（动物遗传育种与繁殖专业论文）兔GDF9的克隆与在性腺中的定位及表达丰度研究.pdf

季金强：兔g d f 9 的克隆与在性腺中的定位及表达丰度研究 扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下独立进行研究工作所取得的研 究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表 的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。 本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：彳 宝殛 签字日期：d 暑年f 月加日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅。 本人授权扬州大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学 技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向 社会公众提供信息服务。 学位论文作者签名：柱强 签字日期：弼 年，月扣日 导师签名西羽6 签字日期：伊r 年j 月w 日 一 季金强：兔g d f 9 的克隆与在性腺中的定位及表达丰度研究 l 兔g d f 9 的克隆与在性腺中的定位及表达丰度研究 研究生：季盒强 导师：丁家桐教授 ( 扬州大学动物科学与技术学院江苏扬州2 2 5 0 0 9 ) 摘要 根据n c b i 上已发表的小鼠、人g d f 9 m r n a 序列，分别在第1 外显子和第2 外显子处设计两对引物。采集母兔卵巢组织，利用t r i z o l 法提取总r n a ，然后用 r 1 二p c r 法进行c d n a 扩增，获得了长度为2 8 9 b p 和2 9 9 b p 的两段目的片段。运用 1 l a 克隆法，将目的片段连接到p m d l 9 t 载体上，通过蓝白斑筛选和菌液p c r 对 重组质粒进行鉴定。测序后进行比对发现，目的片度长度为2 8 9 b p 的序列与人、 猪的、牛的、小鼠的g d f 9 相对应序列，同源性分别为8 l 、7 8 、7 7 、7 4 。 目的片段长度为2 9 9 b p 的序列与猪、人、牛、小鼠、山羊g d f 9 相对应序列同源 性分别为8 6 、8 6 、8 6 、8 2 、8 7 。 用免疫组织化学方法对兔卵巢和睾丸中的g d f 9 蛋白进行定位，结果显示， 原始卵泡中未见阳性表达，在初级卵泡中开始出现阳性表达，棕黄色阳性产物主 要存在于卵母细胞膜上；次级卵泡中阳性表达增加，主要集中于卵母细胞胞质； 在有腔卵泡中阳性表达位于卵母细胞膜和卵丘颗粒细胞，与次级卵泡相比表达有 所下降。黄体中出现阳性表达。兔睾丸中g d f 9 蛋白呈阳性表达，棕黄色阳性表 达产物主要存在于初级精母细胞和圆形精子细胞。精原细胞、支持细胞及成熟精 子中呈阴性表达。 采集公兔的下丘脑、垂体、睾丸、附睾和母兔的下丘脑、垂体、卵巢、子宫 组织，利用强z o l 法提取总r n a 。r t - p c r 法对其进行组织表达谱研究，发现在上 述组织中都有g d f 9 m r n a 的表达，表明g d f 9 m r n a 的表达在兔上不具有特异性。 利用实时荧光定量p c r 法测定公兔的下丘脑、垂体、睾丸、附睾和母兔的下 丘脑、垂体、卵巢、子宫中g d f 9 m r n a 相对表达丰度变化。结果表明：在公兔的 下丘脑一垂体腺轴中，以公兔睾丸为校f 样本表达量为1 ，下丘脑、垂体中的 季金强：兔g d f 9 的克隆与在性腺中的定位及表达丰度研究! g d f 9 m r n a 表达量分别是它的0 1 3 5 4 倍、0 4 3 9 4 倍，附睾中g d f 9 m r n a 的表 达量明显高于上述三种组织为睾丸的3 0 5 4 3 倍。在母兔的下丘脑一垂体一性腺轴中， 以母兔垂体为校正样本表达量为l ，卵巢表达量最多，为垂体的1 3 7 2 7 l 倍，下丘 脑中的表达量为垂体的5 0 3 5 倍，子宫表达量低于下丘脑为垂体的2 0 5 2 8 倍。各 组织间g d f 9 m r n a 表达水平差异显著。 关键词兔g d f 9 免疫组化实时荧光定量p c r 克隆 季金强：兔g d f 9 的克隆与在性腺中的定位及表达丰度研究! c 1 0 n e 、l o c a l i z a t i o na n da - b u n d a n c ea n a l v s i s 0 fg d f 9i nr a b b i t m s c a n d i a t e ：j ij i n q i a n g s u p e r v i s o r ：p r o d i n gj i a t o n g ( a n i m ls c i e n c ea n dt e c l l i l o l o g yc 0 1 l e g e ，y 觚g 吐o uu n i v e r s i t y 2 2 5 0 0 9 ) a b s t r a c t a c c o r d i n gt ot h eg d f9s e q u e n c e so fm o u s ea 1 1 dh u m a ni n ( k n e b a n k ，t w op a i r p r i m e r sf o rp c rw e r ed e s i g n e d u s i n gr r p c rf 如mr a b b i to v a r y ，t w o 丹a g m e n t so f r a b b i tg d f 9 9 e n ew e r ei s o l a t e d ，也e nw e r ec l o n e di n t op m d l 9 一t s i m p l ev e c t o ra i l d w e r cs e q u e n c e d n l er e s u n ss h o w e dt h a tt h eo b t a i n e dt w o 丘a g m e n t sw e r e2 8 9 b pa 1 1 d 2 9 9 b p n l ef i r s ts e q u e n c es h a r e d8 6 、8 6 、8 6 、8 2 、8 7 n u c l e o t i d eh o m o l o g y 谢也 t h ep u b l i s h e dm r n a o f h u m a i l ，p o r c i n e ，c o wa i l dm o u s es 印a r a t e l y t h es e c o n do n e s h o w e d 也eh o m o l o g yo fm i sg e n es e q u e n c e 谢mp i g ，h u m a n ，c o w ，m o u s ea i l dg o a t w e r e8 6 、8 6 、8 6 、8 2 、8 7 ，r e s p e c t l y u s i n gi m m u i l o l l i s t o c h e m i c a lm e t h o d ，t h ep r e s e n c ea i l dd i s 试b u t i o no fg d f 9i n r a b b i to v a r ya i l dt e s t i sw e r es t u d i e d t h ef i n d i n g ss h o w e dt h a tt h ep o s i t i v er e a c t i o n 、s a b s e mi 1 1p r i m o r d i a lf o l l i c l e s t h eg d f 9p r o t e i nw a ss e e ni n 血eo o c y t e s m e m b r a i l eo f p r i m a r yf o l l i c l e s i nt 1 1 es e c o n d a r yf o l l i c l e s ，恤ep r o t e i nm a i n l yl o c a t e di nt h ec y t o p l a s m o f o o c ”e sa n dt h e1 e v e lo f i ti n c r e a s e d t h ep o s i t i v er e a c t i o n sw e r eo b s e e di no o c ”e s m e m b r a i l ea i l dg r a n u l o s ac e l l si na i l t r a jf o l l i c l e s ，b u ti t se x p r e s s e d1 e v e ld e c l i n e d g d f 9 p r o t e i nw e r ef u r t h e m o r ef o u n d i nc o r p o ml u t e a i nm et e s t i s ，t 1 1 ep r o t e i nw a se x p r e s s e d i nt h ep r i m a r ys p e m l a t o c ”e sa i l dr o u n ds p e n 】1 a t i d t h ee x p r e s s i o no fg d f 一9w a ss t u d i e db yr t - p c ra n a l y s i su s i n gm r n a sd e r i v e d 丹o mf e m a l er a b b “t i s s u e s ( h y p o t h a l a r n u s ，p i t l l i t a 】o v a r y ，u t e m s ) a n dm a l et i s s u e s ( h y p o t l l a l 锄u s ，p i t u i t a mt e s t i s ，印i d i d y m i s ) g d f 一9w a sd e t e c t e di na uo f t h e s et i s s u e s b yf l u o r e s c e n c eq u a m i t a t i v ep c r ( f q - p c r ) ，t h em e n t i o n e dt i s s u e si nt h et e x t 季金强：兔g d f 9 的克隆与在性腺中的定位及表达丰度研究! w e r cm e a s u r e d t h er e s u l t ss h o w e di nt h em a i er a b b i tt h eh i 曲t e s te x p r e s s i o no f g d f 9 m i w aw a si n 印i d i d y l t l i s 廿1 a tw a s 3 0 5 4 3 f 0 1 do ft h et e s t i s 1 1 1 e1 1 i g h e s t1 e v e l w e r eo 1 3 5 4a n do 4 3 9 4 一f o l do f h y p o t l l a l 锄u sa 1 1 dp i t u i t a r ys e p a m t e l y i nt h ef e m a l e ， t h e1 “e l i no v a r y 、h ) ，p m a l 锄u s 趾du t e m sw c r e1 3 7 2 7 1 - f 0 1 d 、5 0 3 5 一f o l da i l d 2 0 5 2 8 一f o l do f t h ep i t i l i t a 够 k e yw o r d s ：m b b i t ，g d f 9 ，i m m u i l o h i s t o c h e m i s 姆；n u o r e s c e n tq u a n t i t a t i v er t 午c r ， g e n ec l o n e 季金强：兔g d f 9 的克隆与在性腺中的定位及表达丰度研究 ! r | j吾 近些年来，细胞因子对动物生殖的影响，己成为动物生殖生物学研究的热点。 哺乳动物卵母细胞的细胞因子在卵泡的发生和卵母细胞的成熟过程中发挥着重要 的调节作用，包括调节抑制素、活化素和卵泡抑制素的合成，瞄t 配基、l h 受体 的表达，颗粒细胞的分化1 1 和卵丘细胞的扩展吼生长分化因子9 ( g d f 9 ) 已经被 证实为卵母细胞因子的重要成员口】。 1 g d f 9 的研究进展 1 1g d f 9 基因及其氨基酸结构 g d f 9 是1 g f b 超家族中的一员，编码一段4 0 0 多个氨基酸的蛋白质，成熟的 c 2 末端片段由1 3 5 个氨基酸残基组成，它与其他成员的成熟蛋白质的同源性为 2 1 5 2 ，而蛋白质前体却没有显著的同源性【4 1 6 】这从结构上为将生长分化因子划 分为t g f b 超家族的一个亚群提供了依据。在总体结构上与其他成员相似，不同的 是其他成员含有7 或9 个c y s ，而g d f 9 只有6 个c y s ，不含位于c 2 末端参与成熟蛋 白二硫键形成的c y s ，该氨基酸被s e r 替换，导致g d f 9 以非共价键形成二聚体【7 j 。 g d f 9 整个蛋白由3 7 0 多个氨基酸残基组成( 小鼠4 0 8 、大鼠4 0 7 、人4 2 4 、牛 4 2 3 、绵羊4 2 6 ) ，成熟蛋白都由1 3 5 个氨基酸残基组成，绵羊与人、小鼠的氨基酸同 源性分别为7 7 和6 6 俐。 到目前为止，已获得了小鼠、大鼠、绵羊、牛、负鼠g d f 9 基因的序列。这些 物种的g d f 9 基因都是由两个外显子和一个内含子组成，外显子1 编码区大小为 3 6 7 b p ，外显子2 编码区大小为9 0 0 多b p ( 小鼠9 2 6 b p 、绵羊9 6 8 b p ) ，而惟一的内含子 在各物种间的差异就比较大了( 小鼠2 9 k b 、绵羊1 1 2 6 b p ) 。g d f 9 基因包括4 个n 2 糖基化位点，在n 末端有一段用作分泌信号的疏水性的氨基酸序列，在翻译的起始 点有7 个转录起始位点1 4 ”。 m c g r a t h 等用小鼠的g d f9c d n a 作探针从人卵巢c d n a 文库中筛选出 1 7 7 4 b p 长的片段【9 】ob o d e n s t e i n e r 等根据人和小鼠g d f 9 基因外显子2 的同源性设 计引物，从牛、绵羊d n a 中扩增出了预期的2 7 7 b p 长的片段，然后以此片段作为放 季金强：兔g d f 9 的克隆与在性腺中的定位及表达丰度研究! 射性探针在绵羊基因组文库中经过噬菌斑点杂交筛选、克隆、测序等方法获得了 绵羊g d f 9 基因的全序列【”。h a y a s l l i 等根据小鼠g d f 9 c d n a 设计引物从大鼠卵巢 c d n a 文库中扩增出了大鼠g d f 9 c d na 【旧 。s e n d a i 等根据绵羊的g d f 9 序列设计 引物扩增分离出1 3 5 5 b p 长的牛g d f 9 c d n a l l l 】。e c k e r y 等根据小鼠、人、绵羊g d f 9 序列设计引物，用巢式p c r 从刷状尾负鼠卵巢的c d n a 中扩增出8 1 9 b p 片段，然后 又用3 7 r a c e 从这8 1 9 b p 片段中获得了编码负鼠g d f 9 的成熟蛋白 1 ”。 1 2 g d f 9 的生物学功能 g d f 9 是由卵母细胞分泌的一种生长分化因子，它通过旁分泌方式对卵泡的生 长和分化起着重要作用nd o n g 等发现纯合突变的小鼠能形成原始卵泡和初级卵 泡，但在初级卵泡以后发育就停滞了，表明从原始卵泡发育到初级卵泡阶段是不需 要g d f 9 1 3 】的，但在体外培养的仓鼠卵巢形态发生过程中，g d f 9 却能够促进原始卵 泡和初级卵泡的形成 1 4 】。c a r a b a t s o s 等发现纯合突变小鼠的卵母细胞与卵泡大小的 比率比杂合子对照组大，而且卵母细胞的体积要大7 0 【”】。v i t t 等发现用g d f 9 处理大鼠卵巢的培养体系后，初级卵泡和腔前卵泡的数量增加，而原始卵泡的数量 却减少 16 】，可能原因是g d f 9 对原始卵泡的作用次于它促进初级卵泡发育到小腔前 卵泡的作用。h r e i n s s o n 等在人卵巢体外培养体系中经过7 d 器官培养发现g d f 9 能 促进残存的原始卵泡发育到第二阶段【1 ”，进一步说明从初级卵泡转化到腔前卵泡过 程中g d f 9 是必不可少的。h a y a s h i 等在体外培养体系中发现重组g d f 9 能诱导大 鼠的腔前卵泡生长且与f s h 一起使用时对卵泡生长起加性作用 m 】。 g d f 9 不仅对卵泡的生长分化起作用，而且对卵巢的颗粒细胞、膜细胞也起作 用。通过体外细胞培养发现g d f 9 能促进腔前颗粒细胞发生有丝分裂，促进颗粒细 胞生长，诱导卵丘扩张，促进类固醇生成急性调控蛋白、透明质酸合成酶2 和环加氧 酶2 的m r n a 合成，增加孕酮产量，诱导s m a d 2 的活化以及促进抑制素a 、b 产量； 但同时抑制依赖于f s h 诱导的颗粒细胞的应答反应，抑制k i t 配基的表达以及尿激 酶激活物的m i a 合成【7 1 6 1 0 1 8 9 2 0 、2 ”。g d f 9 对分化的颗粒细胞的调控功能 是通过一种内在的前列腺素e 2 配基受体信号途径来实施的 2 2 1 。s o l o v y e v 等在培养 的大鼠膜间质细胞中发现g d f 9 能调控类固醇的生物合成瞄】，y a m 锄o t o 等也在猕 季金强：兔g d f 9 的克隆与在性腺中的定位及表达丰度研究 ! 猴的颗粒细胞和膜细胞培养体系中发现g d f 9 调控类固醇生成，而且膜细胞表现出 更大的敏感性 2 4 】，这是否意味膜细胞是g d f 9 的首要目标还有待于进一步验证。 1 3g d f 9 的传导机制 和t g fb 超家族其他成员一样，g d f 9 也通过单转膜s e r 1 1 1 r 激酶受体i 、i i 进 行信号传导，但对g d f 9 信号传导的研究刚开始。v i t t 等用大鼠的骨形态发生蛋白 受体i i ( b m p r i i ) 的胞外结构域抑制了g d f 9 对小腔前卵泡的生长、分化的促进 作用，同时抑制b m p r i i 的生物合成就完全阻止了g d f 9 在体外促进腺苷渗入颗粒 细胞的作用，说明b m p ri i 可能是g d f 9 信号传导途径中的一级信号受体，而i i 型与 i 型受体形成的异源二聚体可能是二级受体【2 5 】。m a z e r b o u 唱等发现g d f 9 的信号 传导的下游作用受b m p 的i 型受体、a l k 5 ( a c t i v i nr e c e p t i ) r 2 1 i k k i n a s e5 ) 、s m a d 2 、 s m a d 3 蛋白质调控【2 。 1 4 g d f 9 的发育性表达 m c p h e d n 等运用n o n h e m 杂交首先发现小鼠g d f 9 m r n a 惟一地在卵巢中表 达【4 】。m c g r 础等用原位杂交方法发现小鼠g d f 9 m r n a 惟一地在卵母细胞中表达， 发现在新生和成年小鼠的卵巢中除了原始卵泡外所有卵泡的卵母细胞中都有 g d f 9 m r n a 的表达【2 7 1 ，而且排卵后g d f 9m r n a 在卵母细胞中继续表达，但在受精 后1 1 5d 消失 9 】o f 池p a t r i c k 等用p 3 2 标记的小鼠全长g d f 9 c d n a 作为探针，在小鼠、 大鼠的卵巢、睾丸和下丘脑中发现了g d f 9 m r n a ，但在子宫和心脏中没有发现，而 且通过原位杂交进一步证实在卵巢和睾丸中存在；用a 3 2 pd c t p 标记的人部分 c d n a 作探针，不仅在人的卵巢、睾丸等生殖器官中检测到了g d f 9m r n a ，而且 在垂体、子宫等非生殖器官中也有发现【2 8 ，这表明g d f 9 不仅在人的生殖器官中起 着重要作用，可能对其他器官更具有普遍意义的作用。b o d e n s t e i n e r 等用同源s 反义 探针杂交后在牛、绵羊卵泡发育的各个阶段包括原始卵泡中都发现了g d f 9 m r n a 8 】，这与先前报道o d f 9 m 鼢媳表达开始于初级卵泡不一致，可能是由于卵泡 分级标准不同、或者是对所使用的原位杂交体系的敏感程度不同或者是物种间的 差异造成的。e c k e r y 等发现刷状尾负鼠g d f 9m r n a 明显地在卵巢中表达，在垂体 季金强：兔g d f 9 的克隆与在性腺中的定位及表达丰度研究 业 中也有表达但信号很弱，而在睾丸中根本不表达2 钔，说明了g d f 9 的表达在物种之 间、组织之间存在差异。j a a t i n e n 等在新生大鼠中发现g d f 9 的转录水平在初生时 处于低水平，而在出生后第2 天随着初级卵泡的出现，g d f 9m r n a 的量迅速增加 2 9 1 。s e n d a i 等发现牛g d f 9 m r n a 不仅在腔前卵泡、早期有腔卵泡和未成熟的卵 母细胞中表达，而且一直到8 细胞期的胚胎仍能表达，但不在胚泡期表达【1 1 】，表明 g d f 9 可能对早期的胚胎发育起着生理上的作用。 h a y a s h i 等用g d f 9 抗体通过免疫组织化学分析大鼠卵巢切片，在卵母细胞的初 级卵泡、次级卵泡和腔前卵泡中都发现了g d f 9 蛋白【10 1 。a a l t o n e n 等发现 g d f 9 m r n a 和蛋白质在人卵巢初级卵泡的卵母细胞中充分表达，表明g d f 9 的转 录在卵泡形成的早期就被翻译了。 到目前为止，人们运用核酸原位杂交、测序分析r t 2 p c r 产物等技术己在多种 哺乳动物的多个组织中检测到了g d f 9 基因的表达，且在不同动物、不同部位表达 水平存在差异。 2 研究的目的和意义 目前对于生长分化因子9 ( g d f 9 ) 的研究主要集中于人、羊、小鼠、大鼠上， 而在作为重要经济动物的兔上尚未见任何报道，兔是一种重要的实验动物，其发 情具有不规律性，属于刺激性发情动物，对兔的g d f 9 进行研究，可以完善g d f 9 与生殖相关的理论。本次试验的主要目的是获得兔g d f 9 的部分c d n a 序列，为 分离和克隆兔g d f 9 基因全序列奠定基础；对兔性腺中g d f 9 蛋白表达进行定位， 用实时荧光相对定量定量p c r 法对兔下丘脑垂体性腺轴中及附睾和子宫中的 g d f 9 m r n a 表达丰度进行研究，以期了解g d f 9 在兔生殖中的作用。 季金强：兔g d f 9 的克隆与在性腺中的定位及表达丰度研究旦 1 实验材料 1 实验材料 1 1 实验动物 五月龄的新西兰大白兔雌兔3 9 只、雄兔1 0 只，购自江苏省南京金陵种兔场 ( 江苏南京) 1 2 质粒、菌株 p m d l 9 t 载体购自大连宝生物共司，d h 5 大肠杆菌由本实验室保存。 1 3 药品及试剂盒 s y b rp r e m i xe xt 硇7 m 荧光定量试剂盒、1 砷酶、d n t p 、i p t g 、x g a l 购自大连 宝生物公司； 焦碳酸二乙酯( d e p c ) 、d n a m a r k e r d l 2 0 0 0 购自北京百泰克公司； o c t 包埋剂购自上海西唐生物科技有限公司； r a b b i t a n t i g d f 9 、苏木素、即用型s a b c 免疫组化染色试剂盒、d a b 显色试剂盒、 多聚赖氨酸购自武汉博士德生物工程有限公司； t r i z 0 1 购自i n v i t r o g e n 公司； g 0 1 d v i e w 核酸染料购自s b sg e n e t e c hc o l t d ； b i o s p i n 胶回收试剂盒购自杭州博f 1 科技有限公司： f i r s ts t r 甜l dc d n a s y m h e s i s k i t 购自美国f e m e n t a s ( m b i ) 公司； 其它国产分析纯试剂均为国药集团提供。 1 4 主要仪器 c e 曲i f u g e5 8 0 4 r 冷冻离心机、m i n i s p i n 离心机( 德国e p p e n d o r f 公司) s w c j 1 f 单人双面超净工作台( 苏州净化设备有限公司) 、d h g 9 2 0 3 a 型电热恒 温鼓风干燥箱( 上海精宏设备有限公司) 、y d s 6 型液氮生物容器( 成都金风液氮 容器有限公司) 、恒温金属浴c h b 1 0 0 ( 杭州博同科技有限公司) 生化培养箱 p y x 2 8 0 s c ( 科利仪器) 、t h z - 2 2 台式恒温振荡器( 江苏太仓市实验设备厂) 、9 0 1 b 季金强：兔g d f 9 的克隆与在性腺中的定位及表达丰度研究 旦 磁力搅拌器( 上海司乐仪器有限公司) 、s i m f 1 2 4 制冰机( 日本三洋) 、x w 一8 0 a 微型漩涡混合仪( 上海沪西分析仪器厂有限公司) p c r 仪、a b l 7 3 0 0 荧光定量p c r 仪器、m o t i c 体式显微镜、c 0 2 培养箱( 上海力申 公司) ： 1 5 溶液配制及培养基【3 1 3 2 3 3 3 4 、3 5 】 0 1 d e p c 水：9 5 0 m l 三蒸水中叫1 m ld e p c ，定容至1 0 0 0 m l ，室温过夜，1 2 1 o 1 5 m p a 高也灭菌3 0 m i n 。 4 多聚甲醛： 3 7 9 多聚甲醛溶于8 5 0 m 1 三蒸水中，加热磁力搅拌6 0 6 5 ，至 透明，调p h 值至7 2 - 7 6 ，过滤后定容至1 0 0 0 m l ，4 保存。 0 0 2 mp b s ：n a c l8 5g ，n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 07 0 6g ，n a h 2 p 0 4 2 h 2 0o 5 2g 溶于 9 5 0 m 1 三蒸水中，调p h 值7 2 7 6 ，然后定容至1 0 0 0 m 1 ，室温保 存。 t e 缓冲液( p h 8 o ) 1 0 n u i l 0 1 lt h s - h c lc p h8 o ) l 皿n o 埘e d t a ( p h8 o ) 7 5 乙醇：7 5 m 1 无水乙醇加d e p c 水至1 0 0 m l - 5 t b e ： t r i s - b a s e 5 4 9 、硼酸2 7 5 9 、o 5 m e d l a ( p h 8 o ) 2 0 m l 加三蒸水 9 5 0 m l ，混匀定容至1 l 。 3 m n a a c ：n a a c7 8 1g 、d d h 2 08 6 0 m 1 加冰乙酸调p h 至5 2 ，定容至l l ， 高压灭菌。 l b 液体培养基b a c t o n 科o n e1 0 lb a c t 0 一y e a s te 加a c t5 刚n a c l l o 鲋p h7 0 高压 灭菌。 l b 固体培养基：1 l 液体培养基中加a g a r l 5 9 高压灭菌。 l b 固体培养基( a m p ) ：l b 固体培养基高压灭菌后冷却至5 0 6 0 ，加a m p 至终浓度5 0 咖l 。 o 0 1 m 枸橼酸盐缓冲液：1 0 0 0 m 1 蒸馏水中加入枸橼酸钠3 9 ，枸橼酸o 4 9 。 季金强：兔g d f 9 的克隆与在性腺中的定位及表达丰度研究 旦 2 实验方法 2 1g d f 9 基因部分c d n a 的克隆与序列分析 所有的采样器具均要进行无r n a 嬲e 处理。金属和玻璃器具充分洗净后，2 0 0 烘箱中烘烤5 h 。塑料试管，吸头等用o 1 d e p c 水浸泡2 4 h 以上，然后高压、烘 2 1 2 样品的采集 耳缘静脉注射空气处死兔子，采集卵巢，迅速放入液氮中进行保存 2 1 3 总r n a 的提取 用组织研磨器将液氮保存的组织，按t r i z o lr e g e m k i t 说明书提取总r n a 。具 体步骤如下： l 转入无r n a 船。的。，m 。皇心管内，室温放置，m i n l 4 1 0 o o g 离心5 m 了取上清 。，。g 离心。；m i n ，取上清 j 季金强：兔g d f g 的克隆与在性腺中的定位及表达丰度研究坐 加入1 m 1 7 5 乙醇洗涤沉淀 4 ，。哩离心弋m m ，弃上清 室温放置凉干( 不易过干，否则难于溶解) 3 0 “1 d e p c 处理水充分溶解 2 1 4 总r n a 的d n a s e 处理 本次实验所设计引物是不跨内含子的，为避免用于i m p c r 的总r n a 中 有d n a 污染，所提取的总r n a 需进行d n a s e 处理。处理步骤如下： 1 在微量离心管中配制下列反应液，全量5 0u1 。 全r n a2 0 5 0 ug 1 0 d n a s e i b u f f e r5 “l d n a s e i ( i t n a s e 一雠e ，5 u u 1 )2 u l r n a s ei n h i b i t o r ( 3 7u u1 )0 5u1 d e p c h 2 0 u p t 0 5 0 u1 2 3 7 反应2 0 3 0 r n i n 。 3 力入5 0ul 的d e p ch 2 0 。 4 加入1 0 0 u 1 ( 等量) 的苯酚氯仿异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ，充分混匀。 5 离心，取上层( 水层) 移至另一微量离心管中。 6 加入1 0 0 ul ( 等量) 的氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) ，充分混匀。 7 离心，取上层( 水层) 移至另一微量离心管中。 8 加入1 0 ul ( 1 ，1 0 量) 的3m n a 0 a c ( p h 5 2 ) 。 9 加入2 5 0 “l ( 2 5 倍量) 的冷无水乙醇，2 0 放置3 0 6 0 m i n 。 1 0 离心回收沉淀，用7 0 的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。 1 1 用适量的去离子甲酰胺溶解。 l+ 季金强：兔g d f 9 的克隆与在性腺中的定位及表达丰度研究 坚 处理后的r n a 经1 琼脂糖凝胶电泳分析和紫外分光光度计定量后于一2 0 保 存备用。 2 1 5i u 二p c r 2 1 5 1 引物设计 根据g e l l b a l l k 中人 n m 0 0 5 2 6 0 3 】和鼠 n m 0 0 8 1 1 0 g d f 9 基因序列应用 p r i i n e 5 0 和o l i g o 设计两对引物，引物序列如下： g d f 9f i ：5 t c c t c c t i t g g t r r r g c t g 于 g d f 9r 】：5 g g a 芦l t c c c l l c c t t g g t a g c 3 o d - 。9f 2 ：5 一c a a c cic a g c o a a ：l a cll c a a a c a - 3 g d f 9r 2 ：5 ，一g a g c c g t c g g g t t c a a t g g t c a a 一3 引物由上海英骏生物技术有限公司合成。 2 1 5 2c d n a 第一链合成 提取的总r n a 按照c d n a 第一链合成试剂盒说明书进行，反转录合成c d n a 第一链。具体步骤如下： 冰上放置p c r 管 分别加入：总r n a 2 l 、 0 1 i g o ( d t ) 1 81 山l t o t a l1 2 肛1 d e p c 处理水 9 1 j i 离心3 5 s ，7 0 5 m i n 冰浴3 0 8 ，然后离气3 5 s 冰上放置 分别加入：5 r e a c t i o nb u 脓 r n a s i n d n t p 锚1t 。谢脚。 2 肛1 j 季金强：兔g d f 9 的克隆与在性腺中的定位及表达丰度研究堕 轻轻混匀后离心3 5 s ；3 7 5 m i n i 加入m m l 、r1 u l ；4 2 6 0 m i n 7 0 加热1 0 m i n 结束反应，冰浴5 m i n ，冷冻保存备用。 2 1 5 3p c r 扩增目的基因 以按上述方法合成的c d n a 第一链为模板进行p c r 扩增，反应体系为： c d n a2 5 u l 1 0 b u 毹r2 u l d n t p1 6 u l 上游引物0 7 u l 下游引物0 7 “l t 砘酶0 2 l d h 2 01 1 6 i f i n a l 、b l u m e2 0 u 1 反应条件： 薹兰k 出。5 6 3 0 s 3 5c v c l e s p c r 产物经1 5 琼脂糖电泳、e b 染色后，在紫外灯下切下目的基因片段 用琼脂糖胶回收试剂盒回收纯化。 2 1 6p c r 产物的克隆及鉴定 2 1 6 1 感受态细胞的制备 1 挑取d h 5 a 大肠杆菌原种，在l b 平板上划线过夜。 2 挑取新鲜单菌落，接种到1 0 0 m l l b 液体培养基中，3 7 摇菌培养2 3 h + 季金强：兔g d f 9 的克隆与在性腺中的定位及表达丰度研究旦 ( 1 6 0 r 咖m i n ) 。至o d 值达到o 4 一o 5 将菌液移至灭菌预冷的1 0 0 m 1 离心管中，冰 浴l o 1 5 m i n 。 3 3 7 0 0 r d r r 她i n 离心1 0 m 血，回收细菌沉淀。 4 力入2 0 m l 经过过滤除菌并预冷的0 1 m c a c l 2 悬浮细菌沉淀，然后冰浴1 0 一1 5 m i n 。 5 3 7 0 0 r p m m i n ，4 离心1 0 m m 钟，回收细菌沉淀。 6 加入4 m 10 1 m c a c l 2 悬浮细菌沉淀。该细胞可直接用于转化实验。加甘油至浓度 为1 5 2 0 ，混匀，每份分装成1 0 0 ul 于1 5 m l 的指形管中，冻存于- 7 0 冰箱中。 将p c r 产物用b i o s p i l l 胶回收试剂盒回收纯化，具体操作参照试剂盒进行。 纯化后p c r 产物用p m d l 9 t 载体试剂盒连接，总体积为1 0 1 ，1 6 连接l o h ，反 应体积如下： 连接反应体系组成 p m d l 9 - t p c r p u r i f i e dd n a s 0 1 u t i o ni f i n a l 、b l 岫e 体积 1 u 1 4 u 1 5 u l 1 0 u 1 2 1 6 2 转化 从7 0 冰箱中取出保存的感受态细胞，冰浴助溶。每1 0 0u1 感受态细胞加入 1 0ul 连接产物，冰浴3 0 m i n 。4 2 水浴热应激9 0 s e c ，立即置入冰浴中2 m i n ，加 入4 0 0 “1 不含a m p 的液体l b 培养基。3 7 复活5 0 m i n 。取1 0 0 u1 铺于l b 平板 上。平板含1 0 0 肛m l 氨苄青霉素的l b 平板上( 3 7 “l x g a l ) ( 1 0 m g m 1 ) 和5 “1 i p t g ( 1 m 0 1 l ) ，3 7 恒温培养1 0 1 5 h 。白色菌斑应含重组质粒。 2 1 7 核酸序列测定与分析 按照2 2 5 3 体系做菌液p c r 鉴定，阳性克隆菌液由上海英骏生物技术有限公 司进行正、反两方向序列测定。所获得序列用b l a s t 程序与g e n b a n k 中已发表的 g d f 9 序列进行同源性比较，并用d n a s t a r 软件进行序列分析。 2 2 g d f 9 m r n a 组织表达谱 季金强：兔g d f 9 的克隆与在性腙中的定位及表达丰皮研究堕 2 2 1 样品采集 采集公兔下丘脑、垂体、睾丸、附睾，母兔下丘脑、垂体、卵巢、子宫组织，方 法同2 1 2 2 2 2 r n a 提取 方法同2 1 3 2 2 3 d n a s e 处理 方法同2 1 4 2 2 4i u 二p c r 以磷酸甘油醛脱氢酶( g a p d h ) 为内参，设计引物，扩增片段为2 4 3 b p ， g a p d hf ：5 a a g g t c a t c c a c g a c c a c l v r 3 g a p d hr ：5 a g g c c a t g c c a g t g a g t r - 3 g d f 9 引物为： g d f 9f ：5 t c c t c c t 丌g g t t t t g c t g 3 。 g d f 9r ：5 一g g a a t c c c t t c c t t g g t a g c 一3 r t - p c r 法同2 1 5 2 2 1 5 3 2 3g d f 9 在免性腺中的定位 2 3 1 器皿的处理 载玻片和盖玻片用洗衣粉充分浸泡洗涤，烘干后在清洁液( 重铬酸钾1 0 0 9 ： 浓硫酸1 0 0 m 1 ：蒸馏水1 0 0 0 m 1 ) 中浸泡过夜，取出后用清水冲洗数分钟，水流要有 一定压力，然后用双蒸水冲洗，烘干f 3 3 】。然后用多据赖氨酸浸泡5 分钟进行防脱 片处理，过夜风干或6 0 1 h ，4 保存。 2 3 2 石蜡切片的制作 1 固定。取样后修剪成长为l c m ，宽o 5 c m ，厚度不超过o 5 c m 的小块。在4 的 季金强：兔g d f 9 的克隆与在性腺中的定位及表达丰度研究旦 多聚甲醛中固定4 5 h 。 2 脱水。7 0 酒精脱水3 h ；8 0 酒精脱水2 h ；9 5 酒精脱水1 5 h ，中间换一次液体； 1 0 0 酒精脱水l h ，中间换一次液。 3 透明。1 2 无水乙醇+ 1 2 二甲苯透明3 0 m i n ；二甲苯中透明3 0 m i n 。 4 透蜡。1 2 二甲苯+ 1 ，2 融蜡中透蜡3 0 m i n ；融蜡中透蜡1 5 h 5 包埋。融蜡迅速倒入小纸盒中，快速置入组织块。小纸盒置于冷水中，使蜡凝 固。 6 切片 7 烤片5 5 烘箱中放置片4 8 h ，然后置于切片盒中保存。 2 3 3 免疫组化操作步骤 1 载玻片防脱片剂处理：可选择a p e s 或p 0 1 y l y s i n e 。捞片后置烤箱5 8 - 6 0 3 0 一6 0 m i n 以使切片紧密粘附。 2 切片常规脱蜡至水。 3 3 0 h 2 0 21 份+ 蒸馏水1 0 份混合，室温5 - 1 0 m i n 以灭活内源性酶。蒸馏水洗3 次。 4 热修复抗原：将切片浸入o 0 1 m 枸橼盐缓冲液( p h 6 o ) ，电炉或微波炉加热至沸 腾后断电，间隔5 1 0 m i n 后反复1 2 次。冷却后p b s ( p h 7 2 7 6 ) 洗涤1 2 次。 5 滴加5 b s a 封闭液，室温2 0 m i l l 。甩去多余液体，不洗。 6 滴加适当稀释的一抗( 小鼠或兔i g g ) ，3 7 l h 左右或2 0 时2 h 左右。也可 4 过夜。p b s ( p h 7 2 7 6 ) 洗2 m i n 3 次。( 一抗的稀释度、孵育时间和温度与 染色强度、背景有直接关系。一般来说，阳性染色强度不够时，可提高一抗浓度 和延长孵育时间；背景过高时，可降低一抗浓度和缩短孵育时间。) 7 滴加生物素化山羊抗小鼠i g g ( 或兔、人i g g ) ，2 0 3 7 2 0 m i n 。p b s ( p h 7 2 7 6 ) 洗2 m i n 3 次。 8 滴加试剂s a b c ，2 0 - 3 7 2 0 耐n 。p b s ( p h 7 2 7 6 ) 洗5 m i n 4 次。 9 d a b 显色：使用d a b 显色试剂盒( a r l 0 2 2 ) 。取1 m l 蒸馏水，加试剂盒中a ，b ，c 试剂各1 滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时自j ，一般在5 3 0 m i n 之间。 季金强：兔g d f 9 的克隆与在性腺中的定位及表达丰度研究垫 也可自配显色剂显色。蒸馏水洗涤。 l o 苏木素轻度复染。脱水，透明封片。显微镜观察。 2 4g d f 9m r n a 表达实时荧光定量检测 因兔g d f 9 基因序列信息未知，所以参考其它哺乳动物的g d f 9 序列信息在 保守区域设计特异性的引物，然后利用s y b rg