（分析化学专业论文）l半胱氨酸自组装膜修饰电极的电化学分析方法及l半胱氨酸谷胱甘肽的光度法测定研究.pdf

l 一半胱氰骏自组装膜修饰l u 檄的l 乜化学分析方法艘l 一半肮氨艘谷胱”肽的光艘法测定研究 摘要 l 一半胱氨酸是2 0 多种天然氨基酸中唯一含有巯基的氨基酸，是存在于各种蛋 白质和许多天然物质中的一种重要生理活性物质，它参与很多重要的生命过程。 l 一半胱氨酸所带的巯基具有许多重要的生理作用，可以缓解药物( 酚、萘、苯、 氰离子) 的中毒，抵抗细胞免于氧化基团的进攻，可增强生物体的抗病能力，广 泛应用于医药，食品及化妆品制造业。 l 一半胱氨酸分子中含有巯基，能够在金电极表面形成自组装膜，已被广泛应 用于自组装膜电化学的研究。自组装膜( s e l 卜a s s e m b l e dm o n o l a y e r s ，s a m s ) 是 分子通过化学键相互作用自发在固液或气固界面形成的一种热力学稳定和能 量最低的有序膜，自组装膜具有明晰的微结构，为电化学研究提供了一个重要的 实验场所，借此可探测在电极表面上分子微结构和宏观电化学响应。自组装膜是 修饰电极发展的最高形式，对其进行研究和表征将对界面电子或粒子转移、生物 电催化、分子或粒子识别与检测及构造第三代生物传感器等具有开拓性的意义， 因而已成为近二十年来研究的一个热点。 本文用l 一半胱氨酸在金电极表面制备了自组装膜修饰电极，用电化学方法对 自组装膜的电化学性质进行了表征，同时系统探讨了自组装膜对亚硒酸钠的电催 化作用，探讨了自组装膜通过对亚硒酸钠的电催化作用使其还原成零价硒的催化 富集机理。并利用负电位下催化富集零价硒，灵敏测定了亚硒酸钠。同时，探讨 了自组装膜修饰电极对抗坏血酸和铜的电催化作用，并应用到分析测定上。本文 还首次利用f e “一邻二氮菲一l 一半胱氨酸，邻二氮菲一f e ”邻二氮菲一谷胱甘肽三元体 系中的巯基和铁的氧化还原作用，探讨了用间接光度法测定l 一半胱氨酸和还原型 谷胱甘肽的定量分析方法。 关键词：l 一半胱氨酸自组装膜修饰电极电催化分光光度法 l 一半胱氰艘白组装膜修饰l 乜檄的 也化学分析方法及l 一半肮氮酸，符胱i r 肽的光度法铡定研究 a b s t r a c t l c y s t e i n ei se s s e n t i a la i i n oa c i d sw i t hi i l a n yb i 0 1 0 9 i c a la c t i v i t i e s a n dt h el _ c y s t e i n er e s i d u e si ni n a n y p r o t e i n st a k ev e r yi n l p o r t a n tr o l ei n 1 i f ep r o c e s s e s t h em a i nb i o l o g i c a li m p o r t a n c eo f t h i sa m i n oa c i di n c l u d e s a n t i o x i d a n to ft h eo r g a n i s m ，a 1 1 e v i a t i o no ft h ed r u gp o i s o n i n gt ot h e h u m a nb o d y ， i m p r o v et h ei 唧u n i t yo ft h eo r g a n i s m r e c e n t l yt h er e s e a r c h o nt h em o d i f i e de l e c t r o d eo fs e l f l a s s e m b l e dm o n o l a y e r ( s a m s )o f l c y s t e i n ei so n eo ft h eh o ti s s u e si nb i o e l e c t r o c h e m i s t r yi na t t e m p tt o u n d e r s t a n de l e c t r o c h e m i s t r yo ft h es u l f h y d r y lg r o u p ， s u c ha sc a t 8 l y t i c p r o p e r t i e st ob i 0 1 0 9 i c a li m p o r t a n te l e c t r o c h e m i c a lr e a c t i o n i nt h i sr e s e a r c hp r o g r a 皿e ，s a m sm o d i f i e de l e c t r o d eo fl c y s t e i n ew a s p r e p a r e da n dt h ee l e c t r o c h e m i c a lp r o p e r t i e so ft h em o d i f i e de l e c t r o d ea s w e l la sa p p l i c a t i o no ft h i s 珈o d i f i e de l e c t r o d et oe l e c t r o c h e m i c a l d e t e c t i o no fb i o l o g i c a li m p o r t a n tm o l e c u l e sh a v e b e e ns t u d i e su s i n g c y c l i cy o l t a f 跚e t r i ca n ds t r i p i n gy o l v a m e t r i cm e t h o d t h ed e 主e r m i n a t i o n s o fl c y s t e i n ea n dg l u t a t h i o n eu s i n gs p e c t r o m e t r i cm e t h o d sh a v ea l s ob e e n s t l j d ie d k e yw o r d ：i 厂c y s t e i n es e l f a s s e m b l e dm o n o l a y e r m o d i f i e de l e c t r o d e e l e c t r o c a t a l y s i ss p e c t r o p h o t o m e t r y l 一半胱氯艘白组装膜修饰i 乜擞的i 乜化学分析方泣及l 一半胱氮酸，谷胱 r 肽的光度法测定研究 1 1 自组装膜研究概况 第一章绪论 自1 9 7 5 年m i l l e r 关于修饰电极的报告发表以来，有关化学修饰电极的研 究不断发展，化学修饰电极是当前电化学、电分析化学方面十分活跃的研究领域。 1 9 7 5 年化学修饰电极的问世，突破了传统电化学中只限于研究裸电极电解液 界面的范围，开创了从化学状态上人为控制电极表面结构的领域。通过对电极表 面的分子剪裁，可按意图给电极预定的功能，以便在其上有选择地进行所期望的 反应，不仅对电极过程动力学理论的发展是一种新的推动，同时它显示出的催化、 光电、电色、表面配合、富集和分离、开关和整流、立体有机合成、分子识别、 掺杂和释放等效应和功能，使整个化学领域的发展显示出广阔的前景。化学修饰 电极为化学和相关边缘学科开拓了一个创新的和充满希望的广阔研究领域。自从 s a g i v 【2 l 等开创性地发现和研究了在固一液界面上，物质自然地“自组”成高度 有序的单分子层的方法以来，利用自组装单分子膜( s e l f a s s e m b l e dm o n o l a y e r s ， 简写为s a m s ) 技术则可以在分子水平上按人们预期的目标进行设计。s a m s 是构 膜分子通过分子问及其与材料问的物理化学作用而自发形成的、熟力学稳定的、 排列规则的单分子膜。它具有均匀一致、高密堆积和低缺陷等特性，并可按预先 设计，通过精确的化学控制获得特定的功能，具有超分子的结构及界面性质。由 于s 埘s 具有有序的分子结构和稳定的化学性质，因此可用于制成传感膜，从而 具有广泛的仿生性即生物亲和性。随着对s a m s 不断地深入研究，人们已成功地 通过各种方式在电极表面进行分子设计以期获得预期的、优异的界面性质。以 s a m s 为基础，通过分子间非共价键力相互作用，进一步修饰自组装膜分子的末 端基团，在电极表面构筑超分子膜，大大扩充了化学修饰电极的应用范围，在电 催化、光电转换、化学及生物传感器等方面具有显著的优点和广泛的应用前景。 近二十年来，s a m s 一直是化学工作者研究的热点之一。 1 2 自组装膜修饰电极的制备、成膜机理及性能 近二十多年来已发展了多种类型的自组装膜修饰电极。自组装膜修饰材料从 1 l 一半胱氨酸自组装膜修饰电檄的电化学分析方法及l 一半胱氨酸，谷胱什肽的光度法铡定研究 有机硫化物拓展到了脂肪酸、有机硅烷、磷酸酯等，电极材料则涉及到多种会属 ( 如金、银、铜、铂、汞等) 和金属氧化物( 如a l 籼、a g o 、f e 籼等) 。其中， 以对金表面有机硫化物自组装膜的研究最为全面1 3 7 i 。s a m s 修饰电极的制备过程 非常简单，只需将电极浸泡到构膜分子溶液中或者是在电极表面滴加构膜分子溶 液，放置所需时自j ，再用溶剂冲洗电极表面以除去表层未吸附到的构膜分子，即 得到s a m s 修饰电极。构膜分子的结构、浓度，基底的种类以及组装时间将影响 所得单层膜的表面密度等膜性能参数。 s a m s 是稀溶液中有吸附活性的物质在固体表面形成的有序分子组织，其基 本原理是通过固液界面化学吸附或反应，在基底上形成化学键连接的、取向一 致、紧密排列的二维有序单层膜1 8 】。整个组装过程有三种类型的作用力在发挥作 用，它们是长链有机分子的端基在基底上强烈的化学键合作用，成膜分子链间的 范德华力相互作用，以及分子链上特殊官能团之间的相互作用。这三种不同性质 的相互作用，推动了自组装过程，也促进了构膜分子在电极表面上由无序到有序 的重组，以致最终形成致密、稳定、有序的单分子层【8 l 。椭圆偏光法，接触角测 定法，电化学法等非现场方法及现场的石英晶体微天平均表明，硫醇在金表面的 自组装分两步【9 】：首先是快速的化学吸附过程，在短短几分钟内，接触角接近或 达到最大值，石英晶体微天平测得的频率改变值( 质量改变值) 接近极限值，自 组装完成8 0 一9 0 ，该过程受构膜分子活性基团与基体材料表面的反应速度 控制，符合一级反应动力学方程，在此阶段，膜的组装时自j 与成膜物质的浓度有 关，一般情况下，浓度越大，组装越快。第二步为较慢的表面重组过程，即从无 序态到规则排列，一般持续数小时或者更长。该过程既有化学吸附，又有活性基 团在基体表面的移动及链上基团间的相互作用，这与自组装膜的混乱度、链上的 不同基团及端基在基体材料表面的移动性能有关。b a i n 等认为快速吸附生成不 完美的单层膜，而后是慢步骤，包括在未吸附的位置吸附硫醇，硫醇在金表面的 侧向扩散以减少缺陷增加致密性及硫醇长链的固结，可能还包括取代污染物及将 溶剂从单层膜中排出( 通常吸附时间足够长时溶剂能从单层膜中排出) 。研究表 明，较长的烷基链或引入具有较强吸附作用的特殊官能团均能促进自组装膜的形 成。 2 l 一半胱氨醴自组装膜修饰电极的电化学分析方法及l 一半胱氨酸，谷肮盱肽的光度法测定研究 1 3 自组装膜电极的研究内容及其膜的表征 1 3 1 自组装膜的研究内容 自从八十年代初报道硫醇s a m s 以来，人们对其进行了广泛的研究，研究的 内容主要有两个方面：膜本身的物理与化学性质( 包括成膜动力学) 和膜表面物 理与表面化学。 1 膜物理与化学性质主要研究膜的物理结构及成膜的吸附动力学过程等 ( 1 0 i 。这些研究包括：( 1 ) 单层与基底的关系，s a u 键的键能、键角、膜厚度与 覆盖度等。( 2 ) 单层结构及层内分子间的相互作用，如分子间距离、分子排列点 阵结构、分子结构组成与分子取向、分子间相互作用与微聚集相。( 3 ) 单层外表 面及其与环境的关系，如基团尺寸的大小、极性、变形性与取向、反应活性及表 面自由能等。( 4 ) 不同基底表面结构上吸附物质的吸附行为、过程、机理与影响 因素等。( 5 ) 膜的隧道效应、通透性及缺陷。 2 表面物理与表面化学对膜的物理化学特性的研究主要是弄清s a m s 的结 构特征，成膜机理及特有的物理化学性质。只有对膜本身的性质认识清楚之后， 才能进一步深入探讨s a m s 在其它领域的应用。s a m s 表面物理与表面化学就是在 前者深入研究的基础上建立起来的，主要研究s a m s 与其它物质的相互作用。s a m s 表面物理是指s a m s 与其它物质的物理作用过程。s a m s 表面化学是指s a m s 通过 化学过程与其它物质相互作用。s a m s 是一种二维单分子层，其结构和表面性质 可以灵活的加以控制，可用于研究分子识别、电催化、传感器与分子器件等。 1 3 2 自组装膜的表征 单分子层的表征不外乎三方面，即单层与基底的关系，如硫金键键能、键角 及不同基底材料上含硫化合物的吸附行为等；构成单层的分子间的关系，如分子 间距离与分子排列点阵结构、分子结构与分子取向、分子间的相互作用与分子聚 散的关系；单层外表面及其与环境的关系，如烷基的大小、极性、变形性与取向、 反应活性及表面自由能等。除传统的电分析技术如循环伏安法、计时电流法、交 流阻抗谱、计时电位法等用于s a m s 的表征外，几乎所有可用作表面分析的方法 和技术都可用来表征s a m s 【2 。3 。19 1 。如接触角( c o n t a c ti n ga n g l e ) 测量膜的亲 l 一半胱氮酸自组装膜修饰f h 极的电化学分析方法及l 一半胱氮酸，谷肮忱的光度往铡定研究 水亲油性、椭圆偏振( e 1 1 i p s 鲫e t r y ) 来测量膜的厚度、用扫描隧道显微镜( s t m ) 、 原子力显微镜( a f m ) 、界面力显微镜( i f m ) 等来观测膜的表面形貌，用来证实 s 删s 的形成机理，表明a u 表面的单分子上观察到的针孔，可能是浸蚀过程的结 果。用红外反射吸收光谱( i r r a s ) 、表面增强拉曼谱( s e r s ) 、x 一射线光电子 能谱( x p s ) 、x 一射线衍射( x r d ) 、电子衍射( l e e d 及h e e d ) 等来测量膜的元素 组成和状态以及构膜分子在基底表面的取向、排列等。 1 3 3 自组装膜修饰电极的应用 自组装膜结合了化学吸附的稳定性与l b 膜的有序性，能满足模型界面研究 的主要要求：与基底结合牢固、可控的分子取向和有序排列，可控的外表面性质、 可控的厚度、可控组成与结构。因而其在润滑、防腐、腐蚀、蚀刻、电子转移、 分子器件、非线性光学等众多领域有广泛的应用前景l l o2 1 驯。自组装膜修饰电 极实现了从分子水平上构造理想界面，因而在以电极溶液界面上的各种电化学 反应为研究对象的电化学分析领域有很好的应用价值。目前自组装膜的研究工作 主要集中在膜表面的电子传输、电催化、分子识别、生物传感器、离子选择性电 极、电位传感器等方面的应用。另外s a m s 修饰电极在其它领域也得到了应用， 如： 在液相色谱中的应用：s 栅s 修饰电极由于具有特殊的微环境、高稳定性、 优良的表面结构和对表面反应的选择性等优点，己开始应用于分析测试中，特别 是在流动体系中的应用f 2 4 i 。 在光谱电化学中的应用：各种光谱电化学技术已广泛地应用于s a m s 的结构 研究中，主要是红外光谱电化学、表面增强拉曼光谱电化学、扫描隧道显微镜和 原子力显微镜等新型发展起来的技术。 1 4 本文选题思想及主要研究内容 1 4 1 选题思想 半胱氨酸是重要的生物活性物质，是活性蛋白质和谷胱甘肽等活性寡肽的重 要成分。这些含有半胱氨酸的蛋白质和寡肽，其主要生物活性取决于半胱氨酸残 基中的巯基的氧化还原特性。如：1 ) 许多蛋白质的折叠是通过半胱氨酸残基中 4 l 一半胱氨艘自组装膜修饰f 乜极的电化学分析方法及l 一半胱氰酸，谷胱i r 肚的光度法测定研究 的巯基和二硫键的氧化还原交换反应来完成的。2 ) 蛋白质和谷胱甘肽中的半胱 氨酸的巯基的氧化还原平衡，对生物体内由于氧化胁迫引起的自由基的清除，生 物体对氨基酸的转换和吸收都有至关重要的作用。因此，研究半胱氨酸的巯基 的氧化还原特性，模拟生物氧化还原过程，来进一步深入理解生命过程有着重要 的意义。近年来，硫醇分子( 像半胱氨酸) 自组装单分子膜修饰电极模拟生物膜 的电化学研究已经引起人们的广泛的注意。这种单分子膜修饰电极，对许多生物 电化学过程具有催化作用，这些研究对生命过程的机理研究和疾病的防治，延缓 衰老都有重要的指导意义。 本研究的主要目的是，通过制备l 一半胱氨酸的单分子自组装膜修饰电极，研 究其与生物活性小分子如；亚硒酸钠，抗坏血酸等的电化学作用及其作用机理。 尤其是通过电化学方法探讨巯基和硒的催化氧化还原作用，这对硒的生物学功能 的进一步探讨具有重要的意义。同时本研究中，还利用f e 虬o - p h e n 体系对两种 巯基化合物l 一半胱氨酸，还原型谷胱甘肽进行了分析测定的研究，为简单多肽 的测定提供了一种简便、快捷的测定方法。 1 4 2 研究内容 ( 1 ) 含氮的有机物有利于作为金属离子的配体，可用于检测多种金属离子， 本文用自制的l - 半胱氨酸自组装单分子膜修饰电极测定了c u ”，亚硒酸钠、抗坏 血酸。在试验中分别筛选了各种体系的最佳实验条件，研究了它们在电极表面的 电化学行为，并对机理进行了初步探讨。 ( 2 ) 巯基化合物在生物过程中起着重要的作用，如半胱氨酸和谷胱甘肽， 在生物的新陈代谢过程中具有十分重要的生理意义。半胱氨酸在生物体内参与细 胞的还原过程，具有调节肝脏内磷脂的代谢和保护肝脏细胞免受毒物损害等功 能。半胱氨酸的代谢失调和在生物体内含量的变化会导致一些疾病的发生，同时 半胱氨酸( c y s t e i n e ，c y s ) 为兴奋性氨基酸，也是一种神经介质，作用于n m d 受体会引起死亡。半胱氨酸的分析对生物化学研究及临床诊断都有重要的意义。 还原型谷胱甘肽( g l u t a h i o n e ，g s h ) 是体内重要抗氧化剂，它可以清除体内过量 的自由基，在防卫机体免受自由基伤害、抗肿瘤及抗衰老等方面均有重要作用1 2 “， 而且具有抵抗由酪氨酸诱导的神经毒性作用等1 2 “。 目前检测巯基化合物的方法主要有光度法【2 7 2 9 】、色谱法【3 、和免疫发光法 5 l 一半胱氨酸白组装膜修饰电极的电化学分析方法及l 一半胱氨酸，谷胱u 肽的光度法测定研究 【3 2 1 ，电化学分析法【3 3 1 ，化学发光分析法彤】，及毛细管区带电泳法【3 5 1 等，但这些 方法的灵敏度低且需要复杂的预处理。本文同时参考f e ( ) 一邻二氮菲氧化体 系的应用3 们s 】，还研究了f e ( ) 一邻二氮菲与毓基化合物l 一半胱氨酸、还原型 谷胱甘肽的反应，该反应生成桔红色f e ( 1 i ) 的螯合物在5 1 0 n m 处有显著吸收， 可用于间接测定反应物中的毓基化合物。 6 l 一半胱氧酸自组装膜修饰电极的电化学分析方法及l 一半胱氰艘，谷胱”肽的光度法测定研究 第二章l 一半胱氨酸自组装膜修饰电极对硒的催化富集及其 分析应用研究 2 1 引言 自组装膜( s a m s ) 是构膜分子通过分子日j 及其与基体材料间的物理化学作用 而自发形成的一种热力学稳定，排列规则的单( 或多) 层分子膜。分子自组装修 饰电极可按预先设计在电极表面上形成具有特殊功能的单分子层结构，这对仿生 界面，分子识别和选择性响应等生物电化学研究都有重要的意义。自组装膜修饰 电极，其中硫醇类分子是研究的最为广泛的一类体系。l - 半胱氨酸自组装膜修饰 电极是近年来研究比较多的单分子膜修饰电极，其氧化还原特性和对各种生物活 性物质的催化氧化还原作用的研究，对生物体内的蛋白质的折叠及其生物学功 能，抗氧化机制等生物学功能的理解有着重要的意义【3 9 枷1 。近年来，利用l 一半 胱氨酸修饰电极电催化作用应用于电化学分析也见报导【4 卜4 外，但其电催化机理尚 需进一步地探讨。 本实验利用l 一半胱氨酸分子在金电极表面的自组装修饰电极为工作电极，通 过比较与裸金电极上硫酸底液中亚硒酸钠溶液的电化学性质，探讨了电化学催化 还原富集亚硒酸钠为零价硒的反应机理。在一o 2 v ( v s s c e ) 电位下富集后，在 0 o v 1 3 0 v 范围内进行循环伏安扫描，修饰电极上的阳极溶出峰( e 。= 0 9 9 v ) 电 流比裸金电极上的溶出电流明显的增大。因此，作者认为，自组装膜上的硫在外 加电位的作用下催化还原四价硒并富集零价硒( s e 。) 于电极表面，催化富集的 s e o 的氧化溶出峰可灵敏的检测s e ( i v ) 的含量。 2 2 实验部分 2 2 1 仪器与试剂 e g em o “1 2 7 3 电化学系统( 美国) ，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参 比电极，以金盘电极( 或l 一半胱氨酸修饰电极) 为工作电极。l 一半胱氨酸( 购 于武汉贝尔化学试剂生物有限公司) 储备液：浓度为0 0 l m 0 1 l ；n a 2 s e 仉标准液 7 l 一半眺氨酸白组装膜修饰电极的电化学分析方法及l 一半胱氨酸，箨胱i | 肽的光度法测定研究 o o lm o l 几：精确称取n a 2 s e 砚0 0 8 6 0 9 ，溶于5 0 m l 容量瓶中，准确稀释至刻度。 锌硒宝( 上海奥健生物科技有限公司) 。其它试剂均为分析纯，实验用水为二次 蒸馏水。 2 2 2 l 一半胱氨酸自组装膜修饰金电极( l c y sa u 8 删s ) 的制备1 用小号金相砂纸将会电极表面磨光，依次用o 1i lm 和o 0 5pma 1 。国粉末将 金电极表面抛光，用水清沈后，放入p i r a n h a 溶液( 3 0 h 0 2 ：浓h ：s 仉，体积比 为l ：3 ) 中浸泡1 5 m i n ，然后分别用无水乙醇、水超声清洗5 m i n ，置于o 0 2m o l 几 的l 一半胱氨酸中，通氮除氧l o m i n 后，通氮情况下浸泡2 4 h ，取出沈净电极表面， 即制得l c y sa u s a m s 修饰电极。 2 2 3 实验方法 将三电极插入含有o 0 5 m o l 几h 。s q 介质和不同浓度的n a 书e n 溶液中，在 - o 2 v 处搅拌富集1 m i n ，静置3 0 s e c ，然后在0 o 1 3 v 间以2 8 0 m v s 进行循环 伏安扫描，记录其伏安曲线，所有实验均在室温下进行。 2 3 结果与讨论 2 3 1l c y sa u s a m s 的电化学特性 0 0 5 m 0 1 lh 2 s 0 4 溶液中，在0 o o v 1 3 0 v ( v s s c e ) 范围内，对裸金电极和 修饰电极的循环伏安特性进行了比较( 见图2 1 ) 图2 1 裸金电极在o 0 5 l 几h 矗0 t 溶液中的吖翻( ) 和 修饰电檄在0 0 5 1 l 峪仉溶液中连续两次扫描的c v 图( b ) 8 l 一半胱氨艘自组装膜修饰l u 檄的i 乜化学分析方法及l - 半胱氰艘，谷胱 r 肽的光度法测定研究 图2 1 a 结果表明，裸金电极在1 1 5 v 开始有明显的金的氧化电流出现，在 e p - 0 8 9 v 处有电极表面生成的金的氧化物的还原峰。当金电极表面修饰了l 一半 胱氨酸单分子膜后( 图2 1 b ) ，除了上述会和金的氧化物的氧化还原峰有明显增 加之外，当电位负向扫描时，o 3 3 v 处有另外一个还原峰出现。作者认为，这一 个还原峰是电极表面单分子膜( a u s ) 中的硫在外加电位的作用氧化，其氧化产物 的还原峰。l c y sa u s a m s 修饰电极在同样的条件下连续两次扫描时，第二次扫 描时，o 8 9 v 处开始的还原电流，随扫描次数的增加而减小，而峰电位在0 3 3 v 的还原电流无明显的变化。说明a u s 的硫发生氧化作用可能没有以氧化脱附的 形式离开电极表面来破坏单分子膜，而是以硫的氧化物的形式滞留在电极表面或 吸附在电极表面上，当电位还原扫描时这些氧化物重新还原产生e p = o ，3 3 v 出的 还原电流。 2 3 2 n a ：s e 0 。在l c y sa u s 圳s 修饰电极上的电化学性质的研究 图2 2 为裸金电极和自组装膜修饰电极在含有l 1 0 1 几n a 2 s e 如的 o 0 5 m 0 1 lh 2 s 0 。溶液中，o o o v 1 3 0 v ( v s s c e ) 范围内的循环伏安图。 孑 辛 图2 - 2 裸金电极上l x l 0 l l n a 墨e 如溶液在0 0 5 呻l 几地s o 溶液中的c v 圈( ) 修饰金电极上l x l 0 l 几s e m 溶液存0 ，0 5 l 儿l 岱0 溶液中的c v 图( b ) 图2 2 结果表明，在裸会电极上，在峰电位1 0 3 v 处观察到在较负电位下 沉积在金电极上的零价硒的阳极溶出峰。a n d r e w s f 4 j j 等指出，这种零价硒在负电 位下是以单分子膜的形式沉积在金电极表面上的。在修饰电极上硒的溶出电流明 显增加，而且峰电位负移0 0 4 v ，同样的单质硒沉积过程的溶出氧化峰来说，裸 金电极的电极作用面积更大，但其氧化峰电位比其修饰电极大，而溶出电流比起 9 l 一半胱氨艘自组装膜修饰电极的电化学分析方法及l 一半胱氰酸。谷胱盯肽的光度法测定研究 修饰电极的要小，意味着l _ c y sa u s a m s 修饰电极对硒的沉积过程和溶出过程可 能有催化作用。 2 4 机理初探 a n d r e w s 【4 3 1 等认为，裸金电极上的硒的氧化溶出峰是s e ( i v ) 在较负的电位下 在金电极表面上沉积成单质硒所致这种单质硒的沉积过程，虽其机理尚不清楚， 但沉积量不超过电极表面单分子层相当的量。在l _ c y sa u s a m s 修饰电极上，由 于金电极表面上的硫原子，在较负的电位下带有较多的负电荷，容易通过硫原子 把电子传递给s e ( i v ) 使其还原成单质硒。作者认为其还原机理类似于g a n t h e r 等提出的生物体内的谷胱甘肽和硒的催化反应机理。 k e s s i 等m 1 认为，亚硒酸和含巯基寡肽谷胱甘肽( g s h ) 作用，生成二价硒 化物，硒代过硫化物。硒代过硫化物在谷胱甘肽还原酶和n a d p h 作用下，进一步 还原成硒代谷胱甘肽阴离子，这一阴离子在质子作用下，岐化成零价硒和谷胱甘 肽，见下式。 4 g s h + h 2 s e 0 3 一g s _ s 瞄g + g s s g + 3 h 2 0 c - - 扣h j 伸tr e d t c n g s s e 焉g + n a d p h _ 一g s h + g s - s r + n a d p + g s - s e + h + 一 g s h + s e o 把生物体内的硫和硒的电子传递模式应用到l c y sa u s a m s 修饰电极在亚 硒酸钠溶液中的半电极反应，可推测在负电位下富集s e 。的作用机理如下，见下 图： 卜z 蒈h 隅转一t 蒈一 扣蕾产掺_ 才溯：静“碧警z 话一 ( i ) ( i i ) ( i i i ) 作者认为，修饰电极和硒之间的电子是通过a u s 界面上的硫原子传递的。在 相对较负的电位下，亚硒酸钠还原，与电极表面的硫结合形成类似于硒代过硫化 物的中问产物( i ) ，在负电位作用下，中间产物( i ) 进步还原形成硒代半胱 l o 争皆 嘞 o 一 挚一母 卜p 门 l 一半胱氪酸自组装膜修饰电檄的电化学分析方法及l 一半胱氨酸，谷胱i t 肽的光度法测定研究 氨酸阴离子，这种阴离子自发发生岐化反应，生成零价硒，并沉积在电极表面。 这种反应在单分子膜修饰电极上进行的可毹性是存在的。因为，近年来的研究表 明，金电极上的l _ c y s 单分子膜，不是排列得很紧密的，而是分子问具有很多空 间的簇状结构。因此，亚硒酸钠分子，可以充分渗透到单分子层和金电极界面和 硫原子进行上述的电子交换反应。 2 5 分析应用 2 5 1 富集电位的影响 将修饰电极置于1 o l o m o l l 的亚硒酸钠溶液中，在一o 6 0 v o 6 v 范围 内预先富集，然后从0 0 v 到1 3 v 方向进行扫描，出现在0 9 9 v 处的硒的阳极 溶出峰，随富集电位的变化而发生变化，结果见下图2 3 圈2 3 富集电位和峰电流的关系 图中结果表明：s e o 的溶出电流，在预富集电位o 0 v 一0 2 0 v 范围最大，小 于一o 2 0 v 的富集电位，反而使溶出电流减小，这可能是因为较负的电位下亚硒 酸钠还原成s e ，使得s e o 富集量减小有关，所以本实验富集电位选为一0 2 v 。 2 5 2 扫描速率的影响 在0 0 5 m o l l 的h 2 s 0 。底液中加入1 o 1 0 。5m 0 1 几的n a 2 s e 仉溶液，在不同 扫描速率下进行扫描，结果发现，峰电流随扫速的增加而增加。在3 0 3 30 l l l v s 扫速下，峰电流与扫速成下比( 如图2 一4 a ) ，以i ，v ”作图，曲线偏离直线向上 弯曲( 如图2 4 b ) 。这说明反应是受表面吸附过程控制的，即反应是与电极表面 l 一半耽氰酸自组装膜修饰电极的电化学分析方法及l 一半胱氨酸谷胱计肽的光度法测定研究 上s e 。的沉积吸附有关，而不是与溶液中的硒的扩散过程有关。 孑 3 圈2 _ 4s e o 的氧化峰峰电流与扫描速率的关系曲线 2 5 3 富集时间和s e 氧化溶出电流的关系 将电极置于1 o 1 0 m 0 1 l 的n a 茄e o l 溶液，一o 2 v 处分别富集3 0 s ，6 0 s ， 1 0 0 s ，峰电流随着时间的增长而增大，说明随着富集时间的增加，有更多的单质 硒沉积在电极表面，6 0 s 后峰电流达到最大值，此后峰电流趋于平稳，说明6 0 s 后单质硒的富集趋于饱和。如果未作其它说明，本实验的测定选择富集时间为 6 0 s 后的测定结果。 2 5 4 底液的影响 分别试验了磷酸盐缓冲液，氯化钾溶液，醋酸缓冲液，b r 缓冲液，硫酸溶 液，发现在o 0 5m 0 1 lh 2 s 吼溶液中背景电流较小，且峰值电流最大，本实验中 选用0 0 5 l 几h o 。溶液作为支持电解质。 2 5 5 硒的溶出峰电流与n a ：s e 0 。浓度的关系 在最佳实验条件下，测定了峰电流与亚硒酸钠的浓度的关系，结果表明，在 n a 2 s e 如浓度为5 0 x 1 0 4 4 o l o m o l l 范围内可用于定量测定。其中2 o 1 0 4 8 0 l o 0 1 几n a 2 s e o ，浓度范围的伏安曲线及线性关系如图2 5 所示。线 性回归方程：y = 3 8 3 2 2 3 + 2 9 0 4 8 l x ，相关系数r = o 9 9 8 7 4 。最低检测限为1 o 1 0 1 1 几( 信噪比为3 ) 。 j 2 l 一半胱氪酸自组装膜修饰屯极的电化学分析方法及l 一半胱氨酸，谷胱甘肽的光度法测定研究 图2 - 5n 稿e 凸在l - c y s u s 删s 电极上的浓度峰电流图n a 墨e 仉浓度：2 1 0 肿l 几 5 x 1 0 l l ：8 1 0 帅l 几；3x 1 0 l 儿；5 1 05 肿l 几：8 1 05 肿l 几 2 5 6 l 叼y sa u s a m s 电极稳定性和测定的精密度 将制备好的l c y sa u s a m s 电极放在冰箱中保持段时间后，分别测定1 o l o m o l 几的n a 。s e 0 。在l c y sa u s a m s 电极上的溶出电流，峰电位和峰电流在 3 0 小时内基本不变，超过此时间，由于空气中氧的作用，自组装膜渐渐被破坏。 同一根电极氧化扫描后，用二次蒸馏水淋洗，可以重复使用。 同一根l _ c y sa u s a m s 电极，对1 o l o 0 1 l 的n a 2 s e o s 进行1 0 次伏安测 定，r s d 为3 2 ， 2 5 7 干扰试验 本实验条件下1 l o 。6m 0 1 l ，n a 2 s e 0 溶液中，分别试验了“，f e ”，c u 2 + ， c a z + ，z n 2 + 等离子对硒的测定的影响。8 倍的c a ”，m g ”，f e ”，z n 2 + 对测定无影 响。c u ”对测定有增敏作用。 2 ，5 8 实际样品测定 取市售片剂锌硒宝5 片，研细，精确1 8 0 0 0 9 于锥形瓶中，加入硝酸，高氯 酸( 体积比为4 ：1 ) 的混酸消化过夜，次日于电炉上低温加热，冷却，再加5 m 1 6m 0 1 l 的h c l ，继续加热至溶液变为无色，并伴有白烟生成，使样品中的硒全 部转化成可测定的四价硒，玲却，定容于5 0 m l 容量瓶，备用。取前边备用液l m l 置于2 5 m 1 容量瓶中，采用标准加入法对锌硒宝样品中硒的含量进行测定，结果 l 一半胱氨酸自纽装膜修饰屯檄的电化学分析方法及l 一半胱氰酸，徉肮 r 肽的光度法测定研究 综上所述，l 一半胱氨酸自组装膜修饰电极对s e ”的测定具有较高的灵敏度和 良好的重现性，并且可以用于实际样品的测定，方法简单。 1 4 l 一半肮氪酸自组装膜修饰电极的也化学分析方法及l 一半胱氨酸，谷胱廿肽的光度法测定研究 第三章l 一半胱氨酸自组装膜修饰金电极上抗坏血酸的电 化学行为 3 1 引言 抗坏血酸( 维生素c ) 是维护机体f 常生理功能的重要维生素之一，广泛存 在于蔬菜和水果中，人体不能自身合成，抗坏血酸参与机体氧化、还原等复杂代 谢过程，能促进生长和抗体的形成，增强免疫活性，所以对抗坏血酸的检测非常 重要。对它的测定方法有紫外分光光度法1 4 5 7 1 、化学发光法【4 8 删、和脉冲极谱 法【5 0 j 。化学修饰电极对抗坏血酸的电催化氧化也有较多研究，谷氨酸【5 l l 、中性 红f 翊、2 一氨基吡啶i 5 3 1 、环糊精【5 4 j 及苯醌【5 5 】等均已用于修饰电极来测定抗坏血酸。 本文研究了抗坏血酸在l 一半胱氨酸修饰金电极的电化学行为。采用循环伏安法 对抗坏血酸进行定量测定，对实验条件进行了优化，建立了一种简便、快速分析 测定抗坏血酸的方法。对维生素c 丸中的抗坏血酸测定，结果令人满意。 3 2 实验部分 3 2 1 仪器与试剂 e g em o d e l 2 7 3 电化学系统( 美国) ，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参 比电极，以金盘电极( 或l 一半胱氨酸修饰电极) 为工作电极。 卜半胱氨酸( 购于武汉贝尔化学试剂生物有限公司) ：储备液浓度为 0 o l 肿l l ；抗坏血酸标准液o o lm o l 几：精确称取抗坏血酸o 0 8 8 9 ，溶于5 0 l l i l 容量瓶中，准确稀释至刻度。其它试剂均为分析纯，试验用水为二次蒸馏水。 3 2 2 修饰电极的制备 首先用小号金相砂纸将金电极表面磨光，依次用0 1i lm 和0 0 5pma 1 籼粉末 将金电极表面抛光，用水清洗后，放入p i r a n h a 溶液( 3 0 h 。0 2 ：h 2 s 0 4 ，体积比为 1 ：3 ) 中浸泡1 5 m i n ，然后分别用无水乙醇、蒸馏水超声清洗5 m i n ，最于o 0 2i i l 0 1 l 的l 一半胱氨酸中，通氮除氧1 0 m i n 后，在通氮情况下浸泡2 4 h ，取出洗净电极表面， l 一半胱氧酸自组装膜修饰电极的电化学分析方法及l 一半胱氪酸，谷胱 于肽的光度法测定研究 舢卜n 厂c n h 卜s _ c n _ c n h 3 3 结果与讨论 3 3 1l 一半胱氨酸修饰金电极对抗坏血酸的电催化作用 抗坏血酸在裸金电极和l 一半胱氨酸修饰金电极上的循环伏安图如图3 2 所 示。在所研究的电位范围内，抗坏血酸在裸金电极上没有明显可观察到的电化学 响应，说明抗坏血酸几乎不能在实验条件下与电极表面发生直接的电子传递，抗 坏血酸在l 一半胱氨酸修饰电极上，可观察到一峰形很好的氧化峰，同时可明显地 观察到还原峰的存在，曲线2 中，k = o 2 5 6v ，k = o 1 9 4v ( v s ，s c e ) ，峰电位 差e d = 6 2 m v ，说明电子传递反应是一个准可逆的过程 1 6 l 一半胱氟酸自组装膜修饰i 乜撤的l 乜化学分析方法及l 一半胱氰艘，孕 胱i r 肽的光度法测定研究 e ，m v i v s s c e ) 图3 2 抗坏血酸存裸金电板( 1 ) 和修饰金电极( 2 ) 上的循环伏安图 l - c y s a u 修饰电极对抗坏血酸存在明显的电催化作用，可能是l 一半胱氨酸 分子中的氮原子与抗坏血酸中的羟基形成氢键，电子通过n h o 键传递，从而使 羟基活化，削弱o - h 键的键能，使之更容易被氧化。可能的电极反应为： h o c h 2 c h ( h o c h 2 c h ( 3 3 2 溶液的酸度对峰电流的影响 o + 2 h + + 2 e - 分别在n a c l ，柠檬酸、b r 、n a a c 一姒c 、i ( h 。p 吼一n a 2 h p 0 t 等支持电解质中考察 了l 半胱氨酸修饰金电极上抗坏血酸的伏安特性，结果表明：p h 值在3 2 6 2 范围内的n a a c h a c 体系中，峰形好，峰电流稳定，背景电流低，所以本实验选 择n a a c h a c 体系为支持电解质。 图3 3 为其它实验条件相同的情况下，p h 值与循环伏安曲线峰电流的关系， 在p h = 4 0 时峰电流达到最大值，故本实验选择0 1 1 l h a c n a a c ( p h = 4 0 ) 缓冲溶液为支持电解质。 1 7 l 一半胱氰酸白纰装膜修饰电极的 u 化学分析方法及l - 半胱氰腔，谷胱i r 肽的光度法铡定研究 圈3 3 支持电解质的酸度对峰电流的影响 3 3 3 富集条件对峰电流的影响 3 3 3 1 富集电位的影响 在一0 6 o 6 v 范围内进行开路富集扫描，发现富集电位是一0 2 v 时，峰电流 最大( 如图3 4 a 所示) ，这可能是因为在此条件下，抗坏血酸与修饰电极表面的 一n h 。+ 、一c o o h - 更易形成氢键，使得在相同的时间内，扩散到电极表面并被吸 附的量增多，从而提高了检测灵敏度，所以选择富集电位为一o 2 v 。 3 3 3 2 富集时间的影响 富集时间对抗坏血酸在l - c y s a u 电极上的氧化电流的影响很大，在最佳酸 度条件下将电极置于5 0 1 0 。6m o l l 的抗坏血酸溶液中分别开路富集3 0 s ，l m i n ， 2 m i n ，3 m i n ，4 m i n ，6 m i n ，峰电流与富集时间的关系如图3 4 b 所示，从图中我们可 以看到随着富集时间的增加峰电流也在逐渐增大，4 i n i n 以后，峰电流趋于平稳， 说明4 m i n 以后对抗坏血酸的富集已逐渐趋于饱和。故本实验选择富集时间为 4 硼i n 。 1 8 l 一半胱氨艘自组装膜修饰也极的i u 化学j 惭方法发l 一半肮氰腔，谷胱lr 肚的光度法测定研究 o 口4 - o 2o oo 2o o v ，v 图3 4 富集电位对峰i u 流的影响3 4 b 富集时问对峰i 乜流的影响 3 3 4 线性范围、检出限和重现性 在p h - 4 0 的o 1m 0 1 几醋酸缓冲溶液中，不同浓度的抗坏血酸循环伏安曲线 如图3 5 a 所示，其浓度在4 o 1 0 1 7 0 1 0 。i i l o l l 范围内与峰电流成线性关系 ( 如图3 5 b 所示) ，线性回归方程为i 。( 雌) = 0 4 9 1 3 3 + o 1 9 9 3 5 c ，相关系数 r = o 9 9 8 8 。当信噪比为3 时，检出限为1 0 l o 。1 l 。 同一支l 一半胱氨酸修饰电极在5 份同样的抗坏血酸溶液中测定，5 次测定的峰 电流相对标准偏差为3 8 修饰电极对抗坏血酸的分析测定具有良好的重现性。 图3 _ 5 不弼浓度的抗坏肌酸在也撮l 的c v 图图3 5 b 浓度吁峰电流的线性关系 1 9 l 一半肮氰酸白组装膜修饰屯极的电化学分析方法及l 一半胱氰腔，谷胱”肽的光度法测定研究 3 3 5 干扰实验 在选定的实验条件下，针对食品中和药物中可能存在的干扰组分，考察了以 下物质对抗坏血酸测定的影响。对5 1 0 0 1 l 的抗坏血酸，下列共存物质对实 验不干扰：1 0 0 倍的葡萄糖、乙酸；6 0 倍的淀粉、柠檬酸：简单金属离子( 如k + 、 n a + ) 、酸根离子( 如s 仉2 。c o f ) 。可见大多数常见物质不产生干扰，方法具有较 好的选择性。 3 3 6 实际样品测定 取抗坏血酸片剂( 1 0 0 i i l g 片) 1 0 片，剥去糖衣，精密称量、研细，准确称取 o 1 7 6 l g ，水溶后，定容于l o o 硼l 的容量瓶中，采用标准加入法测定维