱峰的重叠现象得到了极大 的改善，所研究的蛋白质的分子量也得到显著提高【14 】【1 5 1 。同位素标记使用的1 5 n 源主要有n h 4 c 1 和( n h 4 ) 2 s 0 4 ，1 3 c 源主要有葡萄糖，甘油和醋酸盐等。由于b c 化合物价格是”n 化合物价格的十倍，进行蛋白质结构测定时往往先制备单标记 ”n 的蛋白质样品，优化n m r 缓冲液和n m r 实验温度，使得蛋白质的稳定性最佳， 谱峰的离散性最好，然后再制备双标记( 1 5 n 1 3 c ) 的蛋白质样品 1 6 1 。适于n m r 研究的蛋白质样品的条件是：浓度大于等于0 8m m ，p h 4 6 ，低盐浓度或无盐， 纯度越高越好。样品中还应添加重水用来锁场，添 j i d s s 用来内标。样品溶解后 还应该高速离心以除去可能的微小颗粒，以免影响匀场，降低分辨率。 实验和数据处理：在获得合适样品以后，就可以进行核磁共振实验。不同类 型实验对谱仪要求不同，单标样品只需要双共振探头即可，双标样品则需要三共 振探头。一般一个三共振实验需要几天，所以实验设定前要选定合适的实验参数， 以保证得到的实验数据有足够的分辨率和灵敏度。一般，实验开始后几小时就可 以看到初步的实验数据，这时可以进行适当处理，检查实验正确性，此时发现问 题可以及时改正【7 】【1 7 】。( 2 d ) h s q c 、( 3 d ) h n c a 、h n c a c b 、c b c a ( c o ) n h 、 h n c o 、h n ( c a ) c o 等实验用来进行主链指认，( h ) c c ( c o ) n h 、h b h a ( c o ) n h 、 ( h ) c c h c o s y 和( h ) c c h t o c s y 等实验用来进行侧链指认【1 8 之3 1 ，( 3 d ) ”n ，1 3 c n o e s y - h s q c 实验用来进行验证化学位移指认和提供原子核距离约束信息【2 4 】。 数据处理的基本步骤包括：充零、线性预测、加窗函数、傅里叶转换、相位校正、 基线校正等，现在这些步骤的处理已经实现计算机化，可以快速准确的实现【7 1 。 指认：指认是对谱图上的谱峰进行归属，包括自旋系统的指认和谱峰的指认。 自旋系统的指认即是得到每个原子的化学位移值，谱峰指认是把每个谱峰与相应 7 山东师范大学硕士论文 的原子联系起来的过程【7 】。每个n m r 谱图会给出特定结构的原子间谱峰，氨基酸 自身的化学组成和结构决定了各种氨基酸的各个原子的化学位移有特定的范围， 如图1 1 ，各个原子所处的化学环境也会影响自身的化学位移。这些信息结合起 来确定了各个原子的化学位移，就是说化学位移本身包含了所处环境的信息。谱 峰指认有人工指认和计算机软件自动指认两种方式，各有利弊。人工指认能较准 确的区分信号与噪音，但有时存在最大面误差；自动指认可以准确确定最大面， 提高化学位移指认的准确性，但往往把一些噪音当做信号。一般采用自动指认后 再人工进行一次检查最终确定谱峰指认。指认是一个复杂费时又极为重要的过 程。一般要求原子化学位移的指认率在8 0 以上。 结构计算和数据分析：在完成指认之后，就可以将n o e ( 或其它约束信息) 转化成距离约束( 或其它约束) ，即可以开始结构计算。用于结构计算的方法主 要有两种，距离几何和模拟退火，其中模拟退火是使用最多的方法【7 1 。结构计算 应与谱图的指认交叉进行。很多化学位移和n o e 指认一开始是有错误的或不能完 全指认的，结构计算过程可以对前面的指认进行确定，纠正和添加新的指认，得 到新的化学位移和n o e 数据后，再进行结构计算，如此反复，直到得到正确的三 维结构。在结构计算的前期得到正确的拓扑结构( 结构框架，即整个肽链的空间 走向和相对位置) 非常重要，一旦得到之后，后面的优化就相对容易【_ 刀。结构计 算是一个形成蛋白质三维结构自洽体系的过程，在此过程中，即是对化学位移和 n o e 数据不断修正，从而使两者相互印证，使蛋白质结构合理的过程。拿一栋房 屋做例子，化学位移信息就像是给定一栋房屋各个拐角的位置，n o e 信息就是给 定各个拐角之间的距离和相对方位的信息。一旦这两个信息可以互相印证，房屋 的结构就能计算出【。对于不进行结构计算的其它研究( 如活性位点的确认，蛋 白质折叠等) ，在得到指认之后就可以对各种实验数据进行分析【7 】。 1 1 3 其它问题 在n m r 研究中可能会用到多种计算软件，它们对氨基酸原子的命名不尽相 同，使用时需要将命名统一【7 】。一般应该采用i u p a c ( i n t e r n a t i o n a lu n i o no f p u r e a n d a p p l i e dc h e m i s t r y ) 推荐的氨基酸原子命名方式，见图1 2 。 8 b t h f ， 一“芦 十j v i dr - 一t t m 二 一t 一一 7 n 一h j 5 04 03 0 2 , 01 由 h p 邮 ，c 酝 。 渤 摹c0 a m ) h 妇p m i 图1 1 各种氨基酸的1 h 和1 3 c 的化学位移分布【7 】 f i g u r e 1 11 ha n d1 3 cc h e m i c a ls h i f td i s t r i b u t i o no fa m i n o a c i d g i y 广 _ 一2 问，断。一誊。h 。问 p _ _ h “ l ，o a s p 坍 r 。伊 & j k 、o ：一舻 c y 函 h ” ，e # s ，m k g i n 篓矿， 参， ，c 广 蠢耘、一i n ( 2 _ h r 2 田 佛if r ， 。t ：t 一 气熙 h u 孵 攀譬，恐h 皋“ 一f 茜强 孙r 舻 * 一跳蚋。 o 一一 手于三一 ：i 一一瑚 一争阵俨一酪h # 3h t h h 二- 如冬、萨一h 吐k 芦。 冈棚螂 一 l ” h p 2h 幻 心 ，争b 争一；o 响 岛：如k 冬、 。 m e t 一3 印2 ， 妒一c l ( k ， p h e 一一l i = 毒、c 酝c ( i 。冬毋 瞥一球 三鲇、疆 弱函 、一 t y r v a l h 5h i i rj 群幽f 吁一b ，& 0弋一o n h n，知 骛鼢b渤函、舭溺”4 图1 2i u p a c 推荐的氨基酸中原子的命名方式。r 表示前手性四面体基团的p r o - r 位置，e z 表示平面基团中原子位置。对于不能使用希腊字母的情况下，使用大写字母代替：a _ a ，p ：b ， 丫= g ，6 = d ，e = e ，乒z ，1 1 = h 7 】o f i 舭l 2t h en a m i n gp a t t e r n so fa m i n oa c i da t o m sw h i c hi u p a cr e c o m m e n d rr e p r e s c n t sm e p r 0 - rl o c a t i o no ft h ef o r w a r dc h i r a lt e t r a h e d r a n e - t y p e ，e zr e p r e s e n t st h ea t o ml o c a t i o no f p l a n a t e g r o u p s o m e t i m e s ，c a p i t a ll e t t e rc a ns u b s t i t u t et h eg r e e ka l p h a b e t ，c t = a ，邮，y - - - - ( 3 ，6 ：d ，e ， 3 z ，q = h 9 胁脚=胁=秘= 蛩 cl 一 蛩 舻 p 一 舻 pw，够c，州。 ， r段。 p 舻k - 遵 妒“ 缔h k 晰 _ 山东师范大学硕士论文 1 2m r n a 降解作为转录后调节重要手段的相关研究介绍 机体能在基因表达过程的任何阶段进行调控，如调控可在转录阶段、转录后 a n - r 阶段和翻译阶段进行。最常见的调控是转录水平的调控。r n a 初级转录产 物本身是一个受调控的靶蛋白，转录物作为一个整体其有效性可以受到调控，例 如，它的稳定性可以决定它是否保存下来用于翻译【2 5 1 。m r n a 的降解就是把一 些稳定性不高的m r n a 经由核酸内切酶进行降解，阻止其后续的翻译过程。因 此m r n a 就是通过控制翻译的次数调控基因的表达【2 6 1 。m r n a 的更新率非常高， 细菌m r n a 的半衰期为几分钟，脊椎动物细胞m r n a 平均半衰期可以达到三小 时【2 7 】。m r n a 降解这一过程可以分为两个阶段，第一个阶段，r n a 焦磷酸酶把 体内行使活性必需的5 端为三磷酸根的m r n a 切掉一个焦磷酸根使其5 端变为 单磷酸根。在此过程中，真核生物和原核生物略有不同，真核生物在第一个阶段 前必须将3 端的p o l ya 尾先行切掉，才能进行第一个阶段【2 8 3 6 1 。第二个阶段就 是核酸内切酶如r n a s ee ，将第一步产生的5 端为单磷酸根的m r n a 进行降解 【3 刀。( 见图1 3 ) 人们对真核生物m r n a 降解的研究较为深入，在真核生物中行使第一个阶 段焦磷酸酶活性的是d c p l 和d c p 2 焦磷酸酶复合体【3 8 - 3 9 1 ，复合体有开，闭两种 构象( 见图1 4 ) ，两种构象可以互相转换，在发挥焦磷酸酶活性时可能需要闭式 构象【4 0 1 。复合体中d c p 2 是发挥活性的部分，包括有n 端和c 端两部分，其中n 端和d c p l 连接【加】，d c p l 在体外可以提高d c p 2 的焦磷酸酶活性【4 1 】。d c p 2 是一 个n u d i x 家族的蛋白，具有保守的n u d i x 氨基酸序列，并且其n 端序列更为保 守【4 0 越】。在底物类似物a t p 结合到复合体上后，复合体的构象由开式变为闭式， d c p 2 的n 端部分和d c p l 更加接近d c p 2 的c 端部分【4 0 1 。闭式构象的结构可以 形成一个明显的沟槽，保守的n u d i x 序列就位于这个沟槽的腹面，恰好底物类似 物a t p 就结合在复合体沟槽中的n u d i x 保守序列附近( 见图1 5 ) m 】。这个沟槽 被预测为r n a 结合区域【4 3 】。在模拟的r n a 结合图上可以看到，r n a 从沟槽的 腹面绕到了沟槽背面拥有丰富正电荷的区域( 见图1 6 ) 1 4 0 。原核生物m r n a 降 解的研究相对较慢，直到2 0 0 7 年才从到底何种类型的m r n a 能被核酸内切酶降 解的争论中走出，确定原核生物和真核生物一样，都需要m r n a 的5 端由三磷 酸根形式变为单磷酸根形式才能被核酸内切酶降解【4 4 。2 0 0 8 年确定了n u d i x 家 l o m g 师舡人学顿论z 族的r p p h 蛋门在这一过程中发挥了焦磷酸酶的活性m 1 。 二，冬p ， pp n 一 网i3 人肠杆茼r n a 降解；弦赖途衽的机制 f l g u r e l3 m e c h a n i s mo f t h e 5 e n d d e p e n d e n t p a l h w a y f o r r n a d e g r a d a u o n i n e c o h 州l4 d 印lp ，d c p 2 n 复合体与1 个a t p 分，共结晶的闭式( a ) 和升t ( b ) 构孽的朝带图忡1 f i g u r e l4 r i b b o n d l a g r 帅o f d c p l p 1 1 , - p 2 nc o m p l e x i n t h e c l o s e 讲a 1a l l d o p e n ( b ) c o n f i 邢a t l o n c o c r y s t a l l i z e d w i t ho f l e a t p m o l e c u l e 螯 圈i5 a t p 结合在闭式d c p l d c p 2 复台体- 1 1 活悱位点f ”l f i g u r e 5t h e a t p m o c u l e c u l e m t h e a c t i v es i t e o f d c d 】d c 0 2c o m p l e x i n t h ec l o s ec o n f o r m a t i o n aa t p 位r 一个由d c p z c t d ( 篮色) 组成的袋中，n 袋外部为d c n i n ( 绿色) 和d c p 2 n t ( 粉红色) 。ba 削同域放人，a t p 与n u d t x m o t l t f f j 活f e 位点非常接近，b 外凼组成l o o p 环的残壁相接触。 at h e a t p m o l e c u l e i s l o c a t e d i n t h ep o c k e t f o r m e d b y t h e o e p a c t d ( b l u e ) a n de a db y d c p l p ( g r e e n ) a n d d e p 2 n t d ( p i n k ) b c l o s e - u p v i e w o f t h e a t p - b m d t h g p o c k e ta t p i sc l o s e t o t h ea c t i v es i t e o f t h e n u d i x m o t i f a n d m a k e sc o n t a c t w 】mr e s i d u e s f r o m t h e d e n p h e r a l l o o p s 兰 一 m 师范大学硕i 论立 图i6 d e p 2 n 中r n a 结合位点删 f i g n a r e l6 t h e r n a - b i n d i n g s l k o f d c p 2 n ai ) c p l p i ) c p 2 n 复合体闭式构象的表面电荷图。币电荷为蓝色，负电荷为红色。此图由a b p s 生成静电值从j o k t ( 色1 到6 k t ( 蓝色) 。a t p 分彳显示为棍棒模式。四个位于d e p 2 c r d 区域聚集的赣氨酸也被标示。 b 与图a 方位相同的d e p l p d e p 2 n 复合体的闭式构象的表 面观示假定的r n a 站台沟槽。b o xb 区域的飘带圉显示为紫色。一个1 2 个核甘酸组成 的多( a ) m r n a 作为模扳用来显示r n a 结合到这个沟槽的可能方式。 ae l e c t r o s t a t i c p o t e m m ls l i d hr e p m s e n t a h o n o f t h e d e p l p - d e p 2 n c o m p l e x l l l t h ec l o s e d f o r m t h e p o s i t i v e l yc h a r g e ds u r f a c e i sc o l o r e d mb l u ea n d n n e g 毗i v e l yc h a r i o ts u r f a c