（有机化学专业论文）核酸与杂环阳离子荧光探针的相互作用研究.pdf

同济大学理学硕士学位论文摘要 摘要 本文应用紫外和荧光光谱法研究了核酸及其前体与荧光探针之间的相互作 用，主要研究内容如下： 1 研究了核酸( c t - d n a 、s s d n a 、y r n a ) 及其前体核酸碱基( 腺嘌呤、 次黄嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶) 核苷( 鸟苷、脱氧鸟苷、尿苷、脱氧 尿苷) 对电子受体探针l0 - m e a i 的动态与静态荧光淬灭研究发现，其荧 光淬灭速率常数接近扩散控制( 1 0 加m 叫s 1 ) ，说明核酸及其前体基态作为 电子给体与受体探针激发单重态的相互作用具有电子转移( e t ) 的性质。碱基 淬灭能力大小为：a n d u m t h y c y t h x t ： 核苷淬灭能力大小为： d g s g s d u r u r ；核酸淬灭能力大小为：e t d n a y - r n a s s d n a 。 2 ，利用紫外吸收和荧光光谱，在恒定温度和p h 值条件下研究了10 m e a i 荧光探针与c t d n a 之间的相互作用与机理。实验结果表明，当荧光探针与d n a 结合时，其荧光发生强淬灭，紫外吸收光谱出现减色和红移现象，同时存在明 显的盐效应。不存在1 0 - m e a i 时，c t - d n a 的熔化温度( t m ) 为7 8 ，而当加 入1 0 m e a i 时，其熔化温度升高到8 4 ，说明1 0 一m e a i 与c t d n a 发生相互作 用后，增强了d n a 结构的稳定性。通过三种不同的方法测得它们之间相互作 用时的表观结合常数在( 1 。4 5 5 ) x1 0 4m 叫范围，相互验证了数据的准确性，同 时测得结合点位数为2 。综合以上实验数据及现象，证明了荧光探针1 0 m e a i 与d n a 相互作用为平行插入和静电结合混合作用模式，其中前者为主要的作 用模式。 同济大学理学硕士学位论文摘要 a b st r a c t i nt h i st h e s i s ，t h ep h o t o c h e m i c a li n t e r a c t i o no fs o m en u c l e i ca c i dp r e c u r s o r s ( n u c l e o b a s e ，n u c l e o t i d e ) a n dn u c l e i ca c i d sw i t ht h ef l u o r e s c e n c ep r o b e 10 一m e t h y l a c r i d i n i u mi o d i d e ( 10 - m e a l ) w a ss t u d i e d 1 as e r i e so ft r a n s i e n ta n ds t a t i cf l u o r e s c e n c eq u e n c h i n go f10 m e a la sa l l e l e c t r o na c c e p t o rb yn u e l e o b a s e s ，n u c l e o t i d e sa n dn u c l e i ca c i d sw e r ei n v e s t i g a t e d b yu s i n gf l u o r e s c e n c eq u e n c h i n gs p e c t r o s c o p yt e c h n i q u e t h er e s u l t si n d i c a t et h a t t h e i rs t a t i ca n dt r a n s i e n tf l u o r e s c e n c eq u e n c h i n gi n t e r a c t i o n sa r ev e r ys t r o n g b o t h q u e n c h i n gc o n s t a n t sl ( q ( s ) a n dk q ( d ) r e a c ht h em a g n i t u d eo f10 1 0m 1s ，c l o s et o t h ed i f f u s i o n c o n t r o l l e dr a t e t h i si l l u s t r a t e st h a tt h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nn u c l e i c a c i d p r e c u r s o r sa n de x c i t e ds i n g l e t s o ff l u o r e s c e n c ep r o b e10 一m e a la r e c h a r a c t e r i s t i co f e l e c t r o n t r a n s f e r ( e t ) m e c h a n i s m 。 2 b yc o m b i n i n ga b s o r p t i o na n df l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y , t h ei n t e r a c t i o n m e c h a n i s mo faf l u o r e s c e n c ep r o b eo f10 一m e a l 、析t hc a l ft h y m u sd n aa tc o n s t a n t t e m p e r a t u r ea n dp hw a ss t u d i e dt o o u p o nb i n d i n gt od n a ，t h ef l u o r e s c e n c eo f n m e a li ss t r o n g l yq u e n c h e db yt h ed n ab a s e s 。e x t e n s i v eh y p o c h r o m i s ma n dr e d s k 凰i nt h ea b s o r p t i o nw e r eo b s e r v e dw h e nn m e a ib i n d st on a t u r a ld n a t h e i r a p p a r e n ta f f i n i t y b i n d i n gc o n s t a n th a sb e e nd e t e r m i n e db yu s eo ft h r e ed i f f e r e n t m e 曲d s ：( i ) u vs p e c t r o s c o p y , ( i i ) f l u o r e s c e n c eo fs i n g l ep r o b e ，( i i i ) a c o m p e t i t i o nm e t h o do f10 一m e a la n de t h i d i u mb r o m i d e ( e b ) t h eb i n d i n gc o n s t a n t s o b t a i n e df r o mt h ea b o v em e t h o d sg a v eb i n d i n gc o n s t a n t si nt h er a n g e ( 1 4 5 5 ) x1 0 4m o f b a s ep a i r s ，a n dt h eb i n d i n gs i t en u m b e r w a sd e t e r m i n e dt ob e2 t h er e s u l t s o fa b s o r p t i o na n df l u o r e s c e n c es p e c t r a ，t h e r m a ld e n a t u r a t i o na n de f f e c to fp h o s p h a t e a n i o nc o n c e n t r a t i o ne x p e r i m e n t ss u g g e s t e dt h a tt h ea c r i d i n ed y eb i n d st od n a t h r o u g ht h em i x t u r eo ft w ob i n d i n gm o d e s ：i n t e r c a l a t i o na n do u t s i d eb i n d i n g ，i n w h i c ht h ef o r m e ri st h em a j o ro n e 同济大学理学硕士学位论文 第一章前言 第一章：前言 i i核酸的组成和结构 1 9 4 4 年，a v e r y 等在寻找导致细菌转化的原因的过程中发现，s 型肺炎球 菌的d n a 将其遗传特性传给了r 型菌，d n a 就是遗传物质。从此核酸是遗传物 质的重要地位正式确立。 核酸是生物体内的高分子化合物。它包括脱氧核糖核酸( d n a ) 和核糖核酸 ( r n a ) 两大类。d n a 和r n a 都是由一个一个核苷酸( n u c l e o t i d e ) 头尾相连而形 成，单个核苷酸是由含氮有机碱( 称碱基) 、戊糖和磷酸三部分构成，碱机构成 核酸的侧链，戊糖和磷酸构成核酸的主链，其中构成核苷酸的碱基分为嘌呤 ( p u r i n e ) 和嘧啶( p y r i m i d i n e ) 二类。前者主要指腺嘌呤( a d e n i n e ，a ) 和 鸟嘌呤( g u a n i n e ，g ) ，d n a 和r n a 中均含有这二种碱基。后者主要指胞嘧啶 ( c y t o s i n e ，c ) 胸腺嘧啶( t h y m i n e ，t ) 和尿嘧啶( u r a c i l ，u ) ，胞嘧啶存在于 d n a 和r n a 中，胸腺嘧啶只存在于d n a 中，尿嘧啶则只存在于r n a 中，核酸分 子中还发现数十种修饰碱基，又称稀有碱基，( u n u s u a lc o m p o n e n t ) 。它是指上 述五种碱基环上的某一位置被一些化学基团( 如甲基化、甲硫基化等) 修饰后 的衍生物。一般这些碱基在核酸中的含量稀少。由于真核生物的遗传信息完全 来自于d n a ，因此对d n a 的研究也多于r n a 。 d n a 的一级结构指组成d n a 的诸脱氧核苷酸之间通过3 ，5 一磷酸二酯键连 键的性质以及它们在d n a 分子中的排列顺序。各种d n a 分子特有的碱基排列方 式决定了它们携带的信息及行使的生物功能。只有了解了d n a 中各个原子是怎 么通过共价键连接在一起在构成它们的三维空间结构，才能知道d n a 是怎样携 带遗传信息的。w a t s o n 和c r i c k 于1 9 5 3 年提出了d n a 分子的二级结构模型， 即双螺旋分子模型，也称标准的b - d n a 结构( 见图卜1 ) ，随即被w i l k i n s 用x 射线衍射法所证实，w a t s o n 和c r i c k 也因此而获得了n o b e l 奖。 b - d n a 是由两条反向平行的多核苷酸链绕着同一个中心轴构成的双螺旋结 构。两链都是右手螺旋，碱基在螺旋的内侧，碱基平面几乎与纵轴垂直。磷酸 第l 页 同济大学理学硕士学位论文第一章前言 酸与脱氧核糖在外侧，彼此间通过磷酸二酯键相连，相成d n a 骨架。两条多 核苷酸碱基之间依靠氢键按a _ t ，g - c 相配对连接在一起。在双螺旋表面形成 两个凹下去的沟，一条沟大些，一条沟小些，分别称为大沟和小沟。双螺旋表 面的沟对d n a 和蛋白质的相互识别是很重要的，因为只有在沟内才能接触到 碱基的序列。 一个& 霹嘞躲蠛缝 图1 - 1 由于d n a 是一种柔性的生物大分子，这使得d n a 双螺旋可以采取不同 的构象，如a - ，b 一，c ，d ，e ，和z 构型。d n a 采取哪种构象，很大程度 上取决于外界环境条件，如盐的种类和浓度，相对湿度等。b 构象是大多数天 然d n a 的存在方式。各种不同构型的d n a 其结构参数各异( 见表1 1 ) 。 表1 1 ： a - d n a ， b d n a 和z d n a 中的平均螺旋参数 第2 页 铲 了；撕，；，蔓 同济大学理学硕士学位论文 第一章前言 d n a 的三级结构指的是d n a 双螺旋的进一步扭曲，包括线状双链种可能 有的扭结和超螺旋，多重螺旋及环状d n a 中诸如结，超螺旋和连环之类的各 种拓扑学状态。其中，超螺旋是d n a - - 级结构的一种最常见的形式。 1 2 电子转移过程 近年来电子转移反应( e l e c t r o nt r a n s f e r ，e n 的研究进展十分引入注目，它 目前已成为现代化学的重要领域之一许多重要的生命过程( 包括绿色植物的 光合作用，生物体内的2 0 0 多种氧化还原酶参与的新陈代谢等) ，太阳能的储 存和利用、分子器件 皿d ) 研制等都涉及到e t 过程。 e t 过程包括初级电子转移和次级电子转移。激发单重态 ( 1 s e n s * ) 或激发三重态( 3 s e n s * ) 从反应底物分子( d ) 中夺取一个电子 后形成电荷转移络合物c t c ( c h a r g et r a n s f e rc o m p l e x ) 的过程是初 级e t 过程；初级e t 过程中形成的自由基离子非常活泼，能与其 它物种( 如o ：) 等进一步发生电子转移，这一过程是次级e t 过程。 现已证实芳香氰化合物( 如9 ，1 0 二氰葸d c a ) 和带正电荷的芳杂环 化合物( 如l ，3 ，5 三苯基毗喃硼氟酸盐t p p + ) 是两类较好的e t 吸电 子型敏化剂，借助现代研究方法，可提供电子转移过程的直接或间 接证据，使电子转移理论有了较大的发展，图1 2 表示了一种常见 的光诱导电子转移过程。 奄+ d s + d 图1 - 2 初级e t 能否顺利进行与溶剂的极性和光敏剂的性能有很大的 关系。极性溶剂能有效分离电荷，利于发生初级e t 过程；而非极 l 生溶剂中电荷不易分离，而易发生电子回传( 逆e t 过程) ，重新回 第3 页 同济大学理学硕士学位论文 第一章前言 到反应物，这是一个耗能的过程，因此如何阻止或减少这类电子回 传，促进离子对中正、负离子自由基的分离，从而提高电子转移过 程的效率己成为近期光诱导电子转移研究的中心课题之一【。 1 3 荧光淬灭方法 荧光淬灭技术光物理方法常用于研究电子转移过程 2 1 。利用这 种方法可以深入了解许多光化学和光物理过程。荧光淬灭方法分为 稳态和动态荧光淬灭两种。前者是测定荧光强度随淬灭剂浓度【q 】 的变化情况；后者测定荧光寿命( t ) 受【q 】的影响。通过s t e r n v o l m e r 关系式求出的淬灭速率常数k 。来判断淬灭的性质。 荧光淬灭的途径有两类：能量转移和电子转移。早期的荧光 淬灭研究主要着重能量转移，这与所用的三线态敏化剂有关。八十 年代，由于时间分辨闪光光解技术，荧光淬灭及化学诱导核极化 ( c i d n p ) 技术的广泛应用，电子转移理论有了很大的发展【3 】，特别 是m a r c u s 由于提出电子转移动力学理论并为后来实验所证实【4 l ， 而获得l9 9 3 年诺贝尔化学奖。 通过荧光淬灭技术可以帮助我们进一步了解电子给体与电子 受体之间或能量给体与受体之间的相互作用过程和机理。电子转移 淬灭是指电子从给体的占用轨道跃迁到受体的未占用轨道后引起其 荧光强度和荧光寿命的降低。通常判断淬灭到底是能量转移还是电 子转移过程，大致可遵循以下几个原则：( 1 ) 如果能量受体比能 量给体的能量大3k e a l m o i 以上，即敏化剂的激发波长与淬灭剂的 吸收曲线没有重叠，并且其荧光发射曲线不与淬灭剂的吸收曲线发 生交盖，则不可能发生能量转移；( 2 ) 根据r e h m w e l l e r 公式中 电子给、受体间e t 的自由能变化( g ) 值来判断e t 是否是热力学 上有利的过程；( 3 ) 电子转移要求给、受体间的有效距离小于或等 于l o a o ，其淬灭速率常数接近扩散控制( 1 0 1 0m 。s 。) ；而能量转移 淬灭发生在lo 10 0a o ，淬灭速率常数一般小于扩散控制速率常数。 第4 页 同济大学理学硕士学位论文第一章前言 1 4电子转移过程中的微环境效应 初级电子转移过程形成自由基正、负离子对，但其电荷分离的 难易对电子转移的效率的影响很大。为了提高电子转移的效率，除 了增大溶剂极性外，微环境如胶柬、囊泡、微乳等是经常使用的方 法m 。胶束是表面活性剂在水溶液中达到临界胶束浓度( c m c ) 以上 的聚集体，是一类常见的微环境，有阴、阳离子型和中性表面活性 剂之分，其典型代表有阴离子胶束十二烷基硫酸钠( s d s ) 、阳离子 胶束十六烷基三甲基溴化胺( c t a b ) 和中性胶束聚醚( t r i t o n ) 等。从 球形离子胶束的m e n g e r 模型( 图1 3 ) 可以知道，此胶束内层由碳氢 链组成，是疏水性的；外围是带相反电荷的s t e r n 层和g o u y 层。 当疏水性的底物进入胶束内层后，其局部浓度提高。当淬灭过程发 生在胶柬内层时，因相互碰撞机会增加，淬灭作用增强；更为重要 的是，当发生电子转移淬灭时，自由基离子对与胶束外围同种电荷 相互排斥和相反电荷的相互吸引作用的差异，提高了选择性，从而 使之得到有效分离，提高了电子转移的效率，这种电子转移的微环 境效应的研究正取得很大的进展。 1 5d n a 结构探针 图中球型离子胶束的m e n g e 模型 + 枷分别代表反离子， c h 链和极性头的相对位置 层 图i - 3 核酸( d n a 、r n a ) 具有十分重要的生物活性功能，例如构成基因遗 传密码和和控制蛋白质的合成等。基因工程和基因重组多涉及d n a 和r n a 第5 页 同济大学理学硕士学位论文 第一章前言 选择性断裂步骤。核酸主链和侧链的断裂与变异在基因测序、改性、致癌作用 以及癌症治疗等研究方面均具有重要的理论和实际意义。 现己发现，核酸与外源作用物有多种复杂的相互作用，例如氢键作用、折 叠、静电作用、范德华作用等基本上属物理性质的作用。荧光探针与核酸的相 互作用除物理性质作用外主要可归结为两类：能量转移作用( e n e r g yt r a n s f e r ) 和 电子转移作用( e l e c t r o nt r a n s f e r ) 。核酸前体包括核酸碱基、核苷及核苷酸是核 酸的基本结构单元，它们与核酸的结构和功能密切相关，近来核酸与核酸前体 参与的电子转移作用成为新的研究热点，这种化学作用最终可导致核酸主链和 碱基侧链的断裂f 6 ，7 1 ，因而受到广泛重视l s o j 。 核酸探针技术也称基因诊断或基因探针技术，基因诊断的目标物除d n a 外，还包括m r n a ，因m r n a 为基因转录产物，能与d n a 探针进行分子杂 交( 核酸分子杂交是指不同来源的带有互补核苷酸序列的单链d n a 或r n a 当他们混合在一起时，其特定的同源区段退火形成双链结构) j 。近年来，核 酸探针技术已越来越广泛的应用于重组d n a 的筛选、基因分析、各种遗传病、 传染病和恶性肿瘤的诊断治疗及抗病毒药物的合成等诸多方面。 为研究核酸的结构和变化规律，各种各样的核酸探针技术也被发展起来。 主要有放射性同位素核酸探针和非放射性同位素核酸探针两大类。放射性同位 素核酸探针具有很高的灵敏度，但存在很多难以克服的弊端，如衰变，放射性 物质的有效期短，元素的放射性对环境不敏感等。而在非放射性同位素核酸探 针中，荧光探针以其信号强、寿命长等优点逐渐引起人们的关注。 荧光法具有极高的灵敏度。在激光作激发光源时，所需样品溶液可小至 l 恤l ，检出限可达1 0 叫6 1 0 叫4 9 f 陀】。而且，荧光法通常是非破坏性的，甚至可 以对单个活细胞进行研究。而如果荧光光谱仪与电子计算机连用，则可准确测 量快速的荧光变化( p s 至岱) ，从而实现对化学反应的实时监测。荧光光谱提 供的信息量也比较大，它提供的物理参数有：激发光谱，放射光谱，荧光光谱， 荧光强度( i ) ，量子产率( ) ，荧光寿命( t ) ，荧光共振，淬灭速率常数 ( k 。) 等。很重要的是，荧光对环境十分敏感，这一点对研究核酸这类具有复 杂微环境的大分子来讲十分有利。核酸具有很弱的内源荧光，激发波长是2 6 0 第6 页 同济大学理学硕士学位论文 第一章前言 眦而荧光团的激发波长一般要远大于这一波长。这为荧光探针的使用提供了 有利条件l ”l 。 人们先后采用了许多种荧光物质做荧光探针，以便于得到关于核酸的更多 信息。核酸探针根据荧光团是否与核酸链相连，可分为共价探针和非共价探针 两类。其二者的作用原理相似，都是由于与不同的环境作用而产生不同的荧光 信息。非共价探针的使用方法较共价探针简单得多，只须向一定的核酸溶液中 加入特定的荧光物质，并研究各种荧光参数的变化，就可以得到所需要的信息。 但是由于这种方法所能提供的信息较少，而使其应用主要限制于探针性质的初 步研究和筛选上。共价探针是目前应用最广泛的核酸荧光探针使用方法。这种 方法大致也可以分三类：一类是在磷酸糖苷链上接入一个外来的生色团；第二 类是在糖基上接入个生色团；第三类是对碱基进行修饰，接上一个荧光团或 接入取代基使其自身荧光得以加强。 近来，荧光探针技术应用于核酸及核酸碱基的代谢及损害机理的研究取 得了很大的进展，1 9 7 7 年k u b o t a 等 i 们将9 一氨基吖啶( 9 - a a ) 嵌插在d n a 链和多核苷上，发现i ) n a 上的9 - a a 的荧光完全被淬灭。1 9 9 1 年 h a r r i m a n 等n 5 】报道了某些连接在d n a 上的多环正离子染料如亚甲 兰、n ，n ，_ 二甲基一2 ，7 一二氮芘盐等的荧光被淬灭，指出这是因为激 发态的染料从邻近的核酸碱基上快速夺取电子造成的。1 9 9 7 年赵 一冰等人 1 6 1 报道了一种新的基于水杨酸、邻氨基苯甲酸荧光自淬 灭的d n a 探针技术，对筛选灵敏度高，选择性好的新一类d n a 探针 有重要的指导意义。19 9 8 年魏亦男等人 17 】直接用鱼精子d n a 、酵 母r n a 对荧光外探针邻菲罗啉作用，观察到了d n a 淬灭邻菲罗啉荧 光的实验事实，为研究d n a 损害机理提出了新的途径和思路。 核酸碱基的光化学损害研究也方兴未艾。l9 8 7 年k e m p 等【l 引应 用闪光光解技术研究了一些亲电分子对三线态的嘧啶碱基( 如t h y 、 胞嘧啶c y t 、尿嘧啶u r a c i1 ) 的荧光淬灭，指出一些药物( 如 m e t r o n id a z o l e 和m is o n id a z o l e ) 亦可参与d n r 的光辐射损害；后 来樊美公等( i9 】用荧光淬灭方法，考察了四氰基乙烯( t c n e ) 与核酸 第7 页 同济大学理学硕士学位论文 第一章前言 碱基的电子转移光反应。h a s h i m o t o 报道了一些嘌呤衍生物( 如t e m u 等) 及其去质子阴离子对芘的荧光淬灭【2 们，发现淬灭具有溶剂效 应，即在乙腈中是单纯的动态淬灭过程，而水中观察到了较弱的基 态络合物的形成，淬灭过程同时涉及到动态和静态淬灭作用。樊美 公等进一步通过几种常见碱基在水溶液中对芘的荧光淬灭的研究 2 i 】 发现，淬灭作用具有碱基效应，即嘌呤类碱基的淬灭是单纯的静态 淬灭过程，嘧啶类碱基的淬灭则是单纯的动态淬灭过程，阐明了淬 灭过程中嘌呤类碱基充当电子给体和嘧啶类碱基充当电子受体，但 这种解释还有待进一步证实。这方面的工作除上述的以外较为突出的还 有如g o d d e 等人用b e n z o d q u i n a z 0 1 i n e 一2 ，4 一( 1h 3 h ) 一d i o n e ( b g q ) ，一种荧 光胸腺嘧啶类似物外接在一段碱基序列5 ，- ( t ) ，。c c a c a c c ( t ) ，。一3 的末端上形 成：5 - ( t ) ，。c c a c a c c ( t ) 。o b g q - 3 ，从而可以选择性检测核酸的三螺旋结构她】。 t h o m a s 等人直接将芘接在尿苷的5 位上【2 3 】，芘作为一种公认的致癌物质同 时又是很好的荧光体，将其与尿苷相结合形成5 位芘标记的核苷荧光探针( 结 构式如a ，b 所示) ，对研究核酸及其碱基的生理及病理性质具有双重意义。 1 6 研究展望课题的构想 对生物活性分子的光动态损害机理研究，有助于深入了解生物 分子光损害的途径和规律以及对进一步寻求预防和减少光化学损害 作用，因此有着重要的理论和实际意义。吖啶类荧光探针是最重要 的核酸探针类型之一，由于其具有较强的生物活性，它们与核酸间 的相互作用引起了人们的特殊关注。光学方法，特别是荧光方法非 常适合于结合式的相互作用的研究。但是，由于核酸内碱基次序及 空间结构的不同，使对吖啶和核酸结合作用的研究变得尤为复杂。 本文拟进一步开展这一方面课题的研究，为此我们选择了l0 甲基 吖啶氮鲦盐( 10 m e a i ) 和溴化乙锭( e b ) 作为核酸荧光探针的模 拟化合物( 见图1 - 4 ) ，并设想从以下两个方面进行探索； 第8 页 同济大学理学硕士学位论文第一章前言 l 、核酸及其前体对荧光探针10 - m e a l 激发态的荧光淬灭。选用 五种核酸碱基( 胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、腺嘌岭、次黄嘌呤) 、 核苷( 鸟苷、脱氧鸟苷、尿苷、脱氧尿苷) 、核酸( 小牛胸d n a 、 鲑鱼精d n a 、酵母r n a ) ( 结构见图1 4 ) 分别研究它们对带正电 荷的杂环化合物l o 一甲基吖啶盐的荧光淬灭作用，以期证明这些淬 灭过程具有电子转移和能量转移性质。 2 、 利用紫外光谱和荧光光谱方法研究荧光探针1 0 m e a i 与核酸 的结合能力、结合点位数及作用模式，同时对它们之间的作用机理 进行探讨。 第9 页 同济大学理学硕士学位论文第一章前言 荧光探针 m e i o - m e t h y l a c r i d i n i u r ni o d i d e 核酸碱基 。 l v 队+ 核苷 a d e n i n e a d n hh h y p o x a z i n e h x t o h u r a c i i u r a e 州d i 帅b r o m i d e e 臣 t h y ，m i n e t h y n h 2 b r h 2 c h3 c 鸣 h c y t i n e c t s 图i - 4 第1 0 页 同济大学理学硕士学位论文 第二章核酸及其前体对探针激发态的荧光淬灭作用 第二章核酸及其前体对探针激发态的荧光淬灭作用 2 i1 0 m e a i 的紫外吸收、荧光激发及发射光谱 2 1 1紫外吸收光谱与荧光激发光谱 由于t 0 m e a l 的结构特点是电子具有较高的离域性，双键共轭度 高，又有一定的剐性平面结构，这些结构特点决定了它们具有较强的紫 外吸收，如图2 - 1 所示。 2 8 0 o3 0 03 3 03 4 03 6 03 8 0枷4 2 0 4 4 04 5 0 0 w i n 图2 一li o - m e a i 紫外吸收光谱 1 0 m e a i = 6 2 5x10 m 由图可见，1o - m e a l 的紫外吸收在3 4 0n m 处有一个比较弱的肩峰， 在3 5 7n m 处有最强的吸收，它们的摩尔吸光系数分别为 7 2x1 0 3m 1c m l 和1 5x1 0 5m 。1c m 1 。由此可见在两波长处的吸收为一 氕吸收。 随后我们又测得1 0 m e a i 的激发光谱如图2 2 所示。荧光激发光谱与紫外 光谱的结果较相似，但激发光谱中3 9 0n m 处吸收峰增强。 第l l 页 同济大学理学硕士学位论文 第二章核酸及其前体对探针激发态的荧光淬灭作用 帅 图2 - 21 0 m e a l 的荧光激发光谱 【1 0 - m e a l 】= 6 2 5x1 0 。5m ； 。= 4 8 6n m 2 1 2稳态荧光光谱 依据上述紫外吸收和荧光激发光谱，在一定浓度的1 0 - m e a i 的缓冲溶液中，选择入e x = 3 9 0 n m 作为激发波长，在4 0 0 6 0 0n m 的 范围内，由荧光光谱仪测得荧光发射光谱( 如2 3 图) 。从图中可 以看出，1 0 m e a l 在4 0 0 6 0 0n m 范围内的荧光发射在4 8 6n m 处达 到最大值。 图2 - 31 0 m e a l 荧光发射光谱 【1o m e a l 】= 6 2 5x 1 0 5m ； 入。，；3 9 0n m 第1 2 页 同济大学理学硕士学位论文第二章核酸及其前体对探针激发糊荧垄塑作堡 2 1 3 时间分辨荧光光谱 图2 - 41 0 - m e a l 的瞬态荧光衰减光谱 以单光子记数技术，测得1 0 - m e a i 的瞬态荧光衰减光谱如2 - 4 图 所示。由图可以看出，其单线态在2 5r l s 时达到最大，随后开始衰减， 大约在2 5 5t l s 衰减到了零。由一级动力学公式求得其单线态的荧光 寿命ro = 3 0 4n s 。 2 2 核酸前体参与的光诱导电子转移 d n a 是生物体重要的遗传物质，其光化学损害的部位主要是核 酸碱基 2 4 1 ，而核酸碱基的变化可能是导致基因突变和物种变异的一 个重要原因，因此对核酸碱基的光动态损害机理的深入研究具有重要 的理论和实际意义。 理论上，一个核酸碱基分子( n b ) 可参与以下四种可能的电子转 移( e t ) 的荧光淬灭过程： 第1 3 页 同济大学理学硕士学位论文 第二章核酸及其前体对探针激发态的荧光淬灭作用 ( 1 ) a + n b 寸a - + n b t ( 2 ) d + n b d t + n b ： ( 3 )a+n 吉_ a ： + n b t ( 4 ) d+ n b 呻d t + n b ： ( 基态n b 作为电子给体淬灭剂) ( 基态n b 作为电子受体淬灭剂) ( 激发态n b 作为电子给体) ( 激发态n b 作为电子受体) 式中a 、d 分别代表基态的电子受体和给体，掌代表激发态。由于常 温下普通碱基的n b 。的发光效率很低，仅在低温7 7 k 玻璃态下才能 观察到较强的荧光发射。另外普通碱基n b 的荧光发射波长也较低 2 5 1 ，一般 k q ( d ) ，表示除了动态淬灭外，还可能 基态络合物参与了淬灭过程。更为重要的是如果k q ( s ) 或k q ( d ) 值接近 第1 6 页 同济大学理学硕士学位论文 第二章核酸及其前体对探针激发态的荧光淬灭作用 1 0 l om j s 一，反应趋于扩散控制，则表明淬灭具有电子转移的性质。 2 5淬灭剂对荧光体激发光谱的影响 理论上淬灭剂对荧光体的荧光淬灭有两种模式f 3 0 1 ，如图2 5 所 示即： ( 1 ) a + 0 ；= = 兰苎( a - q ) 卜a +q+ h v h v t 十 lh v ( 2 ) i a+q ；i 未 ( a - q ) 图2 5 实验中发现淬灭剂的加入不仅影响荧光体的荧光发射强度，而 且对荧光体的激发光谱也有较大的影响( 如图2 6 所示) 。 从图2 6 中我们发现，淬灭剂的加入对l0 - m e a i 的吸收图谱影响 很大这些信息表明：( a ) 1 0 m e a i 与t h y 在激发之前有一定的相互 作用，形成了基态络合物，因为如果它们的基态没有相互的作用，那 么1 0 m e a i 的吸收图谱不会有任何的变化，由此可以判断嘧啶碱基 对1 0 - m e a i 的荧光淬灭是遵循模式( b ) 进行的，即： a + q 占( a - q ) 马( a - q ) 一a + q + h v ( c ) 形成的基态缔合物相互作用较弱，从而使其对lo - m e a i 的荧光 影响较小。 第1 7 页 同济大学理学硕士学位论文第二章核酸及其前体对探针激发态笪雾光蹿灭作用 图2 6淬灭剂对1 0 m e a l 激发吸收图谱的影响 光谱强度由强到弱分别为 未加淬灭剂t h y 时l o - m e a i 的激发图谱和加淬灭剂时的激发图谱 2 6核酸及其前体对探针的稳、动态荧光淬灭 砷 图2 7s d s 中a d e 淬灭l o m e a l 稳态荧光光谱 入“= 3 9 0l l m ；入m = 4 8 5l i m 第1 8 页 同济大学理学硕士学位论文第二章核酸及其前体对探针激发态的荧光淬灭作用 七 一口 - 口 一 - - 一a 图2 8稳、动态荧光淬灭的s t e r n v o l m e r 直线 本文以在s d s 水溶液中腺嘌呤a d e 对l0 - m e a i 的稳态、动态荧 光淬灭为例。 图2 7 显示出l0 - m e a i 的荧光强度i 随着 a d e 浓度的增大而减 小。以1 0 i 对 a d e 】作s t e r n v o l m e r 直线( 图2 8 ) ，相关系数为o 9 9 9 ， 线性很好，完全符合s t e r n v o l m e r 方程。 由直线斜率k 。v = 3 4 3m 一和1 0 m e a i 在s d s 中的3 6 1n s 求出了 k q ( s ) = 9 5 0 x1 0 9m j s 一，接近扩散控制，说明了a d e 对1 0 - m e a i 的稳 态荧光淬灭具有电子转移的性质。从动态荧光淬灭图2 - 9 可以看出 1 0 一m e a i 的荧光寿命( t ) 随【a d e 的增大而降低，以to t 对【a d e 】 作图为直线( 图2 8 ) ，求出k q ( d ) = 6 6 5xl0 9m 。s - i , 亦接近扩散控制， 说明了a d e 对l o m e a i 的动态荧光淬灭亦具有电子转移的性质。 第1 9 页 5 2 o ， ， ， ， 同济大学理学硕士学位论文 第二章核酸及其前体对探针激发态的荧光淬灭作用 鲥峰 “ 嚣努 铆绛 鹤搿 始 箩薹燃撇 图2 8s d s 中a d e 淬灭1 0 m e a l 动态荧光光谱 另外其k q ( s ) 略大于k q ( d ) ，表明动态淬灭过程是主要的，但还存 在一定的经历基态络合物的静态淬灭过程。核酸碱基经动态淬灭与激 发态的敏化剂之间形成基态络合物，经静态淬灭与基态的敏化剂之间 形成电荷转移烙合物c t c 。 2 7 核酸及其前体荧光淬灭作用的比较 我们进而研究了一系列的核酸及其前体对荧光探针l0 - m e a i 的 荧光淬灭，结果见表2 3 和2 4 。从表中可以看出，在所列碱基中腺 嘌呤对探针的淬灭能力最强：核酸中c t d n a 的淬灭能力大于s s d n a 和y - d n a 的淬灭能力。核酸对1 0 m e a i 的荧光淬灭速率大于其前体 的淬灭速率。 第2 0 页 同济大学理学硕士学位论文 第二章核酸及其前体对探针激发态的荧光淬灭作用 表2 - 3s d s 中核酸碱基对受体敏化剂淬灭数据( k qx1 0 毋m 。s 。) 【1 0 一m e a l 】= 6 2 5x 1 0 5m 。= 3 9 0 n m ；入。= 4 8 5n m 表2 - 4缓冲溶液中核苷、核酸对1 0 - m e a l 的荧光淬灭( 1 【q x1 0 - 9m 1 s 。1 ) 型! 竺塾! !鉴堂墨( 垡丝塑苤墨墼2 ( 珞7 2 60 9 9 9 d g s 次 d u r c t - d n a s s d _ n a 7 2 90 9 9 7 0 8 3 5 4 8 3 4 4 8 1 5 6 3 0 9 9 8 0 9 9 8 0 9 9 9 0 9 9 7 ! ：堕垒兰鱼：兰!q ：2 1 墨 【1 0 - m e a l 】- - 6 2 5 x1 0 5m 。= 3 9 0n m ；入。= 4 8 5n m t r i s h c ib u f f e rp h = 7 2 ：n a c l = 5 0m m 2 8 荧光淬灭微环境效应 微环境如胶柬等能提高反应物的局部浓度，改变量子产率，并能 有效地促进电荷的分离，从而提高电子转移的效率和阻止逆电子转移 的发生。已有报道1 与极性溶剂相比，在s d s 中的荧光淬灭速率可 第2 l 页 同济大学理学硕士