（茶学专业论文）农杆菌法介导反义咖啡碱合成酶基因转入茶树成熟胚的研究.pdf

摘要 利用基因工程进行茶树遗传改良的研究一直被受人们的关注。本研究以龙井4 3 4 、 槠叶种、农抗早优良品种为材料，通过建立合适的再生体系，利用农杆菌法转化，将 含有反义t c s 基因的工程菌，导入龙井4 3 。、槠叶种、农抗早优良品种茶树成熟胚， 并通过g u s 瞬时表达情况对农杆菌法转化参数进行了优化，用k a r l 对转化后的材 料进行筛选，获得以下结果： 1 茶树成熟胚的培养 本研究在前人基础上首次以成熟胚作为外植体培养，建立了愈伤组织再生体系和 胚萌发体系，为茶树的遗传转化奠定了基础。研究证明：在愈伤组织再生体系中，培 养基和基因型是影响成熟胚愈伤组织诱导和再生频率的主要因素。龙井4 3 “和农抗早 在附加2m g l 2 , 4 d 、o 5 m g l k t 的m s 培养基上出愈率最高，而槠叶种则在附加2 m g l 2 , 4 一d 、1 0 m g l k t 的m s 培养基上诱导效果较好。基因型主要影响愈伤组织的 再生频率，龙井4 3 4 分化率为1 4 2 ，而农抗早分化率为8 5 ，槠叶种分化率为3 3 ， 根的分化率达到4 0 ，获得完整植株大概需要一年半的时间：在胚萌发体系中，成 熟胚直接培养，快速获得再生苗，2m g l6 - b a 的m s 培养基适合成熟胚直接培养获 得幼苗，添加2m g l i b a ，根的分化率达到8 6 ，大概需要半年时问可以培养出生 长健壮的幼苗。 2 农杆菌转化体系的建立 通过g u s 瞬时表达对农杆菌法转化条件进行了优化。结果表明：预培养3 天， 农杆菌浓度o d 6 0 0 为0 6 ，乙酰丁香酮浓度为5 0 0 1 t m o l l ，共培养5 天时，g u s 基因 具有较好的表达效果。 3 转化体的筛选结果 对成熟胚进行k a n 敏感性实验，确定了不同筛选阶段的k a n 选择压浓度：成熟 胚生长、生根时k a n 分别为5 0m g l 、7 5m g l 。为了减少c a r b 对成熟胚生长的抑制 作用，以4 0 0m g lc a r b 作为抑菌剂的浓度。用建立的转化体系和筛选方案对三个品 种进行转化，得到1 0 株抗性茶树幼苗，利用r t - p c r 法对转基因植株进行了检测。 关键词：茶树，成熟胚，反义t c s ，农杆菌，转化 a b s t r a c t t e a ( c a m e l l i as i n e n s i s 皿) o k u n t z e ) i sp r i m a r yt a r g e tf o rt h ea p p l i c a t i o no f g e n e t i c e n g i n e e r i n gt oi m p r o v i n ga g r o n o m i cc h a r a c t e r i s t i c i nt h i sp a p e r , s o m eo f t h e e x c e l l e n t r e g e n e r a t i o ns y s t e mi nt e ap l a n tw e r ee s t a b l i s h e d t h em a t u r ee m b r y o s u s e da sr e c e p t o rt o b et r a n s f o r m e db y a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sw i t ha n t i s e n s et c sg e n ea n dt h ep a r a m e t e ro f t r a n s f o r m a t i o nw e r eo p t i m i z e db yg u st r a n s i e n te x p r e s s i o n t h em a t u r ee m b r y o sw e r e c u l t u r e do ns e l e c t i o nm e d i aw i t hk a n t h em a i nr e s u l t sh a db e e no b t a i n e da sf o l l o w s ： 1 、c u l t i v a t i o no f m a t u r ee m b r y o s b ye s t a b l i s h m e n to fr e g e n e r a t i o ns y s t e m s ，m a t u r ee m b r y o si n d u c e dy o u n gp l a n tf i r s t l y , w h i c hi st h eb a s eo fh e r e d i t yt r a n s f c i r m a t i o no nt e ap l a n t i nt h ec u l t i v a t i o n ，t e ap l a n t g e n o t y p e ，c o n c e n t r a t i o no fh o r m o n ei nt h em e d i u ma r et h ek e yf a c t o r st h a ti n f l u e n c eo f c a l l u sa n dp l a n tr e g e n e r a t i o n t h eo p t i m i z ec o n c e n t r a t i o no f2 , 4 - da n dk ti sd e f f e r e n t ，a s f o ra sl o n gj i n g4 3 4a n dn o n gk a n gz a o ，o p t i m a lm e d i u mw a sm ss u p p l e m e n t e dw i t h2m g l 2 , 4 da n d0 5 m g lk t ，b u ta sf o rc h uy ez h o n g ，o p t i m a lm e d i u mw a sm ss u p p l e m e n t e dw i t h 2 m g l2 , 4 - da n d1 0 m g lk t g e n o t y p em a i n l yi n f l u e n c e st h er e g e n e r a t i o nf r e q u e n c yo f c a l l u sf o r m a t i o n , 1 4 2 b u d sr e g e n e r a t i o nf r e q u e n c yc a nf o r mb yl o n g j i n g4 3 ”，8 5 b u d s r e g e n e r a t i o nf r e q u e n c yc a nf o r mb yn o n gk a n gz a o 3 3 b u d sr e g e n e r a t i o nf r e q u e n c yc a n f o r mb yc h uy eh a n g ，a n dt h e r ei s4 0 r o o tf o r m a t i o nf r e q u e n c y b yi n d u c e dc a l l u st r a c k ， m a t u r ee m b r y o sn e e d e dm o r eo n ey e a rc u l t i v a t ei n t e g r a t et e ap l a n t t h em sm e d i u mw i t h2 m g l6 - b aw a ss u i t a b l ef o rm a t u r ee m b r y ot oc u l t u r ey o u n gp l a n td i r e c t l y r o o tf o r m a t i o n f r e q u e n c yi s8 6 m a t u r ee m b r y o sc u l t i v a t e ds t u g g yt e ap l a n td i r e c t l yw h i c h n e e dm o r eh a l f o n ey e a r 2 、e s t a b l i s h m e n to f a g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o ns y s t e m s t h ec o n d i t i o n so fi n f e c t i o nw e r eo p t i m i z e db yg u st r a n s i e n te x p r e s s i o n t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tc o n c e n t r a t i o no fa g r o b a c t e r i u mi s0 6 ，t h ee f f i c i e n td e n s i t yo fa si s5 0 0 g m o l la n dt h et i m eo f c o c u l t i v a t i o ni s5d a y s 3 、s e l e c t i o na n dr e s u i t s e l e c t i o ns y s t e mo fh i g he f f i c i e n c yw a sd e t e r m i n e db yd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no fk a n m a t u r ee m b r y o sg r o w t ha n dr o o t i n gc o n c e n t r a t i o nw e r e5 0m g la n d7 5m g lr e s p e c t i v e l y e 髓c t i v ec o n c e n t r a t i o no fc a r bw h i c hr e s t r a i n sa g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n si s4 0 0 m g l u n d e rt h es e l e c t i o no fk a n ，t h e r ea r e1 0y o u n gt e ap l a n t ，w h i c hw e r ec h e c k e db yr ，r p c r t e c h n o l o g y k e yw o r d s ：t e ap l a n t ( c a m e l l i as i n e n s i s ) ，m a t u r ee m b r y o s ，a n t i s e n s et c sg e n e ，a g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s ，t r a n s f o r m a t i o n i i 独创性声明 本人声明所呈的学位论文足本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得安徽农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：邋 签字日期：叠印6 年莎月万日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文 的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交沦文的复印件和电子 文件，允许论文被查阅和借阅。本人授权安徽农业大学可以将学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文( 保密的学位论文在解密后适 用本授权书) 。 学位论文作者签名：拯 签字日期：孑卯5 年莎月心日 学位论文作者毕业后去向 工作单位 通信地址 指导教师签名 签字日期：年月日 电话 邮编 一、文献综述 1 1 茶树组织培养 茶树的组织培养从1 9 世纪8 0 年代就已经有科学家开始研究，f o r r e s t 1 首次通过茶 树组织培养研究茶叶中多酚类物质的代谢。此后，茶树组织培养方面的研究全面展开。 至今，叶片1 2 】，予叶【3 】，腋芽【4 】、子叶柄【5 】、下胚轴6 】和茎段【7 一l 、幼叶【1o ，i i , 1 甜、叶柄 【1 3 14 1 、茎切段【1 5 1 6 1 等多种外植体诱导出愈伤组织、芽和胚状体，然而但并不是愈伤 组织、胚状体都能发生器官分化，且分化率普遍不高。 植物组织培养时，外植体必须经过脱分化和再分化才能生长成完整的植株。外植 体脱分化时，可能形成愈伤组织，也可能不形成愈伤组织。两种情况都可以通过胚胎 或器官发生再生植株。植物愈伤组织培养，先发根往往抑制芽的形成，需要比较复杂 的处理( 如多次转移) 才能长芽，然后形成完整植株。茶树叶片诱导愈伤组织培养也 会产生大量的不定根，但继续培养不能诱导出不定芽【1 7 】。 1 1 1 愈伤组织诱导 愈伤组织的诱导是植物组织培养中的一个重要阶段，它的主要作用是促使被培养 的植物细胞经历脱分化过程。在维织培养中，指在人工培养基上由外植体长出来的一 团无序生长的薄璧细胞。由于愈伤组织再生系统的建立是细胞培养、原生质体培养、 细胞融合及遗传转化等的基础，因而研究茶树愈伤组织的再分化具有重要的学术价 值。 早在1 9 7 6 年，台湾吴振铎【1 8 佣祁门种的子叶诱导愈伤组织，经6 0 次的继代培 养和移植，培养出一批试管苗。1 9 8 6 年，k a t o 【l l 】报道从茎段培养的愈伤组织中分化 出植株。1 9 9 0 年，p h u k a n 等【1 9 l 以无菌苗茎切段为外值体，在m s 附加1m g l n a a + 3m g l6 - b a 培养，从愈伤组织获得丛芽。1 9 8 8 年，蒋祖丰1 2 。】以予叶柄为外值体，诱 导愈伤组织再分化获得幼苗。1 9 8 9 年，刘德华等【5 】以毛蟹品种的叶柄为外值体，在 m s 附加1 0 m g l 6 - b a + o 5 m g l n a a + 3 m g l g a 3 培养，叶柄切片形成的愈伤组织 能分化芽，将芽插入m s 附加4m g l6 - b a 、2m g li b a 、1m g lg a 3 的培养基中能 生根形成完整的小植株。2 0 0 0 年，孙仲序等 9 1 对山东茶树品种进行嫩茎段培养，在 m s 附加4 m g l 6 - b a 、0 5 m g l z t ，获得最佳分化率为8 3 ，再1 2 m s 附加o 2 m g l i b a 、2 0 9 蔗糖，获得最佳生根率为6 0 。2 0 0 3 年，袁正仿等仁”以薮北种茶树带腋芽 的茎段为外植体获得再生植株，并建立起快速无性繁殖体系。2 0 0 3 年，谭和平等【2 2 以不同茶树品种的腋芽为接种外植体，通过多种培养基配方的筛选，得出适宜各参试 品种的培养基为1 2m s + 2 m g lb a + 1 1 5m g li a a + 5 0 0c h ，7 8 周后诱导出芽且 部分出现丛芽，但没有诱导出完整的植株。2 0 0 3 年，张建华2 3 1 以茶树新梢腋芽、茎 段为试验材料，在m s + 4 m g l b a + 0 1m g l n a a 中诱导出愈伤组织并能分化出， 虽然通过茶树新梢带腋芽茎段，可以诱导出愈伤组织并能分化出芽，但在继代过程中 发现其生长速度较慢，要使试管菌生长更快、更旺、更符合大规模生产的要求还有待 进步研究。 l ，1 2 体细胞诱导 体细胞发生，或不定胚的诱导形成，是植物组织培养中的另重要途径。通过体 细胞途径产生再生植株有3 个明显的特点：首先，在一个培养物上所能产生的胚状体 数目往往比不定芽的数目多；其次，胚状体形成的速度快；第三，胚状体结构完整， 一旦形成，一般都可以直接萌发形成小植株，因此成苗率较高1 2 4 l 。 在茶树组织培养中胚状体的发生，子叶口5 ，2 6 ，2 7 ，2 9 一o , 3 1 1 、子叶柄雌1 4 ，3 1 捌和叶片 1 0 ， 2 8 】培养中都有过报道。1 9 8 1 年，莫典义等通过种胚培养诱导完整的植株。1 9 8 3 年， 颜慕勤等【2 6 j 用改良e r 培养基，通过子叶及子叶柄分别诱导出愈伤组织和胚状体，并 获得完整植株。1 9 8 6 年，k a t o t 峙匣道在子叶培养中通过体细胞发生获得再生植株。 1 9 8 8 年，s a r a t h c h a n d r a i o l 用叶片培养，愈伤组织诱导出类似胚结构，但是没有获得小 植株。1 9 8 8 年，王立等【2 7 】用1 3 个品种的未成熟胚在e r + 2 5m g ，ln a a 等培养基诱 导胚状体发生。1 9 9 0 - 2 0 0 0 年，刘德华等【1 3 ，1 7 】报道了子叶培养在5 0 0 0l x 光照培养， 胚状体分化率较高，而予叶柄的胚状体分化率随着光照培养下降而降低，在连续黑暗 条件下培养，畸形胚发生率比较高。畸形胚主要可分为多子叶胚、子叶膨大胚、单极 胚、愈伤组织化胚。1 9 9 4 年，王毅军【2 8 1 等以茶树叶片为外值体，在m s 培养基中附 加4 m g 几6 - b a 、2m e c li a a 、3 m g lg a 3 和o 2 - - - 0 3m g l 活性炭，诱导出胚状体， 进一步形成小植株。2 0 0 0 年，b a l a s u b r a m a n i a n 等1 2 9 将初级体细胞胚分离后接种于含 0 1 3 m g l b a 、o 1 2 m l i b a 、o 1 - 2 m e c l i a a 和5 m g l g a 3 的m s 或b 5 培养基 上，可诱导产生次级体细胞胚。2 0 0 1 年，在m o n d a l 等1 3 0 j 的研究中，每个由去胚子叶 诱导的初级体细胞胚上可以长出1 0 1 5 个次级体细胞胚，在添加有2m e c lb a 、0 2 m l i b a 、0 2 m g l i b a 和1g l l g l u t a m i n e 的m s 培养基上，这种由初级体细胞胚， 这种由初级体细胞胚转变为次级体细胞胚的能力可以保持5 年。 1 1 _ 3 再生体系 成功的基因转化首先要建立良好的植物再生体系。植物再生体系是指用于转化的 外植体通过组织培养或其它非组织培养途径，能高效、稳定的再生无性系，能接受外 源d n a 整合，对选择抗生素敏感。茶树基因转化受体体系应具备的条件是：高效 稳定的再生能力，转化受体必须易于再生，很高的再生频率，并且具有良好的稳定性 和重复性。较高的遗传稳定性具有稳定的外植体来源对选择性抗生素敏感， 即当选择性培养基中筛选荆浓度达到一定值时能够抑制非转化植物细胞的生长、发育 和分化，而转化的植物细胞由于携带有抗性基因能正常生长、分裂和分化，得到完整 的转化植株i j “。 到目前为止，在茶树组织培养中植株分化虽已从子叶【2 5 , 2 6 , 2 7 , 2 9 , 3 0 , 3 1 1 、子叶柄呲h 3 1 1 、下胚轴川和茎段1 7 l 等外植体诱导出丛生芽的报道，但成功的例子仍太少，根芽 分化的必要条件仍不十分清楚，再分化率低，因此，建立良好的再生体系是茶树遗传 转化的一个重要环节，关系到提供适宜转化的受体材料以及转化后的细胞能否再生为 正常植株等问题。 1 2 茶树遗传转化研究进展 1 2 1农杆菌介导茶树遗传转化 目前，转基因的方法虽然很多，但都有其使用范围及局限性，对于大部分双子叶 植物来说，最成熟的还是简便易行的农杆菌法转化。茶树是双子叶植物，农杆菌转化 法是茶树转基因值得尝试的一种手段。 1 9 9 4 年，张学文等1 3 4 】进行了根癌农杆菌转化茶树方面的尝试，通过将根癌农杆 菌与茶树愈伤组织共培养，可达到5 的抗性愈伤组织诱导率。此后，人们对根癌农 杆菌转化茶树过程中各种因素进行了比较广泛的研究。 在转化体的筛选剂方面，骆颖颖等【3 5 1 认为潮霉素作为愈伤组织的筛选剂优于卡那 霉素，而对于茶树叶片则以卡那霉素作为筛选剂为宜。赵东等【3 6 】研究发现，5 0m g l 卡那霉素可以有效地抑制叶片愈伤组织的形成，是较为适宜的筛选剂浓度。而 m a s u m o t o 等人刚则用2 0 0m g l 卡那霉素作为筛选剂，并获得了一些抗性愈伤组织。 用高浓度的抗生素，可以避免假阳性转化体的发生，减轻了后来的鉴定工作。 在农杆菌转化过程中，农杆菌的过度生长可引起对外植体的毒害作用，阻碍其生 长，甚至导致其死亡。茶树转化过程中使用最多的脱菌剂是羧苄青霉素。m o n d a l 等【3 卅 发现，使用4 0 0m g ls p o r i d e x 也可以有效杀灭农杆菌，而且对外植体的生长影响很 小。 乙酰丁香酮可以促使农杆菌向伤口处集中，促进侵染过程的发生，目前已在多种 植物的遗传转化中使用。m a s u m o t o 等【3 7 1 研究发现，没有添加乙酰丁香酮的处理不出 现抗性愈伤组织，而当乙酰丁香酮浓度增加到5 0 0l a m o l l 时，抗性愈伤组织的发生 率及其生长状况大大提高，说明乙酰丁香酮有利于农杆菌介导的茶树的转化。但 m o n d a l 等i 训认为乙酰丁香酮不能提高转化率。 2 0 0 1 年，m o n d a l 等 3 0 】对农杆菌转化系统进行了系统的研究。他们发现，外植体 的预培养和伤口刺激不能提高转化率；当细菌生长至o d 6 0 0 值为o 6 0 ，菌液浓度1 0 9 个m l 时适合用于转化；共培养5 天、共培养用的培养基p h 值为5 6 时有利于提高转 化率。 1 2 1 1 农杆菌介导遗传转化的机理 在植物基因工程的发展中，研究最得清楚和应用最广的是农杆菌介导的遗传转 化。农杆菌转化系统是一种天然的基因转化系统，转化植物细胞的农杆菌有2 类，即 根癌农杆菌和发根农杆菌，它们同属于根瘤菌属，革兰氏阴性菌。农杆菌可以将自己 的一部分d n a ( t - d n a ) 转移入植物细胞，并获得再生植株。根癌农杆菌所含质粒 是n 质粒，发根农杆菌所含质粒是r j 质粒。在茶树农杆菌遗传转化中，大多数应用 的是t i 质粒3 q3 4 , 3 5 , 3 6 , 期。根癌农杆菌的t i 质粒上含有可转移d n a ( t - d n a ) 区、 毒性区( v i r 区) 以及冠瘿碱代谢基因编码区。t - d n a 两端是2 个2 5 b p 的重复序列，分 别称为左边界和右边界，2 个边界之间是生长素和细胞分裂素合成基因以及冠瘿碱合 成基因。v i r 区含有多个基因，如v i r a 、v i r b 、v i r c 、v i r d 、v i r e 、v i r g 、v i r h 等，根 癌农杆菌将t - d n a 转移进植物细胞主要依赖t i 质粒上一系列v i r 基因的表达。植物 受伤窖时分泌一些酚类物质，v i r a 可感受酚类化合物的刺激，磷酸化变为活化状态， 然后将v i r g 磷酸化，v i r g 作为细胞质“反应调节”蛋白，被活化后结合到v i r 基因启 动子的特定区域，使v i r b 、v i r c 、v i r d 、v i r e 、v i r e 、v i r h 等几个基因表达【3 引。其中， v i r d l v i r d 2 共同作用下切开t - d n a 的边界序列，v i r d 2 蛋白在切割后还结合在 t - d n a5 端，其c 端的n l s s 序列( n u c l e a rt a r g e t i n g ) 将t - d n a 导向植物细胞，v i r c 基因通过结合在右边界附近的非t - d n a 区域增强v i r d 2 对右边界的切割效率，单链 结合蛋白v i r e 结合到t - d n a 单链上形成t - d n a 复合体，在v i r b 作用下t - d n a 复合 体通过农杆菌细胞膜进入植物细胞并整合到植物基因组中p 圳。 1 2 1 2 农杆菌转化的优点 与其他方法相比有以下优点h 0 1 ：该转化系统是模仿或称之为利用天然的转化 载体系统，成功率高、效率高。从转化质量看，农杆菌转化的外源d n a 结构完 整，转化机理清楚，整合位点较为稳定。农杆菌系统是一种生物转化系统，具有 主动性，它选择性地转移t i 质粒上以2 个2 5 b p 的重复序列为两端的t - d n a ；在v i r d 2 的帮助下，它可以主动地插入植物基因染色体上。t - d n a 上含有引导d n a 转移和 整合的序列，以及能被高等植物细胞转录系统识别的功能启动子和转录信号，使插入 到t - d n a 区的外源基因能够随同t - d n a 一道在植物细胞中表达。整合进植物基 因组中的t - d n a 及插入其间的外源基因能够在再生植株的各种组织器官中特异性表 达，即可进行人为地控制。农杆菌t i 质粒转化系统转化的外源基因以单拷贝为多 数，并且多数符合孟德尔遗传规律，因此转基因植株能较好地为育种提供中间选育材 料。 1 2 2 基因枪介导茶树遗传转化 基因枪法和农杆菌法是当前最常使用的两种基因转化方法。由于基因枪法具有不 受宿主限制、靶受体类型广泛、可控度高和操作简便快速等优点，所以近年来在植物 中得到了广泛的应用。1 9 9 5 年，奚彪1 4 1 】将基因枪作为介导转化的工具应用到茶树遗传 转化研究上，比较了基因枪不同发射压力、入射次数对体胚再生频率的影响，结果显 示，单枪入射时，发射压力11 0 0 1 3 0 0p s i 时，再生频率在2 0 一3 0 之间；轰击两次 时，1 3 0 0p s i 会造成过多的伤口，不易再生新的体胚；同时对转化体进行高渗处理， 不仅使g u s 瞬间表达频率下降，而且新体胚再生也困难。 1 9 9 9 年，a k u l a 等【4 2 】在茶树遗传转化过程中使用了基因枪法，通过检测轰击3 0 4 0 h 后的g u s 基因瞬时表达情况，优化了基因枪法转化茶树的各项参数，结果g u s 基因 最大瞬时表达水平达到每枪1 0 8 5 蓝斑。 2 0 0 3 年，吴姗【4 3 】用基因枪轰击茶树叶片愈伤组织，获得基因枪转化系统的优化体 系，得到g u s 表达，转化后抗性愈伤组织存活率为5 0 - 1 2 1 。 到目前为止，近十几年茶树遗传转化已取得了一些重要的进展，但是还没有建立 完善的茶树遗传转化体系，茶树遗传转化还处在起步阶段。 1 3 反义r n a 技术及其在植物中的应用 1 3 1 反义r n a 的作用机理 生物的遗传信息存在于d n a 或r n a 链上。在转录过程中，作为模板转录m r n a 的一条链称为反义链或模板链，与之互补的另一条非模板链称为有义链。由有义链可 转录成反义r n a ( a n t i s e n s er n a ) 。反义技术以互补的核酸链能够形成双股螺旋的原理 为基础，利用反义基因转录的反义r n a 来抑制目标性状中靶基因的表达，进而达到修 饰目标性状的目的。在质粒的复制以及转座子的转座作用中，反义r n a 的调控起着重 要的作用，其作用方式主要表现在以下三种【4 4 j ： 1 ) 在d n a 复制水平的调控 最初从研究e e o l i 质粒复制中发现的一条约1 0 0 b p 长的反义r n a 可以与作为转录 起始引物的r n a 形成杂交体，从而阻止了引物r n a 与质粒d n a 的结合，降低了质粒 复制的活性，控制着质粒拷贝数的变化。 2 1 对基因转录的调控作用 有些科学家认为，大肠杆菌的c a m p 受体蛋白( c r p ) 合成自我调节属这种形式， 当c a m p 过量存在时，c r p 能够激活反义r n a 的转录，反义r n a 则专一性地抑制c r p m r n a 的转录，降低c r p 的合成。 3 ) 在翻译水平上的调控 反义r n a 可通过互补序列与特定的m r n a 相结合，结合位置包括m r n a 结合核糖 体的序列( s d 序列) 和起始密码子a u g ，从而抑制m r n a 的翻译。虽然目前在真核生 物中没有发现天然的反义r n a ，但通过人工合成及其它的方法得到的反义r n a 的技 术在动植物基因工程中得到了较广泛的应用。所谓植物反义基因技术，是将特定基因 的d n a 片段反向连结在一启动子上，然后转化植物，使之形成转基因植物。这种转 基因植物能够产生与该基因的m 】r n a 互补的r n a 链一反义r n a ，其结果使植物中相应 的m r n a 水平大大降低，使该基因的作用受到部分抑制或完全抑制。反义基因技术的 应用，为研究基因的表达及其功能调控提供了有效的方法，同时也开辟了一种快速有 效、专一性极强的育种新途径。 1 3 2 反义r n a 技术的应用 1 3 2 1 抑制果实成熟 植物生理学研究证实，在番茄、苹果、香蕉等果实成熟的启动伴随着呼吸和乙烯 合成的增加，现已知乙烯是通过改变基因表达来调控果实的成熟。乙烯合成途径中的 两个关键酶a c c 合成酶( 卜氨基环丙酸卜梭基合成酶) 与a c c 氧化酶( 乙烯形成酶， e f 勘是合成乙烯的限速酶。通过对这两个酶进行调控来限制乙烯的合成，从而达到控 制果实成熟的目的。h a m i l t on 【4 5 1 等将a c c 氧化酶的反义r n a 基因导入番茄植株，结果 转基因植株的成熟果实与对照相比，9 7 左右的乙烯产生受到控制，这些果实颜色开 始变红的时间与对照相同。然而，成熟果实的颜色较浅，它们在室温下的储存时间明 显比对照长。随后t e l l e r t 4 6 1 等利用a c c 合成酶的反义r n a 抑制乙烯产生，转基因植 株的番茄果实乙烯受到严重抑制，达至1 j 9 9 5 ，果实不能成熟。目前，这一研究已经 广泛应用于梨、香蕉、苹果等。 1 3 2 2 控制油料植物种子中脂肪酸的合成 利用反义r n a 来抑制内源酶基因的表达，降低了内源酶的活性，从而可以达到控 制脂肪酸生物合成的目的，有可能适合于不同用途的不同品质的植物油。k n u t z o n 【4 7 j 等将反义的硬脂破a c p 脱饱和酶基因导入油菜，使该酶活性在种子中大大降低，转 基因油菜种子中的硬脂酸含量由2 提高到4 0 。陈锦清提出“底物竞争”假说，认 为籽粒的主要贮藏物质油脂、蛋白质均来自葡萄糖酵解的产物一丙酮酸，两者之间存 在着底物竞争。利用反义基因技术，将反义丙酮酸羧化酶( p e p 基因) 导入油菜，转基 因植株含油量比对照明显提高，最高的几株都增加了1 5 以上，并且验证蛋白质含量 与油脂含量呈显著负相关。 1 3 2 3 控制植物淀粉的合成 淀粉由直链淀粉和支链淀粉组成，工业上要求淀粉中的直链淀粉的量要少或无。 v i s s e r f 4 8 】等首先在马铃薯上成功地应用内源g b s s 基因的反义r n a 抑$ , j t o b s s 基因 的表达，降低了g b s s 活性的7 0 1 0 ，在淀粉的合成总量基本上保持不变的情况下， 得到不含直链淀粉的淀粉。 1 3 2 4 观赏植物基因工程中的应用 反义r n a 技术已经成功地运用于花色、花衰老的基因工程中。控制花瓣颜色的色 素通常是苯丙烷途径合成的类黄酮，在其代谢途径中苯基苯乙烯酮合成酶( c h s ) 是生 物合成的关键酶。用c h s 的c d n a 芹 i c a m v 3 5 s 的启动子构建反义表达载体，导入烟草 和碧冬茄后，花中c r s 的m r n a 和c h s 酶本身水平都下降。表型上碧冬茄从紫到臼， 而烟草从粉红到白花色变化。s a v i n 4 9 1 等将反义a c c 氧化酶基因转入香石竹，发现反 义基因抑制了乙烯的合成，明显地延缓了花瓣衰老，而且转基因植株花卉衰老比对照 延长了8 天。由此可见，反义r n a 技术在修饰花色和延长花卉的寿命中具有广泛的应 用前景。 1 3 2 s 植物抗病性研究 植物病毒分为r n a 病毒和d n a 病毒，其中r n a 病毒占9 8 ，在细胞质中复制； 而d n a 病毒只占2 左右，在细胞核中复制。早期对抗病毒研究是选择编码病毒外壳 蛋白的基因( c p ) ，但转基因植株抗病毒效果不是很明显。原因可能是c p 基因在病毒侵 染的后期大量表达，使反义k n a 不足以完全抑制c p 基因的表达。后来，n e l s o n t 5 0 j 等 以1 m v5 端的基因片段作为目的基因构建了反义基因并获得了转基因烟草，结果是 病毒r n a 被抑制了2 5 5 0 倍。d a y 5 1 】等首次报道了反义r n a 抑制d n a 病毒的实验结果， 发现表达番茄金黄色花叶病毒( t g m v ) 的a u 基因的反义基因，转基因植株有效的抑制 t g m v 的复制。 1 3 ，2 6 在植物雄性不育中的研究 应用反义r n a 技术来获得雄性不育的转基因植株，或恢复植株的育性的工作也取 得了一些进展。许多基因与花粉的发育相关，通过反义r n a 技术阻断与花粉发育相关 基因的表达，从而获得雄性不育植株。类黄酮在花粉发育中起重要作用，而苯基乙烯 酮合成酶( c h s ) 是类黄酮合成中的一个关键酶。v a n d e r m e e t l 5 2 l 等构建c h s 基因的反义 r n a 表达载体，导入矮牵牛，结果阻碍了花粉的正常发育，得到雄性不育的植株。 s e h m u l l i n g 5 3 】等将雄性不育基因r d l e 的反义r n a 导入烟草，得到的转基因烟草再与雄 性不育的烟草植株杂交，结果得到了恢复育性的后代。因此，利用反义r n a 技术来抑 制雄性不育基因的表达，建立工程不育系的恢复系，杂交育种等方面都有很好的发展 前景。 二、引言 茶树是我国重要的经济作物之一。茶叶中存在多种嘌呤碱，但它们的含量有很大 差别，其中咖啡碱是其主体成份，约占干物质量的2 0 , - - 5 ，速溶茶中约占8 - - 1 0 ， 其它嘌呤碱均属微量存在。饮茶之所以有兴奋、利尿、强心、抗癌、防癌等作用，主 要与茶叶中咖啡碱有关，但是摄入过量的咖啡碱会对人体产生短期的负面作用，如会 引起胃肠痛、焦虑、烦躁、失眠等。所以，随着生活水平不断提高，人们对茶叶品质 要求越来越严格，希望有脱( 低) 咖啡碱的茶叶和茶饮料的产品。 目前，主要通过常规育种的方法选育低咖啡碱茶树品种，或在茶叶加工过程中， 用超临界萃取法去除咖啡碱。但是，通过常规育种的方法选育低咖啡碱茶树品种，至 少需要2 0 年左右，而且选育出的茶树品种不一定能适制不同的茶叶和茶饮料；通过 加工过程中用超临界萃取法去除咖啡碱，不仅加工成本大大增加，而且严重影响到茶 叶品质，尤其是茶叶香气，甚至还有可能将一些有害物质带入到茶叶中去。因此，以 上这些方法都不能从根本上解决脱咖啡碱问题，迫切需要利用植物基因工程技术，开 拓茶树遗传育种的新途径，做到有预见、有针对性地重组茶树基因，从而培育出低咖 啡碱( 脱咖啡碱) 的优良茶树品种。 植物基因工程是在分子水平上定向重组d n a ，并导入植物细胞改造其遗传特性， 从而使作物的性状得到改良。植物细胞的全能性为植物细胞的组织培养奠定了基础， 进而为基因工程提供了前提条件。自1 9 8 3 年首次获得转基因烟草以来，迄今通过基 因工程技术可以把不同来源( 包括植物、动物和微生物) 的基因导入植物细胞，并整 合进植物基因组中，获得转基因植株。由于植物基因工程技术不仅受物种之间的生理 障碍的限制，而且克服了传统育种方法存在的培育新品种需要时间长，过程繁琐，需 要耗费大量的人力和物力的局限性，因此基因工程技术已成为改良植物性状，培育优 良高产作物新品种的分子育种技术，其目的性状有品质的改良、抗虫、抗逆、抗病等。 1 、研究意义 茶叶含有咖啡碱，由于掇入过量的咖啡碱对人体有许多不良的作用，为了适应国 内及国际市场需求，希望有低咖啡碱含量的茶叶饮料和茶叶。通过常规育种的方法选 育低咖啡碱茶树品种，但是需要几十年时间，且消耗财力、物力大；在茶叶加工过程 中可以应用物理、生物化学、生物等技术脱除咖啡碱，然而用这些方法，产品的安全 性差、脱咖啡碱效果不好、成本高等不良之处。咖啡碱合成酶是茶树咖啡碱生物合成 途径中的关键酶，应用反义r n a 技术可以高度特异性地抑制咖啡碱合成酶基因的表 达，从而调控次生代谢途径，阻碍咖啡碱台成酶的生物合成，因此有希望在短时间内 培育出低咖啡碱茶树品种。 本研究旨在以茶树成熟胚作为外植体经过培养，目的是寻找合适的茶树再生体 系，为茶树转基因技术研究奠定基础；应用农杆菌转化方法，通过改良的叶盘法转化 萌动的成熟胚，将含有反义t c s 基因的工程菌，导入龙井4 3 8 、槠叶种、农抗早优良 品种茶树成熟胚，经过抗生素筛选获得再生植株利用r t - p c r 法检测反义咖啡碱合 成酶基因是否表达，从而使内源咖啡碱合成酶基因的表达在转录水平受到抑制，这为 以后茶树转基因技术提供理论依据。 2 、本研究的技术路线 2 1 成熟胚的培养 胚 i 、l ，胚培养 愈伤诱勋护导萌发 愈伤苗 芽根诱导 移栽 2 2 农杆菌法转化成熟胚 预培养的成熟胚农杆菌 共培养 l 采用g u s 基因表达化学染色法检测确定最佳共培养参数 l 脱菌培养 i 成熟胚的筛选与再生 l 抗性植株阶p c r 检测 i 移栽 三、成熟胚的培养 3 1 材料 3 1 1 植物材料 外植体材料采自安徽农业大学茶树品种园农抗早、龙井4 3 “和槠叶种( 由祁 门茶科所提供) 。 3 1 2 培养基 配制m s 培养基所需的各种试剂均为国产分析纯，配备成以下七种贮备液。 贮备液1 ( 2 0 ) ：k n 0 3 ，n h 4 n 0 3 ，k h 2 p 0 4 ；贮备液2 ( 2 0 ) ：c a c l 2 - 2 1 - 1 2 0 ；贮 备液3 ( 2 0 x ) ：m g s 0 4 7 i - 1 2 0 贮备液4 ( 2 0 0 x ) ：m n s 0 4 4 h 2 0 ，z n s 0 4 。7 h 2 0 ， h 3 8 0 3 ，n a m 0 0 4 2 h 2 0 ，c o c l 2 6 i - 1 2 0 ，c u s 0 4 5 h 2 0 ；贮备液5 ( 2 0 0 ) ：f e s 0 4 - 7 h 2 0 ， e d t a - n a 2 ；贮备液6 ( 2 0 ) ：k i ；贮备液7 ( 2 0 0 x ) ：肌醇，烟酸，甘氨酸，甲 硫氨酸，盐酸吡哆素。以上各种贮备液贮存于4 。c 冰箱中备用。 各种激素：萘乙酸( n a a ) 和2 , 4 一二氯苯氧乙酸( 2 ，4 d ) 为国产分析纯， 6 苄基嘌呤( 6 b a ) 和激动素( k t ) 购自s i g m a 公司。n a a 和2 , 4 - d 用o 1 的n a o h 溶解，6 - b a 和k t 用o 1 的h c l 溶解，均配制成5m g m l 的贮备液， 分装为2 0 0m 的小份，贮存于2 0 。c 冰箱中备用。 不同培养基按照实验要求不同添加不同激素，m s 中a n * 3 蔗糖和o 7 5 琼 脂粉，p h 值为5 8 ，高压灭菌2 0r a i n 。 1 ) 愈伤组织再生体系 ( 1 ) 诱导愈伤组织的培养基 a i ：m s + 0 2 m g l 2 , 4 一da s ：m s + o 5 m g l 2 , 4 一da 3 ：m s + 1 m g l 2 , 4 d a 4 ：m s + 1 5m g l 2 , 4 一da s ：m s + 2m g l 2 , 4 一d a 6 ：m s 十2 呲2 , 4 一d + o 5 m g l k ta t ：m s + 2 m g l 2 , 4 一d + 1 0 m g l k t ( 2 ) 诱导芽分化的培养基 b l ：m s + 0 5m g 几6 - b ab 2 ：m s + 2 5m g l 6 - b a b 3 ：m s + 6 m g l6 - b ab 4 ：m s + 2 5 m g l6 - b a + o 2 m g 几n a a b s ：m s + 2 5 m g ，l 6 - b a + 0 5 m g ，l n a a b 6 ：m s + 2 5m g l 6 - b a + 1m g l n a a ( 3 ) 诱导根的培养基 将分化得到的幼苗，切割转入附加0 5 2 0m g l n a a 及2 蔗糖的1 2m s 培养基中诱导发根。 2 ) 成熟胚萌发体系 ( 1 ) 诱导成熟胚萌发的培养基 c 1 ：m sc 2 ：m s 斗1m g l 6 - b a + 0 5 m g l n a a c 3 ：m s + 2 m e e t , 6 - b a + 0 5 m g , l n a a ( 2 ) 增殖试管苗的培养基 d i ：m s + 1m g l6 - b a + 0 2 m g l i a a d 2 ：m s + 1m g l 6 - b a + o 5 m