（物理化学专业论文）反胶束体系中脂肪酶催化拆分外消旋薄荷醇.pdf

摘要 “手性”是自然界普遍存在的一种分子不对称现象。由于同一手 性分子的不同异构体在生物体内常常会表现出截然不同的生理活性和 毒性，因此手性问题在生命科学领域中显得尤为重要。这就要求人们 在合成手性的医药、农药和食品添加剂时，产品必须是光学纯的单一 对映体，而不是外消旋的混合物。目前，全球手性药物的销售额已超 过1 4 7 0 亿美元，而每年仍在以1 0 以上的速度高度增长。三位从事手 性合成的科学家荣获2 0 0 1 年度的诺贝尔化学奖，充分表明了手性科学 研究的重要意义。生物催化的手性合成因无需昂贵的手性试剂、不受 资源限制、反应条件温和、立体专一性强和兑换环境友好等优点，故 以迅速发展成为现代有机化学的一种常规方法，显示出十分广阔的应 用前景。 d l 一薄荷醇是外消旋手性化合物，其中由于l 一薄荷醇具有镇静、提 神的作用而成为一种很重要的芳香化合物，被大量的应用于化妆品、 牙膏、口香糖、香烟、糖果以及内服药当中。l 一薄荷醇还具有沪薄荷 醇所没有的独特的薄荷所没有的独特的薄荷香味。从工业角度而言， l 一薄荷醇及其酯要比d l 一薄荷醇及其酯有更重要的应用价值。并且手性 薄荷醇酯作为手性诱导体己经在不对称合成中得到了应用。因此对外 消旋薄荷醇( d l - 薄荷醇) 进行拆分有很重要的意义。 本文选用脂肪酶l i p a s e f r o mc a n d i d a c y l i n d r a c e a ( c c l ) 作为生物 催化剂，选择了两种具有代表性的表面活性剂a o t 和c t a b ，以其 构建反胶束体系，并对影响反胶束中酶催化反应的诸因素：反应温 度、缓冲溶液的p h 值、系统含水量等对该反应的影响进行了系统的 研究，优化出最佳反应条件，并对在最佳反应条件下有机相及a o t 正己烷反胶束体系中该催化反应的时间进程曲线、e e 。( 产物对映体 过量值) 及e ( 立体选择比率) 进行了比较。开始时a o t 正己烷 反胶束体系中酶催化反应转化率低由于有机相，反应进行3 天以后 a o t 正己烷反胶束体系中转化率开始慢慢超过有机相中的转化率。 有机相中的转化率7 天左右趋于平缓，这时转化率可达1 5 7 ：a o t 正己烷反胶束体系中转化率在1 7 天左右才趋于平缓，此时转化率可 达3 3 。反胶束体系就所选定的脂肪酶催化反应而言要优于有机相， 在所研究的影响各体系酶催化反应因素的适宜范围内，a o t 正己烷 反胶束体系中该酶催化反应的转化率要高于有机相。 关键词：脂肪酶，表面活性剂，反胶束，立体选择性，拆分， 酯化反应 a b s t r a c t t h e r ei sa ni n c r e a s e dd e m a n df o r o p t i c a l l yp u r ee n a n t i o m e r s a s b u i l d i n gb l o c k sf o rp h a r m a c e u t i c a la n da g r o c h e m i c a l s 1 】d u r i n gt h el a s t d e c a d et h e r eh a sb e e na ni n c r e a s e di n t e r e s t i n u s i n ge n z y m e s f o r a s y m m e t r i cs y n t h e s i sa n dk i n e t i cr e s o l u t i o nt o o b t a i np u r ee n a n t i o m e r s t h ee n z y m a t i cr e s o l u t i o no fe n a n t i o m e r sh a sb e c o m eac o m m o nt o o li n o r g a n i c c h e m i s t r y t oo b t a i n e n a n t i o m e r i c a l l yp u r ec o m p o u n d s t h e c o n v e n t i o n a lm e t h o df o re n z y m ec a t a l y s i si st h er e a c t i o ni na na q u e o u s b u f f e rs o l u t i o n d a et os o m eo ft h es u b s t r a t e si si n s o l u b l ei no r g a n i c s o l v e n tt h er e q u i r e m e n t sf o rb i o c o n v e r s i o n so f h y d r o p h o b i cs u b s t r a t e sa r e f u l f i l l e db y u s i n gm i c r o e m u s i o n s a sr e a c t i o nm e d i a l m e n t h o la n di t se s t e r sa r em o r ei m p o r t a n tf r o mi n d u s t r i a lp o i n to f v i e wt h a td l m e n t h 0 1 l 。m e n t h o lb e c a u s eo fi t sc o o l i n ga n dr e f r e s h i n g e f f e c t si sa n i m p o r t a n tf r a g r a n c ea n df l a v o u rc o m p o u n d t h a ti su s e dl a r g e l y i n c o s m e t i c s , t o o t h p a s t e ，c h e w i n gg a i n s ，c i g a r e t t e s ，s w e e t s a n d m e d i c i n e s 1 1 1 ee s t e r so fl m e n t h o lc a r lb ee x p e c t e dt oh a v ei n t e r e s t i n g c h a r a c t e r i s t i cs u c ha sf r a g r a n c e w h i c hi se m i t t e da st h ee s t e rb o n di s h y d r o l y z e d t h ec h i r a lm e n t h o le s t e r sh a v eb e e nu s e di nt h ea s y m m e t r i c s y n t h e s i s i nt h i sw o r k ，w es t u d i e dt h ep a r a m e t e r si n f l u e n c i n gt h ec o n v e r s i o no f t h i sr e a c t i o ns u c ha sp h o f b u f f e r , w a t e rc o n t e n ta n dt e m p e r a t u r ei no r g a n i c m e d i a a o t m e x a n er e v e r s em i c e l l e ss y s t e m sa n dc t a b h e x a n er e v e r s e m i c e l l e ss v s t e m s t h e nw eo b m i n e dt h eo p t i m u mc o n d i t i o nf o re a c h s y s t e m sa n dc o m p a r e t h es t a b i l i t yo fc c li no r g a n i cm e d i aa n dr e v e r s e m i c e l l e ss y s t e m su n d e rt h e i ro p t i m u mc o n d i t i o n w es t u d i e dt h ec o i l r s eo f t h ec o n v e r s i o n ，e e pa n dew h e nt i m eg o e su n d e rt h e i ro p t i m u n lc o n d i t i o n r e s p e c t i v e l y w jf o u n dt h a t a tt h ef i r s t3 d a y st h ec o n v e r s i o no fa o t e m u l s i o n sw a ss m a l l e rt h a nt h a to ft h es o l v e n t b n ta f t e r3d a v st h e c o n v e r s i o no fa o te m u l s i o n se x c e e d e dt h a to ft h es o l v e n ts l o w l y t h e c o n v e r s i o no ft h es o l v e n ts t o p p e dw h e ni t g o e sf o ra b o u t7d a y sa n dt h e 1 a s tc o n v e r s i o ni s1 5 7 t h ec o n v e r s i o no f a o te m u l s i o n ss t o p p e dw h e n i t g o e sf o ra b o u t17d a y sa n dt h el a s tc o n v e r s i o ni s 3 3 t h er e s u l th a s i i i p r o v e dt h a ts t a b i l i t yo ft h ec c l w a sh i g hi ne m u l s i o n st h a ni ns o l v e n t t h i si n d i c a t e st h a tt h el i p a s es h o w e dh i g h e rs t a b i l i t yi nr e v e r s em i c e l l e s t h a ni no r g a n i cs o l v e n t k e y w o r d s ：l i p a s e ，s u r f a c t a n t ， e n a n t i o s e l e c t i v i t y , r e v e r s e d m i c e l l e ，r e s o l u t i o n ， e s t e r i f i c a t i o n 独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表的研究成果，也不包含他人为获得东北师 范大学或其他教学机构的学位或证书而取得的研究成果。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表 示谢意。 日期： 0 舻寸旧 关于论文使用授权的说明 本人了解并遵守东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权保留、向国家有关部门送交学位论文的复印件，允许论 文被查阅和借阅：学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影 印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 作者签名：虽箧! ! 璺指导教师签名：褴丝 日期 东北师范大学颂十学位论文 第一章引言 “手性”是自然界普遍存在的一种分子不对称现象。由于同一手 性分子的不同异构体在生物体内常常会表现出截然不同的生理活性和 毒性，因此手性问题在生命科学领域中显得尤为重要。这就要求人们 在合成手性的医药、农药和食品添：i i i i 时，产品必须是光学纯的单一 对映体，而不是外消旋的混合物。目前，全球手性药物的销售额已超 过1 4 7 0 亿美元，而每年仍在以1 0 以上的速度高度增长。三位从事手 性合成的科学家荣获2 0 0 1 年度的诺贝尔化学奖，充分表明了手性科学 研究的重要意义【l 】。合成化学发展中的立体化学问题到本世纪五十年 代后遇到了一些棘手的问题。w o o d w a r d 当时甚至认为e r y t h r o m y c i n ( 红霉素) 等化合物是不可能进行人工合成的。在这之后的二十年里， 人们利用在合成反应中引入来源于自然界的手性辅助基团等方法来解 决以上问题，虽然取得了一些成效，但由于经济上的原因，其应用受 到极大的限制。人们迫切地寻求一种经济而高效的新的合成方法来达 到上述目的。 酶作为生物催化剂，在生物体内新陈代谢的过程中起着重要作用。 虽然酶所催化的生物体内的化学反应极为复杂，但与普通的化学催化 剂相比，酶具有高度的选择性，反应条件的温和性以及极高的催化效 率等优点。由于自然界中生命的多样性，酶也具有多样性。迄今为止， 研究者们已发现了大约2 0 0 0 种以上的酶【2 1 。研究表明，酶能够催化绝 大多数的化学反应类型。因此，化学家们寄期望于利用酶的高效性和 专一性等优势开发出一种新的合成化学技术。生物催化的手性合成因 无需昂贵的手性试剂、不受资源限制、反应条件温和、立体专一性强 和对环境友好等优点，故以迅速发展成为现代有机化学的一种常规方 法，显示出十分广阔的应用前剽o 。 直到二十世纪八十年代初期由k li b a n o v 等人【5 。州率先将酶引入 到非水介质中催化反应，开辟了非水酶学( n o n a q u e o u se n z y m o l o g y ) 这一崭新的研究领域，极大地拓宽了酶的应用范围，为酶学研究注入 东北师范大学硕士学位论文 了强大的生机和活力。此后有机溶剂中酶催化的研究队伍迅速发展。 迄今为止，发现能在有机溶剂中催化的酶类已有十几种，能够催化的 反应类型包括氧化、还原、酯合成和酯交换、脱氧、酰氨化、甲基化、 羟基化、磷酸化、脱氨、异构化、环氧化、开环聚合、侧链切除、缩 合以及卤代等等【1 1 。”j 。目前，利用商品酶拆分的手性化合物包括：d 卜 薄荷醇m1 8 】、2 - 辛醇、萘氧氯丙醇、环氧丙醇、萘普生和酮基布洛 芬 2 0 - 2 3 】等等；用于不对称合成的有：( s ) 一3 - 羟基丁酸乙酯、( s ) 一1 一 苯乙醇【2 4 】和( r ) 一一苯甲酰甘油酯i ”j 。 生物转化属于化学和生物学的交叉领域，生物催化剂和反应介质 是生物转化的两大要素。一方面，生物催化剂工程 ( b i o e a t a l y t i c e n g i n e e r i n g ) 运用发酵技术获得大量催化剂，利用生物学、 化学或物理学方法对现有生物催化剂进行改造。另一方面，介质工程 ( m e d i u m e n g i n e e r i n g ) 贝, l j 为生物催化过程提供理想的溶剂体系。生物催化 剂工程和介质工程研究的根本目的是保持或提高生物催化剂的活性和 稳定性。介质工程的研究经历了从水一有机溶剂一反胶束 ( r e v e r s e m i c e l l e s ) 的过程。在水有机溶剂两相体系和微水有机溶剂单相 体系中，仅有少数酶能够保持催化活性。由于反胶束体系能够较好地 模拟酶的天然环境，因而在反胶束体系中，大多数酶能够保持催化活 性和稳定性，甚至表现出“超活性”( s u p e r a c t i v i t y ) 。自1 9 7 4 年w e l l s 发现磷酸酯酶a 2 在卵磷脂乙醚水反胶束体系中具有卵磷脂水解活性 以来，国外有二十多个实验室对5 0 多种酶在反胶束中的酶学性质进行 了广泛而深入的研究，由此促进了一个新的研究领域一胶束酶学 ( m i c e l l a r e n z y m o l o g y ) 的兴起。分散在有机相中的含酶水滴作为微型反 应器( m i e r o r e a e t o r ) 的概念已普遍为人们所接受。胶束酶学研究的权威 m a r t i n e k 预言：反胶束体系有可能成为生物转化的通用介质1 2 6 】。 东北师范大学硕士学位论文 1 1 手性拆分的意义 光学活性化合物是指那些具有 旋光性质的化合物，它们的化学组 成相同，但是立体结构不同而成为 恰如人的左右手一样的对映体( 如 图1 ) ，因此也被称为手性化合物。 手性化合物之所以引起人们广泛的 兴趣主要原因是由于医药工业对光 学纯有机化合物的需求日益增大 【2 7 1 。一对对映异构体除旋光性外，在非手性环境中其他的物理化学性 质完全相同，但是它们在手性环境下的表现是不同的。大多数情况下， 使用外消旋体，会使无效成分在生物体内或环境中积累，造成危害和 污染。从经济上来说，使用消旋混合物中的无效成分也是一种浪费。 比如在医药方面，不同手性药物对映体药理活性有很大差异。主要原 因是：生命机体本身就是由具有高度不对称性的生物大分子组成。这 种不对称性赋予生物大分子受体、酶、姐浆蛋白及组织蛋白，通过一 定的信息去识别不同的对映性，与之契合者，才能发生相互作用，从 而产生生理活性。如一对对映异构体与蛋白质结合时的情况是不一样 的( 图2 图2 一对对映异构体与蛋白质结合时的情况 目前化学合成的药物绝大多数都是两种或多种旋光异构体组成的 混合物( 也称之外消旋药物) ，没有旋光性，一般来讲幽1 ，外消旋药物 的各种异构体的生物活性、药理和毒副作用有很大的差异。如治疗心 律失调的普奈洛尔( 心得安) ，其s 一异构体药效是r 一异构体的1 0 0 倍， 而且r 一异构体还有降低性功能的副作用。可见光学活性药物是只含一 东北师范大学硕。 学位论文 种旋光异构体的药物，也叫单一手性药物，其疗效高、毒副作用低、 使用安全。对映选择性的生物作用现象并不局限于药物，在农药方面 也同样存在。除虫菊脂具有对害虫杀灭快而对人类和哺乳类动物低毒 的特点，研究发现【2 9 】除虫菊脂的l 一( + ) 异构体比d 一( ) 异构体的杀虫 能力大1 0 0 倍以上。如( s ) 一膦基麦黄酮( p h o s p h i n o t r i c i n ) ( 式1 ) 00 斋釜 1 r = o h p h o s p h i n o t r i c i n r 2 r = a l a - a l a o h b i a l a p h o s n h 2 式l 外消旋的膦基麦黄酮通常又叫做g l u f o s i n a t ea m m o n i u m ，它是一 种广谱非选择性除草剂。其除草作用主要与它的s 构型异构体有关。 作为香料香精的化合物，不同的旋光体，香味的差别是很大的。薄荷 醇有三个手性碳【3 l j ，具有特征香味和局部麻醉作用，在各种异构体中 以l 一( + ) 异构体的香味和麻醉最强。萜类香料香精的香味与手性碳的 旋光性有关。如铃兰香精以d 一( 一) 异构体的香味最浓。手性分子的 重要性不仅表现在以上与生物相关的领域，而且在功能材料领域，如 液晶、非线性光电材料、波导材料、导电高分子等方面也开始显示出 诱人的前景。随着人们对手性分子的认识的不断深入，人们对单一手 性物质的需求量越来越大，对其纯度的要求也越来越高。广阔的应用 前景和巨大的市场发展推动了探索新的更有效地获得单一手性化合物 方法的研究。 1 2 单一手性化合物的制备方法 1 8 4 8 年，l o u i sp a s t e u r 【3 2 】用放大镜和镊子成功地分离了酒石酸 钠铵盐的外消旋体，他的先驱性工作标志着手性分离的开始。目前获 得单一手性化合物的方法，不外乎非生物法和生物法两种【3 引。 h 嚏 ，r 鼍 掣 h 。尹寸o h llh o 。尹守h h 0 2 cc 0 2 h ii c 0 2 cc 0 2 h li 一酒石酸yd - 酒石酸 1 2 1 非生物法 ( 1 ) 不对称合成法制备单一手性化合物 手性合成已经历过相当长的历史，最初的化学计量型不对称合成 除应用廉价天然手性源外，均难以工业应用。 6 0 年代后期【3 4 l 出现的手性配体过渡金属络合物催化的不对称合 成，经过2 0 多年研究己发展成最经济有效地合成手性物质的一种方 法。1 9 7 3 年m o n s a n t o 3 3 1 公司用不对称催化生产l 一多巴胺( 用于治疗帕 金森综合症的特效药) ，丌创了手性催化工业应用的新纪元。至今已有 多家公司应用不对称催化氢化、环氧化、环丙烷化等反应生产光学纯 医药、农药、香料等。 ( 2 ) 手性源合成 以价廉易得的天然手性物为原料，经构型保留、构型转化或手性 转换等反应，可以方便地合成新的手性化合物【3 5 】。但是由于天然手性 物质的种类有限，要合成多种多样的目的产物会遇到很大的困难，而 且步骤繁多的合成路线也使得最终产物。 ( 3 ) 结晶法拆分 若外消旋体所形成的晶体是外消旋混合物，则可直接在其过饱和 溶液中加入某一对跌体晶种进行诱晶得到该对映体。这种直接结晶法 拆分较方便、经济，但其应用范围有限，因为整个外消旋体中以混合 物存在的仅占1 0 。 ( 4 ) 化学法拆分 基本原理如下：将外消旋体转化为非对映体，由于非对映体的物 理性质不相同。因此可以将它们分开，最后再把分离得到的两种衍生 物分别变为原来的旋光化合物，即可达到拆分的目的。在应用化学法 进行拆分时，必须先使其与手性酸、碱等拆分试剂作用生成非对映异 东北师范大学硕上学位论文 构体，然后再用结晶、蒸馏、色谱等方法进行分离 3 6 l 。 ( 5 ) 动力学拆分 在手性试剂或催化剂作用下，利用两个对映体反应速度不同而使 其分离。催化动力学拆分经济上更有利，在环氧化、氢化反应中已有 成功的例子。 ( 6 ) 色谱分离 手性色谱可方便、准确、迅速地检测出样品的光学纯度和绝对构 型。手性制备色谱也己成为分离、纯化少量旋光物质的最有效方法之 一。其中手性固定相液相色谱最有前途。利用模拟移动床色谱己可进 行吨级规模的拆分【3 7 】。 1 2 2 生物法 ( 1 ) 天然产物的提取 从生物体内分离提取手性化合物是最直接、最原始的获得手性物 的方法。由于受生物资源和手性物含量的限制，此法难以满足人类对 某些有价值的手性物日益增长的需要。 ( 2 ) 应用催化抗体制备手性化合物 在模拟生物体免疫功能的过程中，设计合成具有特定结构、电子 和立体因素过渡态类似的化合物作半抗原，经细胞诱导产生单克隆抗 体，可用于催化反应。 ( 3 ) 微生物法制各手性化合物1 3 3 】 近年来，直接以微生物细胞为催化剂获得手性化合物的研究取得 了很大进展。利用微生物中的氧化还原酶制备手性合成子的反应屡见 不鲜。例如面包酵母可将羰基立体选择性地还原成羟基，早已为人熟 知。 ( 4 ) 酶法制备手性化合物 光学活性化合物的制备一直是有机合成的难题，至今尚未走出困 境。酶作为生物催化剂，可以用于光学活性化合物的合成和拆分。由 于它具有高对映体选择性，副反应少，所以产物光学纯度和收率高。 此外酶催化反应条件温和、无环境污染。酶催化光学活性化合物的合 成是将有潜手性的化合物和前体通过酶催化反应转化为单一对映体的 东北师范大学硕士学位论文 光学活性化合物，如氧化还原酶、裂解酶、羟化酶、水解酶、合成酶 和环氧化酶等，它们可以催化前体化合物不对称合成得到具有光学活 性的醇、酸、酯、酮、胺衍生物。也可以合成含磷、硫、氮及金属的 光学活性化合物。酶还可以催化外消旋化合物的拆分反应，如脂肪酶、 蛋白酶、腈水合酶、酰胺酶、酰化酶等能够催化外消旋化合物的不对 称水解或其逆反应，以拆分制备光学活性化合物。 英国i c i 的c r o s b y 曾对酶催化和不对称合成法的优点进行了比较 和总结【3 8 】，其优点如下： 专一性。酶可以接受底物的某些改变，而不对称反应的催化剂 对底物有特别要求； 动力学方面。各种酶催化的动力学很相近，可用合理控制酶的 活性来优化反应过程； 反应条件相似，使得串行的反应可在相同反应器中进行而不必 分离出中间产物； 可通过蛋白质工程的应用来调节催化性质，催化剂( 酶) 的浓 度可利用克隆技术来增大； 安全性。可不必使用昂贵而难以掌握的试剂( 如高毒性金属催 化剂和会引火燃烧的试剂) ； 酶催化剂的发现靠经验，成功的机会较大，因为可从大量有机 质中挑选，并可能进行改性变异； 条件温和。容许产物分离，工程费用较低； 对于大多已知的有机反应都可用生物催化剂。 以上各种拆分方法各有优缺点，究竟选择哪一种方法更好，还应 该具体问题具体分析。如果能够找到适宜的酶或菌种，而产物的需求 量不是很大，酶催化拆分方法则具有较大的优势。如果难以找到适宜 的菌种或酶，或者菌种或酶很贵，而产物需求量很大，则应该采用不 对称合成法。 东北师范大学硕士学位论文 1 3 酶催化拆分单一手性化合物 目前，复杂手性化合物的开发，通常采取的方法是选择化学合成 路线中某一个手性中间体进行不对称合成或拆分，再进一步合成该单 一手性化合物。由于酶法拆分副反应少，产物容易分离纯化，降低了 环境污染；反应条件温和，常温常压下就可以进行，降低能源消耗； 另外酶具有高度立体选择性，制备的单一手性化合物光学纯度高等优 点，因此酶法拆分在单一手性药物中间体的科学研究和产品开发中已 经越来越受到人们的青睐。 美国麻萨诸塞州技术研究院开发出猪胰脂肪酶催化拆分单一手性 的2 一卤代丙酸( 一种合成苯氧基丙酸酯类除草剂的重要手性前体) 反 应仅用几个小时，就可以获得光学纯度超过9 9 的单一手性产物，其 产率为3 7 5 。利用该技术，c h e m i el i n zc o ( 奥地利) 目前已经进 行大规模生产。另外，世界上已经有多家公司开发出利用脂肪酶拆分 获得高光学纯度2 一芳基丙酸( 可以用来合成除草剂和非甾体抗炎药物 的重要的手性中间体) 的技术，并己实现工业化。b a s f ( l u d w i g s h a f e n ， g e ) 用假单胞菌脂肪酶生产r 型和s 型的胺己达到每年1 0 0 吨的规模 ( 图1 6 ) u 川。g l a x ow e l l c o m e ( s t e v e n a g e ，u k ) 用脂肪酶拆分得到的 ( 1 s ，2 s ) 一反一2 一甲氧基环己醇是一种抗生素的重要手性中间体【4 。 b r i s t o l m y e r sa q u i b b 药物研究机构利用脂肪酶对多种药物的手性 中间体进行了拆分【4 1 。该药物研究机构利用脂肪酶( b u r k h o l d r i a c e p a c i a1 i p a s e ) 对抗癌药物紫杉醇的一个手性中间体进行了拆分，目 前每年可生产数公斤的该单一手性中间体，产品光学纯度超过9 9 5 。 在过去的几年里，脂肪酶己在某些手性药物中间体的合成和拆分 中得到了应用，但脂肪酶的应用潜力还远远没有得到充分的发挥。随 着酶工程、基因工程、蛋白质工程和发酵工程的不断发展，相信在不 久的将来，将有更为廉价的、稳定的、适用于多种底物和高度选择性 的脂肪酶出现，会使脂肪酶在手性药物合成中的应用变得更为广阔， 更为普及。 酶是生物催化剂，是由活细胞产生的具有催化功能的蛋白质，它 具有大多数非生物催化剂所没有的特点：高效、专一、作用条件温和。 东北师范火学硕上学位论史 然而，这些良好性能是生物为维持自身生命活动而产生的，其生物作 用只适于在生物体内催化反应，不适于作为一般催化剂应用于工业领 域。近百年中，酶工业发展缓慢。影响酶应用的最重要障碍是因为酶 绝大多数为蛋白质，在有机介质中容易失活1 4 2 1 。 所谓固定化酶( i m m o b i l i z e de n z y m e ) ，是指把原来游离的水溶性 酶限制或固定于某一局部空间或固定载体上，能连续进行反应的酶。 此方法使酶既能保持其所特有的催化活性，又能通过简单分离便可回 收及重复使用，提高酶的使用效率。目前常见的固定化方法大致可分 为结合法、包埋法、交联法等。其中，由于酶分子能够进入反胶束的 水池中，避免与任何有可能使之变性的有机溶剂直接接触，反胶束法 固定化酶成为酶的固定化的重要方法之一。 1 4 反胶束及其在酶催化手性拆分中的应用 1 4 1 反胶束概述 随着生物工程技术及材料科学的发展，反胶束技术在世界范围内 受到了广泛的关注【4 3 “l 。 反胶束( r e v e r s em i c e l l e ) 体系是表丽活性剂分散于有机介质中 自组装形成的纳米尺寸的油包水胶体分散体系，它为表面活性剂分子 所稳定【4 5 】。反胶束体系中，表面活性剂分子在界面上定向排列，碳氢 链伸向有机相，极性头或电荷头部及抗衡离子则向内排列，形成极性 核，从而将界面张力降到较低值( 1 0 一n m 1 ) 【4 “。水及其它极性溶剂 或亲水性物质的水溶液极易溶解在极性核中，通常称该极性核为“水 池”( w a t e rp 0 0 1 ) n 7 1o 大多数反胶束“水池”的直径在l 1 0 0 n m 之 间，因此，反胶束体系是均一、热力学稳定、光学透明或半透明、各 向同性的热力学稳定体系1 4 8 l 。随体系中各组分量的不同，反胶束微粒 可呈现多种形态。反胶束尺寸及其聚合分散性己经通过光教射、小角 度x 射线衍射( x a n s ) 及小角度中予衍射( s a n s ) 、电子弛豫光谱及傅 立叶红外变换等技术得以研究 4 9 - 5 3 。以散射技术为主的许多研究已经 表明，反胶束具有固定的直径及聚集数并呈现相对规则的结构，一般 为球状、棒状或椭球状【5 ”。反胶束微粒的大小取决于增溶水量的多少 和表面活性剂的浓度，当二者之比一定时，反胶束微粒的大小也保持 东北师范人学硕士学位论义 一定。反胶束体系的性质常用眠、0 与n 来表征。w 。为水与表面活性 剂的摩尔比( 戳) - h 2 0 s u r f a c t a n t ) ，其大小决定反胶柬微粒( “水 池”) 的大小：0 是增溶的水相对于总体积的浓度；n 是组成每个反胶 束微粒的表面活性剂的分子个数，也称聚集数。反胶束的直径主要取 决于w 0 值，w 。值和半径之间具有一定关系。当w o 值一定时，0 与n 决 定了反胶束微粒的相对浓度，即对于给定的w 。值，水和表面活性剂的 量分别增加也将导致体系中反胶束数量的增加 5 5 1 。 表面活性剂在构建反胶束体系中起着举足轻重的作用 5 6 5 8 1 。按亲 水部分的特点不同，表面活性荆可分为阴离子型、阳离子型、非离子 型和两性( z w i t t e r i o n i c ) 表面活性剂【4 。非离子型表面活性剂如聚环 氧乙烷等在水中不会解离成离子状态，而是呈醚键，键中的氧原予具 有与水分子形成氢键的能力，从而稳定性高，不易受强电解质存在的 影响1 5 。其缺点是不能与蛋白质分子形成静电作用，一般只能与其它 表面活性剂复配使用。然而，使用助表面活性剂或混和表面活性剂使 得对反胶束体系物理模型及其中所溶物质的研究变得相当困难1 5 ”。阳 离子型表面活性剂的代表为十六烷基三甲基溴化铵( c t a b ) ，其极性 部分较小，所形成的反胶束体系的w o 值也较小，因而使其应用受到了 限制。同样，两性表面活性荆如卵磷脂等也受到必须加入助表面活性 剂及卵磷脂纯度对于反胶束性质的强烈影响的限制1 6 。阴离子型表面 活性剂，尤其是磺酸酯和磷酸酯型表面活性剂，由于其极性头部极性 较大，所形成的反胶束“水池”也较大，在构建反胶束体系方面应用 广泛 5 7 】。其中，a o t 是目前公认的优良的表面活性剂【6 “。 反胶柬内部“水池”中水的性质与体相水的性质不同，已有几种 光谱学技术( 核磁共振( n m r ) ，电子顺磁共振光谱( e p r ) ，红外光谱、 荧光光谱等) 研究了反胶束中水的性质，区分了反胶束“水池”中的 两种不同的水分布：极性头部分附近的高度固定化的水及具有普通水 性质的自由水中心核。当水的浓度较低时，一般认为它被束缚在胶束 的内壁，即所谓的“结合水”：仅当水浓度较高时，才有“自由水”存 在，而且浓度越高，自由水的性质越接近普通水。研究表明，“水池” 中的水与生物膜附近的水性质十分相似【4 引。反胶束内部独特“水池” l o 东北师范大学硕士学位论文 的存在使得其内部环境接近于细胞内环境，为其应用于生物工程提供 了可能。 由于反胶束体系的独特的性质，反胶束技术主要应用于以下几个 方面： ( 1 ) 提纯与分离生物活性物质。传统的液一液萃耿技术有操作复杂、 选择性差及流程长等缺点，而且会经常导致酶的严重失洱”j 。自1 9 7 9 年l u i s i 6 3 1 首次采用反胶束将蛋白质传入有机相并又将其从有机相传 入水相以后，反胶束法提取蛋白质等生物活性物质受到了极大的关注。 9 0 年代以来，反胶束体系被广泛地用于提纯和分离生物活性物质，如 蛋白质( 包括酶) 、氨基酸、核酸等【5 “6 0 o ( 2 ) 酶的固定化并应用于酶催化领域。反胶束是酶学研究中最常使 用的体系之一。反胶束“水池”的直径一般在1 1 0 0 r t m 之间，能够 增溶不同尺寸的亲水性分子，模拟酶的天然环境【4 6 j 。绝大多数酶在反 胶束中均能保持其催化活性及稳定性，甚至表现出“超活性” 6 4 - 6 6 1 o 自从w e l l s 6 7 1 在1 9 7 4 年首次发现了磷脂酶凡在卵磷脂乙醚水体系 中水解卵磷脂时表现出活性起，国内外已有多个研究小组对5 0 多种酶 在反胶束体系中的酶学性质进行了广泛深入的研究m5 5 “8 1 ，有机相中 含酶水滴作为微反应器的概念已被广为接受。一个崭新的领域一一反 胶束酶学正在兴起。酶学研究的权威m a r t i n e k 曾预言：反胶束体系会 成为生物转化的通用介质【4 8 l 。 ( 3 ) 用于制备纳米材料。纳米材料因具备独特的光电性质而备受关 注，反胶束法制备纳米粒子是当今材料科学的热点之一【6 ”加】。该方法 具有生成的粒子粒径大小可控、粒子分散性好、分布窄、呈单分散等 优点【7 17 2 1 。随着研究人员的深入探讨，反胶束法制备纳米粒子取得了 新的进展，已经制备出各种形态的无机、无机有机复合及高分子等纳 米材料，使反胶束法制备纳米材料成为具有潜力的纳米技术分支 7 3 , 7 4 。 1 4 2 反胶柬法固定化酶 1 4 2 1 概述 1 9 7 7 年，m a r t i n e k 等人【7 5 】首次报道了阴离子型表面活性剂a o t 有机溶剂反胶束体系中过氧化物酶及o 胰凝乳蛋白酶的催化活性得 东北师范大学硕士学位论文 以保留的现象，这是首例关于反胶束酶学的正式研究报道。从此，人 们开始将多种酶引入到反胶束体系中，并观察了这些体系的性质。进 入8 0 年代以后，反胶束酶学研究取得了较大的进展，特别是近几年来， 这方面的研究更为活跃。 反胶束最重要的性质之一是它们能将酶及其它生物分子包覆到其 水池中，水相p h 值、离子强度、酶的种类、反胶柬尺寸及表面活性剂 的性质等因素控制着酶( 或蛋白质) 向反胶束中的增溶【”1 。有关酶溶 于反胶束的机理有几种不同的解释。l u i s i 提出水壳模型【4 5 】( w a t e r - s h e l l m o d e l ) ，认为酶分子的溶解伴随着胶束尺寸的增加，填充胶束( f i l l e d m i c e l l e s ) 比空胶束( u n f i l l e dm i c e l l e s ) 含有更多的水分子和表面活性 剂分子，这是胶束组分在两种胶束之间重新分配的结果；m a r t i n e k 提 出诱导适合模型1 7 “( i n d u c e d f i tm o d e l ) 则认为酶分子尺寸大于未填充 胶束时的水池尺寸时，胶束尺寸增大，酶分子的溶解增加表面活性剂 的水合程度和聚集数。若酶溶解前的胶束中的水池尺寸等于或大于酶 分子的尺寸时，胶束尺寸不发生变化，即所谓固定尺寸模型( f i x e d - s i z e m o d e l ) 。 1 4 2 2 酶在反胶束体系中的构象 在反胶束体系中酶分子受到束缚，运动性较小，除此以外，人们 更关心的是酶分子的二级与三级结构在反胶束体系中的变化以及这些 变化与酶活性之间的关系。因此，需要有直接而有效的手段来研究反 胶束微粒中的酶分子。酶分子在反胶束体系中的构象变化取决于表面 活性剂的种类、增溶水量的多少及酶分子本身的性质等因素。各种光 谱学方法都可用于反胶束体系中酶结构的研究。远紫外区圆二色谱( f a r u v c d ) 的研究结果表明，反胶束体系中许多酶远紫外区的椭圆度值增 加，表明其a 螺旋，1 3 折叠等二级结构增加【2 7 2 8 1 ，但也有的酶保持不 变或减少【2 ”。在近紫外区，谱图有时变化很大，也有时与水溶液中相 近。内源荧光光谱法也是常用的结构研究手段。蛋白质的生色残基色 氨酸和酪氨酸属疏水氨基酸，一般处于相对疏水的蛋白质内核。但有 时比较外露，此时内源荧光发射波长红移。在反胶束体系中有些蛋白 质的荧光光谱发生蓝移1 7 7 , 7 8 ，可能是相对暴露的生色氨基酸增溶于表 东北师范大学颂十学位论文 面活性剂的疏水层所致。增溶水量越小，蓝移越明显。溶菌酶在反胶 束体系中的构象与在水溶液中相比有较大不同，而且在不同的反胶束 体系中，溶菌酶的构象也不尽相同。从圆二色谱的变化可以看出，该 酶表观活性的大小与构象之间存在着一定的联系【7 ”。对于酶在反胶束 体系中的构象，传统的研究方法都存在着一定缺陷，主要的问题是大 部分表面活性剂及有机溶剂在紫外区有吸收，妨碍测定的准确性。近 年来傅旱叶变换红外光谱等【7 9 8 0 实验方法被应用于反胶束酶学研究， 增加了测定的准确性。 1 4 2 3p h 值对反胶束中酶行为的影响 作为一种近似非水体系，p h 值是影响酶在反胶束体系中性质的一 个重要因素。由于酶分子所处微环境的p h 值决定了其所带电荷的种 类，所以p h 值不仅决定了酶在反胶束体系中的溶解能力，而且p h 值 的变化也可能引起酶分子与反胶束膜之间作用的改变。相转移法将酶 增溶于反胶束体系是反胶束在酶学研究中的应用基础。当用阴离子表 面活性剂时，若两相p h 值低于酶蛋白的等电点，酶分子带正电，将受 到由带负电的表面活性剂分子组成的反胶束微粒的静电吸引作用，因 此酶很容易溶于胶束相。若p h 值高于酶蛋白的等电点，则酶分子因带 负电受到静电推斥作用而不能进入胶束相。此时，若采用阳离子表面 活性剂，带负电的酶分子很容易进入带正电的胶束相【8 ”。因此，通过 控制p h 值进而控制酶在反胶束体系中的溶解以达到酶的分离效果，是 反胶束在酶学研究中的重要应用。大多数酶在反胶束体系中的活性随 p h 值变化呈钟罩形”曲线7 9 ，8 2 ，8 3 】，即有一最佳p h 值，此时酶表观 活性最大，这与在水溶液中的情况类似。以往在反胶束的酶学研究中 都将增溶水溶液的p h 值假定为核心水团的p h 值，但新近的研究表明 【8 ，当在弱电解质中时，将会导致反胶束体系p h 值的显著变化。所 以，考虑增溶物的不同，有必要对反胶束体系中p h 值的变化以及随之 引起的酶性质的改变作进一步的研究。但是，反胶束体系中p h 值的测 定是极为困难的，这在很大程度上影响了这方面工作的进展。f u j i 及 w a l d e 等曾先后将酚红、溴甲酚紫等较特殊的p h 指示剂用于反胶束体 系中p h 值的测定，但是r o d k i e w i c z n o w a k 掣8 3 j 的最新研究表明，该 东北师范大学硕上学位论文 类p h 指示剂并不能真实反映反胶束体系中的p h 值。至今为止，诸多 研究方法中得到认可的只有通过增溶缓冲溶液中磷原予的核磁共振的 变化来标定反胶束体系的p h 值【8 ”，但这一方法也有缺陷，它不适用 于和磷酸根离子有作用的阳离子表面活性剂及部分非离子表面活性 剂。 l4 2 4 水对酶在反胶束体系中催化活性的影响 反胶束体系中的核心水团( w a t e r p 0 0 1 ) 不同于溶液水( b u l kw a t e r l ， 包括自由水( f r e ew a t e r ) 和结合水( b o 岫d w a t e r ) 【”】。在w 0 较小时，核一i i , 水团主要是结合水，随w o 增大，自由水逐渐增加，核心水团的微环境 逐渐接近于水溶液。酶分子与表面活性剂分子间的作用取决于酶分子 与反胶束的性质。酶分子可一定程度地附着于反胶束膜上，有时甚至 部分地伸出膜外 8 ”。在胶束中酶分予的构象受到反胶束微粒的限制， 结构运动的自由度相对较小【s ”。酶在反胶束体系中的活性由以下三方 面因素决定：核心水团的大小，表面活性剂的种类与反胶束微粒的浓 度。w o 是影响反胶束体系中酶活性的最重要参数。随着w o 的变化， 各种酶在反胶束体系中的活性变化情况基本可归为以下四种：a 、随 w o 的增大，酶活性逐渐增大，增大到一定值后基本不再变化【8 7 。这类 酶分子一般位于核心水团中央，与表面活性剂分子间基本没有相互作 用。当w o 足够大时，其活性近似于在水溶液中。b 、随w o 的增大， 酶活性降低，该类酶受到表面活性剂的变性作用。当w o 较低时，酶分 子结构活动的自由度小，能维持类似于天然态时的构象，保持一定的 活性。当w o 增大时，自由水分子增加，酶分子结构活动自由度增大， 酶发生变性，活性迅速降低1 8 2 。c 、酶活性与w o 的关系呈现“钟罩 型”曲线，反胶束微粒的大小对酶活性影响较大，核一i i , 水团大小合适 时，酶活