（微生物学专业论文）季也蒙毕赤氏酵母产菊粉酶的研究.pdf

山东人学硕+ 学位论文 季也蒙毕赤氏酵母产菊粉酶的研究 摘要 对本室保存的酵母菌进行筛选，得到一株菊粉酶活较高的菌株s d u 2 9 0 。对 酵母菌s d u 2 9 0 进行了b i o l o g 自动微生物鉴定系统菌种鉴定，并且结合形态 学和生理学特征，参照酵母茵鉴定手册，将菌株s d u 2 9 0 确定为p i c h l a g u i l l i e r m o n d i i ( 季也蒙毕赤氏酵母) 研究了碳源、氦源、p h 、培养温度以及添加不同的金属化合物等因素对产 酶的影响得出优化产酶培养基为：菊粉2 5 ，酵母膏0 8 ，( n h 4 h h p 0 40 2 ， m g s 0 4 7 h 2 05 m m o l l ，p h5 5 。采用优化的培养基，测定了发酵罐( 5 l ) 分批 培养发酵进程，结果表明产酶高峰在6 0 小时，发酵液酶活最高可达3 0 u m 研究了酵母菌s d u 2 9 0 产菊粉酶的分布，表明菊粉酶约有7 0 分布在细胞 壁上，只有约2 0 的菊粉酶分泌到细胞外。通过d e a e s e p h a r o s e 、b i o g e lp 1 0 0 柱层析等方法，分离到细胞壁酶组分i n u l 和胞外酶组分i n u 2 ，经过s d s p a g e 检测表明两者为一种组分，分子量为8 4k d a ，i e f 测定其p i 为4 3 。 对酶组分i n u l 基本酶学性质进行了研究，酶反应最适温度为5 5 c ，p h 4 5 6 5 的范围内活性和稳定性都很高，最适合酶反应p h 为5 0 。测定了i n u i 的菊 粉k m 值为o 2 2m 咖l ，蔗糖k m 值为o 5 1r a g m 1 。金属离子对酶活影响表明， c a 2 + 、m n 2 + 、m 9 2 + 对酶活有促进作用；a g + 、z n 2 + 、c u 2 + 、f e 2 + 、f e 3 + 对酶活力有 强烈的抑制作用；b a 2 + 没有明显的作用。 测定不同底物对i n u l 酶活力的影响，结果表明，菊粉聚合度的不同、提取 工艺的差异，以及提取原料的差别，都对酶活有很大影响。对酶解产物进行了薄 层层析，产物都以果糖为主，表明水解是从菊粉的果糖端开始，逐个的水解下一 个果糖单位，产生果糖和少一个果糖单位的寡聚糖，是一种外切型菊粉酶 关键词：季也蒙毕赤氏酵母 菊粉酶条件优化分离纯化 i i 山东大学硕十学位论文 r e s e a r c ho nt h ei n u l i n a s eo f p i c h i a g u i l l i e r m o n d i i a b s t r a c t y e a s ts t r a i ns d u 2 9 0w a ss c r e e n e df r o mt h ec o l l e c t i o no fo n rl a bf b ri t sh j g h a r p r o d u c t i o no fi n u l i n a s e t h i ss t r a i n w a si d e n t i f i e d 越p i c h i ag u i l l i e r m o n d i ib y m o r p h o l o g y , 。p h y s i o l o g ya n dt h ei d e n t i f i e ds y s t e mo fa u t o m a t i cm i c r o o r g a n i s mo f b i o l o g t h ei n f l u e n c e0 1 1p r o d u c i n gi n u l i n a s ew i t hd i f f e r e n tc a r b o ns o u r o e s ，n i t r o g e ns o u r c e s ， i n i t i a lp h ，m e t a lc h e m i c a lc o m p o u n dw a ss t u d i e d ，t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e o p t i m u mf e r m e n t e dm e d i u mw a s ：i n u l i n2 5 ；y e a s te x t r a c t0 8 ；( n 战) 2 h p 0 4 0 2 ；m g s 0 4 7 h 2 05 m m o v l ；p h5 5 u s i n gt h e s eo p t i m a lc o n d i t i o n s ，t h i ss t r a i n w a sf e r m e n t e di nf e r m e n t o ra n dt h ee n z y m ea c t i v i t yo ft h e i rf e r m e n t e dl i q u i dw a s m e a s u r e d ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee n z y m ep r o d u c i n gp e a ka p p e a r e da f t e rb e i n g e u l t i v a t e df o r6 0h o u r sa n dt h eh i 曲e s tf e r m e n t e d - l i q u i dc u z y m ea e t i v i t yr e a c h e d 3 0 u m 1 t h ed i s t r i b u t i o no ft h ei n u l i n a s eo fs d u 2 9 0w a ss t u d i e da n dt h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h ei n u l i n a s ed i s t r i b u t e dw i t h i nc e l lw a l la n de e l lm a i n l y , a n dt h c r ew a sl i t t l ei n u l i n a s e s e c r e t e do u t s i d et h ee e l l t h ec o m p o n e n t so fi n u la n dd t u 2w e r ei s o l a t e da n d p u r i f i e df r o mc e l lw a l la n df e r m e n t e dl i q u i dr e s p e c t i v e l yb yu s i n gi o n c x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y 耐t l ld e a e - s c p h o r a s ea n de x c l u s i o i ic h r o m a t o g r a p h y 喇t l lb i o g e l p - 1o o e a c hc o m p o n e n ts h o w e do n eb a n do ns d s - p a g ea n dw a si d e n t i f i e dt h es a l t l e c o m p o n e n tw i t hm o l e c u l a rw e i g h t8 4 l ( d 扎t h ep lw a sm e a s u r e dt ob e4 3b yi e e e n z y m er e s p o n s er e s e a r c hi n d i c a t e dt h a tt h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ew a s5 5 c t h e a c t i v i t ya n ds t a b i l i t y i np n 4 5 - 6 5w e r eh i g ha n ds t a b l e t h ei n f l u e n c eo f m e t a li o n0 1 1 t h ee n z y m ea c t i v i t yw a ss t u d i e d c h a r a c t e r i z a t i o no f t h er e a c t i o np r o d u c t sw a sd o n eb yt h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h y , t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep r o d u c t i o nw e r em a i n l yf r u c t o s ea n dt h i si n u l i n a s ew a s e x o i n u l i n a s e k e yw o r d s ：p i c h i ag u i l l i e r m o n d i i , i n u l i n a s e , c u l t u r ec o n d i t i o n , p u r i f i c a t i o n i l l 山东人学硕十学位论文 缩写词表 a a d e a e d n s f f o s g g o s i e f k d a m w n t g o i l f p a g e p m s f s d s t l c a m i n oa c i d d i e t h y l a m i n o e t h y lc e l l u l o s e 3 , 5 一d i n i t r o s a l i c y l i ca c i d f r u c t o s e f r u c t o o l i g o s a c c h a r i d e g l u c o s e g a l a c t o o l i g o s a c c h a r i d e i s o e l e c t r i cf o c u s i n ge l e c t r o p h o r e s i s k i l o d a l t o n m o l e c u l a rw e i g h t n i t r o s o g u a n i d i n e o p e nr e a d i n gf r a m e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p h e n y l m e t h y ls u l f o n y lf l u o r i d e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e t h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h y 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论支作者签名：芝垫垂 日期：至型! 丝! 兰 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：至出师签名： 山东大学硕士学位论文 1 1 导言 第一章研究工作背景 菊粉( i n u l i n ) 又称菊糖、土木香粉。菊粉的研究始于1 8 0 4 年，当时德国科 学家r o s e 首先从旋复花属( 如肠) 土木香( i n u l ah e l e n i u m ) 根茎中提取出一种果 聚糖，1 8 1 8 年t h o m s o n 将这种果聚糖命名为菊粉。1 8 6 4 年，德国j u l i u ss a c h s 利用显微镜观察到菊芋( h e l i a n t h u st u b e r o s u s ) 、大丽花( d a h l i a ) 并d - k 木香块茎中 菊粉的球状晶体结构。至此人类开始逐步的研究菊粉。 1 2 菊粉结构、物化性质和生理功能 1 2 1 菊粉的结构 菊粉是由果糖经过1 3 - 2 ，1 果聚糖苷键连接的多聚果糖，而且在果糖残基末 端连有一个葡萄糖，是比较简单的果聚糖，简写为g in ，此外，菊粉还含有很少 量的末端没有连葡萄糖的果聚糖，简写为f m t ”。菊粉的结构如图1 1 ，聚合度为 2 6 0 ，平均聚合度3 0 左右，其中聚合度较低时( 2 9 ) ，则称为低聚果糖【2 】。菊 粉作为一种贮存性的多糖，广泛存在于菊芋、菊苣、大丽花等植物中。菊粉的果 糖链因植物种类、生长期、气候以及土壤的不同而有些差异【3 】。 g f n f m 图1 - 1 菊粉的化学结构 山东大学硕士学位论文 1 2 2 物化性质 商品菊粉为白色无定形粉末，吸湿性强，在水中分散时极易结块。菊粉微溶 于冷水，易溶于热水菊粉无味，标准菊粉常常因含有少量的单糖和双糖而略带 甜味，其物化特征见表1 1 。 表1 - 1 菊粉的物化特征表【2 】 1 2 3 菊粉的生理功能 菊粉是一种水溶性膳食纤维，菊粉及其降解产物( 低聚果糖) 对人体的作用 有些相似。综合国内外的研究报告【2 ，4 j 6 7 9 】，将其生理功能总结如下： ( 1 ) 、调节肠道菌群，增殖双歧杆菌。由于菊粉在人体不易消化吸收，能为 双歧柯菌所利用，是双歧杆菌的增殖因子。菊粉及其低聚果糖被双歧杆菌利用后， 产生的有机酸可使肠道内的p h 下降，抑制沙门氏菌等腐败菌的生长，改善肠道 山东大学硕士学位论文 环境，并且提高免疫力。 ( 2 ) 、菊粉是水溶性膳食纤维，能够降低血清胆固醇和甘油三酯含量，使用 后不会造成血糖的增加，适合高血压、糖尿病患者食用，也适合作减肥食品 ( 3 ) 、菊粉及其降解产物不能被突变链球菌( s t r e p t o c o c c u sm u t a n s ) 作为发 酵底物生成不溶性葡聚糖，在口腔内不产牙垢，不提供微生物沉淀、产酸和腐蚀 的场所，因此具有防龋齿功效。 ( 4 ) 、促进矿物元素的吸收，提高c a 2 + 、m 矿的生物可利用性。能促进矿 物元素特别是磷酸钙的吸收量，防止中老年入骨质疏松。 ( 5 ) 、其他方面，菊粉还可以用于抗肿瘤方面，可以激发免疫活性，具有阻 止癌变的功效。 1 3 菊粉酶和产菊粉酶的微生物 1 3 1 菊粉酶分类 菊粉酶( i n u l i n a s e ) ，学名1 3 - 2 ，1 d 果聚糖水解酶( e c 3 2 1 7 ) ，属于争果糖 苷酶类，又叫争果糖苷酶、p 果聚糖酶。菊粉酶可以在一定的温度条件下水解菊 粉为果糖或者低聚果糖。 按照作用方式的不同，菊粉酶分为内切型菊粉酶和外切型菊粉酶。内切型菊 粉酶随机地断开菊粉内部的糖苷键，水解菊粉为功能性低聚果糖；外切型菊粉酶 作用于菊粉链的非还原性末端的糖苷键，逐个的水解切下果糖基，形成d 果糖。 外切型菊粉酶底物范围较广，往往同时具有菊粉酶和转化酶活性。内切酶和外切 酶的区分常常用s1 9 , o l 的大小来作为一个酶学性质的指标，其中i 是以菊粉 ( i n u l i n ) 为底物时的酶活，s 是以蔗糖( s u c r o s e ) 为底物的酶活对于最终选 取多大的i s 值来区分内切型菊粉酶和外切型菊粉酶，至今尚无统一的标准。 有些报道，以i s = l 为区分的界限，小于1 为外切型菊粉酶，反之则为内切型 菊粉酶1 钔。亦有人报道i l2 1 习f s i o 时外切酶活性被抑制，而表现出内切酶活性。 h e s n y d e r 研究认为，菊粉酶的i | 缶界值为i s = 0 0 3 o 0 5 ，大于此值为菊粉酶， 反之则为蔗糖酶l 】虽然标准没有统一，但是有一个共识就是外切菊粉酶表现出 3 山东大学硕七学位论文 转化酶活性，对蔗糖有较高的活性，即l s 低。然而，内切型菊粉酶对菊粉和 低聚果糖的活性较高，故l s 比较高。 按照酶在细胞中的分布，分为细胞外、细胞壁结合和细胞内酶三种类型这 三种类型酶的分布，随着菌种不同而有所变化。r o b e r tj r o u w e n h o r s t 研究表明，培 养条件也影响菊粉酶的分布【1 5 】。m a r g a r u t t e s 报道酵母菌产生的菊粉酶有2 5 在 细胞外。7 5 在细胞壁和细胞内【1 6 】，然而，r o u w e n h o r s t 等人的研究表明，酵母 菌有5 0 的酶分布在细胞外【m 对于马克思克鲁维氏酵母( k l u y v e r o m y e e s m a r x i a n u s ) 的研究表明，菊粉酶胞外、胞壁结合和胞内酶三种类型的比例为3 9 ： 6 1 ：1 ，其转基因宿主菌s a c c h a r o m y c o d e sc e r e v i s i a e 的比例变化为7 6 ：2 2 ：2 旧。 对于足m a r x i a n u s 培养基中碳源的不同也会影响酶的分布，碳源为菊粉时，分布 比例为6 5 ：2 1 ：1 2 ，碳源为蔗糖时三种类型比例为4 8 ：3 2 ：2 0 ，培养的温度也 影响酶分布，随着培养温度的提高，胞外酶的比例下降，其他两种类型酶的比例 则上升，在2 7 下三者比例分别为6 2 ：2 8 ：1 0 ，在3 7 下为6 1 ：1 8 ：2 l ，在 4 2 下分别为4 6 ：2 1 ：3 3 ，在4 6 下分别为2 5 ：3 3 ：4 2 【1 9 1 。 1 3 2 产菊粉酶的微生物 菊粉酶的来源广泛，自然界中的许多植物都可以合成菊粉酶，但是工业用的 菊粉酶都是来源于微生物。微生物来源的菊粉酶酶的种类多，适合发酵生产。据 不完全统计，目前已经知道的产菊粉酶的微生物中，丝状真菌有1 7 属4 0 余种， 酵母菌中有1 0 属2 0 余种，细菌中有l o 属2 0 余种1 2 0 1 。霉菌中，菊粉酶的研究主 要集中于曲霉属0 印e 唾j 7 淞) 、青霉属( p e n i c i l l i u m ) 、木霉属( t r i c h o d e r m a ) 、镰 孢属( f u s a r i u m ) 。酵母菌中主要集中于马克思克鲁维氏酵母( k l u y v e r o m y c e s m a r x i a n u s ) 、脆壁克鲁维氏酵母( 彪f r a g i l i s ) 、假丝酵母( c a n d i d a ) 、德巴利酵母 属( d e b a r o m y c e s ) 等。细菌中主要集中于节杆菌属( a r t h r o b a c t e r ) 、假单胞菌 属( t s e u d o m o n a s ) 、芽孢杆菌属( b a c i l l u ss p ) 、黄杆菌属( f l s v o b a t e r i u m ) 、链霉菌 属( s t r e p t o m y c e s ) 、葡萄球菌属( s t a p h y l o c o c c u s ) 等在这些微生物中，所产的菊 粉酶的种类有所不同。其中有些菌种既可以产外切酶还可以产内切酶和转化酶， 如黑曲霉( 彳n i g e r ) 【2 、无花果曲霉( a d 6 c l g u m ) 阎、青霉菌( p e n i c i l l i u m ) 【2 3 】 有些菌种则只产生内切型菊粉酶，不产外切型菊粉酶，如a t h r o b a c t e rs p 【2 4 1 ， 4 山东大学硕士学位论文 p s e u d o m o n a s s p 【2 5 1 、x a n t h o m o n a ss p 1 2 6 】。p a e n i b a c i l l u ss p c b d 0 0 3 、p a e n i b a c i l l u s s p c b d 0 0 4 、p a e n i b a e i l l u s s p c b d 0 0 5 1 2 i 3 3 产菊粉酶微生物的筛选 筛选产菊粉酶的菌种时，一般利用“水解圈”方法。这种方法主要是利用了菊 粉不溶于冷水易溶于热水的特性。在菊粉为唯一碳源的琼脂平板上，菊粉会沉淀 在底部，使平板成为不透明。当样品中有分泌菊粉酶的微生物时，就可以利用菌 落附近的菊粉，这样在其菌落周围即可形成透明的“水解圈”筛选菌种的样品一 般从腐烂的菊芋或者菊苣根际土壤中选取。筛选出来的野生菌株往往酶活性很 低，往往需要对菌株进行诱变以提高其产酶活力。s k o w r o n e k 等，利用紫外线辐 射和化学诱变剂( n t g ) 同时处理彳n i g e r , 最后得到一个突变株，该突变株能 抗化学诱变剂而且能在低温( 1 5 ) 下生长良好，产酶能力也提高了2 0 5 0 【2 引。 王建华等，筛选到一株克鲁维酵母菌，采用高密度细胞发酵，该菌发酵液中的酶 浓度可达2 8 8 7 8 u m l t 2 9 1 ，同样是克鲁维酵母菌株，魏文玲等对另一菌株克鲁维 酵母进行发酵研究时发现，发酵液菊粉酶活力只有6 8 9 u m l 3 0 】，而s t r e p t o m y c e s s p g n d u 的发酵液中胞外菊粉酶的含量更仅有0 5 5 2 u m l 。由此可见不同菌种 或同一菌种不同菌株的产酶量相差很大。 总结前人对菊粉酶的部分菌株筛选结果，见表1 2 表1 - 2 菊粉酶部分菌株筛选表 菌种培养方式 酶活( u m l ) 文献来源 k l u y v e r o m y c e s1 w 9 8 0 1 6 6 l 发酵罐2 8 8 7 8 2 9 足s p y - 8 5 摇瓶2 5 0 63 1 置m a r x i a n u s 摇瓶 3 4 53 2 置夕硼 7 5 l 发酵罐2 7 43 4 a s p e r g i l l u sn i g e r 摇瓶5 6 74 5 a n i g e r摇瓶4 8 4 4 8 一n i g e r 摇瓶 3 01 3 f u s a r i u ms p 摇瓶0 0 87 3 p e n i c i l l i u ms p 摇瓶 9 0 l5 l 山东人学硕七学位论文 从筛选的结果来看，酶活力的差别很大，其中一方面是由于菌株的活力有差 别造成，另一方面菊粉酶酶活测定以及酶活力单位定义上的不统一，也造成不同 研究者的结论差别。酶活力的测定方法对确定菊粉酶活力水平、特异性及归类有 重要意义，但目前在菊粉酶活力测定方法及酶活力单位定义上尚未统一。多数菊 粉酶活力测定报道，是以不同聚合度、纯度和浓度的菊粉或蔗糖做底物，测定反 应混合物在一定时间内还原糖的增加量。另外，内切型菊粉酶的酶解产物多为低 聚果糖和少量果糖，所以按现有的酶活测定法及酶活定义，其酶活水平将普遍比 外切型菊粉酶低。因此测定酶活力单位定义标准的统一是急需解决的问题。 1 4 菊粉酶的发酵条件 i 4 1 碳源的影响 菊粉酶通常认为是一种诱导酶，大多数的结果认为以菊粉为碳源比其它糖作 为碳源时产酶要高，而果糖和葡萄糖一般抑制菊粉酶的产生1 3 5 j 6 - o o 。对于菊粉的 诱导作用也有不同的研究结果。据报道，1 ( t n a r x i n u sc d b b - z - 2 7 8 利用菊粉为碳 源比甘油作碳源时产酶活力提高5 7 倍，而在果糖和葡萄糖为碳源时，则酶活明 显下降1 3 7 】。相反的报道，g r o o t w a s s i n k 研究发现，蔗糖、果糖对足舡酊凰菊粉 酶的产生有促进作用，进一步对其突变株研究发现，该酶的产生与碳源无关。同 样是对于克鲁维酵母，郑忠辉研究了克鲁维酵母y - 8 5 发现，该菌产生的酶受木 糖和菊粉诱引堋另外，c a z e t t a 等研究了y a c o ne x t r a c t 作为碳源对k l u y v e r o m y c e s m a r x i a n u s v 4 b u l g a r i c u s 产菊粉酶也很甜1 0 2 。综上所述，不同结果的差异，可能是 不同的菌株受到的诱导物和阻碍物都存在差异。 1 4 2 氮源的影响 在不同的培养条件下，由于菌株不同，氮源的影响也不同。对于脆壁克鲁维 酵母菌研究表明，以蛋白胨作为氮源时酶活最高【3 9 】。k i m 对一株青霉的研究表 明，蛋白胨和玉米浆可以提高酶的产量，尿素和酵母膏的影响不大，在氮源中， n h 4 h 2 p 0 4 和( n h h h p 0 4 对产酶有促进作用，而( n h 4 h s 0 4 、n i - 1 4 c i 也可以适当 6 山东大学硕士学位论文 促进酶的产生。魏文玲对木霉f x 1 研究了不同氮源的影响，结果表明，玉米浆 和牛肉膏比酵母膏的产酶效果要好，培养基中添加蛋白胨时产酶较差【4 0 1 。正是由 于菌株的不同，菌株的营养要求不同，才使研究的结果不同。 1 4 3 温度的影晌 温度对产酶的影响很大。假丝酵母产酶温度研究表明，该菌产酶的最适合温 度2 7 3 0 ( 2 ，温度降低或者升高都会减少酶的产生【4 1 】。有些菌种的生长温度和产 酶温度并不统一，脆壁克鲁维酵母的中最适合生长的温度为2 8 3 0 ( 2 ，而产酶温 度为3 0 _ 3 4 c 4 2 。真菌产酶的温度也在3 0 c n ；占，黑曲霉a n i g e r 的产酶温度 为3 0 c 1 4 3 1 。 1 4 4 金属离子影响 对于同一个菌株而言，不同的金属离子对其产酶的影响不同；即使是同一种 金属离子对不同的菌株影响也有不同。w a n g 采用克鲁维酵母高密度培养，培养 液中菊粉酶的酶活比以往报道高6 8 倍，在培养基中添加m 矿，结果表明m 矿 可使克鲁维酵母的产酶量提高1 l 【”。k i m 和k a y p t l l a 发现，在培养基添加 0 0 1 t 0 0 1 i , 的k c 、0 0 1 m o l l 的m g s 0 4 、0 0 0 l m o l , 的f e s 0 4 能促进p e n i c i l l i u m s p 1 和a s p e r g i l l u sn i g e r l 2 的产酶能力。提高酶量分别为3 2 、2 6 、1 2 1 4 ”。 顾天成等人对克鲁维酵母的研究表明，c a 2 对产酶有促进作用【删 1 4 5 复合因素影响 除了单因素对产酶的影响外，也有关于采用正交试验的方法来研究培养条件 对产酶的影响的报道。k a l i l 等采用正交实验系统研究了培养基组成对克鲁维酵 母菊粉酶产量的影响，研究者改变培养基中的五个参数，即培养基中的蔗糖浓度、 蛋白胨浓度、酵母提取物浓度、p h 、k 2 h p o 浓度，来研究发酵液中的菊粉酶含 量，结果表明，这五种组分对克鲁维酵母的产酶量都有显著的影响，其中蔗糖、 p h 对菊粉酶生产有抑制作用，而蛋白胨、酵母提取物、k 2 h p 0 4 对产酶有促进作 用。发酵过程中p h 变化很大，其保持产酶的最适p h 维持在p h 3 5 ，其它四种 山东人学硕十学位论文 参数最佳值分别是：蔗糖，1 4 9 l ，酵母提取物，1 0 9 l ；蛋白胨，2 0 9 l ；k 2 h p 0 4 ， l g l 在最适产酶条件下，发酵液中的酶活可达1 2 7 u m l ，产酶量比条件优化前 提高了约6 倍【4 7 】同样是克鲁维酵母，b e r n a r d oo 研究了发酵中的通气量、搅拌 速度以及转子对培养液的剪切力等因素对足m a r x i a n u s 的产酶的作用。研究发 现，通气量对酶的产生影响小，提高搅拌的速度，会增加菌体的死亡率，导致酶 的产生减弱，利用不同的转子研究对培养液的剪切压力，表明产酶最大的剪切压 力为0 2 2 p a t 响。 1 5 菊粉酶的性质 鉴于菊粉酶在工业上的重要应用前景，国内外许多实验室正开展菊粉酶酶学 性质以及分子生物学研究，以期为实际应用提供理论支持。 1 5 1 菊粉酶的纯化 菊粉酶的分离纯化步骤一般采用传统的蛋白分离方法：( n h 4 ) 2 s 0 4 沉淀、离 子交换层析及凝胶过滤色谱等。据报道，采用离子交换层析可以选择性分离外切 型菊粉酶和内切型菊粉酶。通常用n a c i 进行线性梯度洗脱，随着n a c l 浓度增加， 内切菊粉酶先洗出，外切酶后洗t i l t 4 9 1 。对于不同的菌株而言，所产的酶的性质不 同，酶的分离方法也是不同。其中( n i - h ) 2 s 0 4 沉淀蛋白的方法，对k m a r x i a n u $ v a r b u l g a r i c u s 菊粉酶易失活，最好用丙酮、乙醇沉淀或冷冻干燥i s 2 。菊粉酶在分泌 的过程中常常伴随着糖基化，糖链部分占酶分子量2 6 3 7 。低聚糖以糖苷键 的形式与酶蛋白中的天门冬酰胺残基相连。由于有糖基化的存在使各组分含糖量 不同，往往使纯化后的菊粉酶在s d s p a g e 和活性电泳中表现出几条谱带，用 e n d o h 去除酶蛋白中的糖后，在电泳中得到单一谱带f 】 1 5 2 酶的性质 随着对菊粉酶的深入研究，对菊粉酶的酶系组成也有了进一步的认识彳 加”姗菊粉酶经纯化得到三种酶：外切酶i 、外切酶i i 和内切酶l ，三种酶分子 量分别为, 1 2 9 k d a 、4 3 4 k d a 、4 7 2 k d a 外切酶l 和外切酶l i 。以菊粉和蔗糖作 山东大学硕士学位论文 为底物时，其最适反应温度分别为6 0 和6 5 ，最适p h 均为4 7 i 列。从a n i g e r 3 1 9 发酵液中纯化菊粉酶，研究表明该酶是一个相对分子量为2 8 k d a 的单体糖 蛋白，p i 为5 4 ，最适p h 和最适温度分别为p h 5 0 和6 0 c ，该酶可被h 矿、p b 2 + 、 c u 2 + 等重金属离子强烈抑制，最适底物是菊粉，粥值为0 3 8 4 ，k m 和v m 分别 为6 2 5 m m o l l 和6 7 11 n m 0 1 m g 1 m i n 1 【5 5 】w a n g 等从克鲁维酵母培养液中纯化 的菊粉酶，其i s 值为0 0 4 0 ，该酶的最适p h 为p h 4 4 ，最适温度为5 5 ( 2 ，对两 种底物菊粉和蔗糖的k m 值分别为1 3 3 m m o l l 和6 2 6 m m o l l ，5 5 ( 2 时的半衰期 为1 6 小时。该酶在p h 3 8 5 6 ，5 0 5 7 5 c 范围内相对稳定1 。u z u n o v a 等研究了 可降解菊粉的嗜热芽孢杆菌b a c i l l u ss p 1 l 的酶学特性，结果表明，该酶为外切菊 粉酶，在6 5 c ，p h 5 5 7 5 条件下具有最高的催化活性【5 6 1 。j i 等从a n i g e r 中纯 化了四种外切菊粉酶，其分子量分别为1 0 2 6 、9 7 9 、6 2 5 和3 6 5 k d a ，等电点分 别是4 1 5 、4 2 4 、4 4 8 、4 1 5 ，该酶在5 5 6 0 ，p h 4 0 - p h 5 0 的范围内表现出最 高催化活性，且分子量越小，其热稳定也越好【5 7 1 。g i l l 等实验证明了s t r e p t o m y c e s s p g n d u i 菊粉酶的最适温度是6 0 ( 2 ，最适p h 为p h 5 5 1 5 8 】。m o r i y a m a 等从青 霉菌p e n i c i l l i u ms p t n - 8 8 中纯化了一种胞外外切菊粉酶，其相对分子量为8 1 k d a ， 最适温度为5 5 c 最适p h 为p r t 5 0 t 5 9 1 。u h m 等从a ：c o r m 中纯化出了分子量分 别为6 4 k d a 、6 6 k d a 的两种内切菊粉酶，没有转化酶活性，它们源自同蛋白， 但糖基化程度不同，该酶为单体酶，以菊粉为底物，其k m 、v m 分别为8 i m m o l l 和7 7 3 u r a g ，该酶的级结构与p e n i c i l l i u mp u r p u r o g e n u m 的内切菊粉酶有较高 的同源性【6 0 1 。f e r r e i r a 等分析了c l a d o s p o r i u mc l a d o s p o r i o d e s 分泌的转化酶和外 切菊粉酶酶学性质，结果表明，这两种酶的i s 值分别是0 3 l 和o 3 6 ，最适温 度都是6 0 c 1 6 1 】。h a m d y 等从a h e r n a r i aa l t e r n a t a ( f r ) k e i s s l e r 中纯化了胞外菊粉 酶并研究了其性质，该酶最适温度为5 5 c ，最适p h 为p h 4 5 ，b a 2 + 、c a 2 + 是该 酶的激活剂，而c u 2 + 、f e 抖、h 9 2 + 则是该酶的抑制剂，该酶的分子量约为1 1 5 k d a ， k i n 值为0 0 6 6 m m o v l ，i s 为0 5 1 0 2 1 。g i l lp k 等人对a f i , m i g a t u s 的外切菊粉酶 研究表明，其分子量为2 0 0 k d a ，p l 为8 8 1 9 9 1 总结国内外部分的研究结果见表 1 3 。 。 9 山尔人学硕士学位论文 表1 - 3 菊粉酶的性质研究部分总结表 1 6 菊粉酶的分子生物学研究 1 6 1 外切型菊粉酶的分子生物学研究 菊粉外切酶分子生物学研究始于9 0 年代，l a l o u x 等克隆的克鲁维酵母胞外 菊粉酶的e d n a ( i n u l ) ，o r f 长度1 6 6 8b p ，编码5 5 5 个氨基酸残基，s - p g 端具 l o 山东人学硕十学位论文 有1 6 个从的信号肽序列。全序列共有1 3 个可能的糖基化位点，基因进化分析表 明，该蛋白的一级结构与s c e r e v i s i a e 转化酶有6 7 的同源性家族，并成功地转 化& c e r e v i s i a e , 重组酵母表达产物具有功能性。但还不具有生产意义【6 3 】。 t s u j i m o t o 等从g e o b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u sk p l 2 8 9 中克隆了编码其外切菊 粉酶的基因i n u a ，i n u a 全长1 4 8 2 b p ，编码4 9 3 个氨基酸残基，由该基因推测编码 蛋白的分子量为5 6 7 k d a ，一级结构与p s e u d o m o n u sm u c i d o l e n s 外切菊粉酶有很 高的同源性，重组蛋白最适温度为6 0 ，重组酶的活性形式为单体酶【6 4 1 。 m o r i y a m a 等分别克隆了编码一株青霉菌外切菊粉酶的基因( i n u d ) ，比较其e d n a 序列与基因组序列发现，该基因内部含有长度为5 6 b p 单拷贝的内含子，编码蛋白 含有2 5 个氨基酸残基组成的信号肽，成熟蛋白含有6 7 7 个氨基酸残基，存在8 个可 能的糖基化位点【5 】。王婧等，研究了k m a r x i a n u s y j 0 9 的菊粉酶基因i n u b l ，序列 测定分析表明i n u b l 的o r f 全长1 6 6 5 b p ，没有内含子，其中存在4 个潜在的糖基化位 点以p p i c 9 k 为表达载体，构建i n u b l 的酵母转化载体，转化毕赤酵母中，获得菊 粉酶基因工程菌g s l l 5 f i n u b l ，用甲醇诱导其发酵表达菊粉酶，i n u b l 基因重组的 胞外菊粉酶分子量为9 0 k d a ，比酶活性是1 2 2 9 u r a g t l 0 3 1 。将足m a r x i a n u sk w 0 2 的菊粉酶基因h a u l 转化至l j p i c h i a p a s t o r i s ，中，得到的重组子发酵培养后，其酶活达 至t j 5 2 u m l1 1 0 4 。 1 6 2 内切型菊粉酶的分子生物学研究 1 9 9 8 年，o h t a l 研究了黑曲霉内切型菊粉酶的基因结构嘲结果表明：该茵 内切菊粉酶有两种基因i n u a 和i n u b ，为同一个基因衍生物，o r f 均为1 5 4 8 b p ，编 码5 1 6 个从，前2 3 个从为信号肽序列，不含内含子。二者不同之处在于序列中有8 个从不同，二者g 屺分别为5 4 、5 4 3 ，有5 个可能的糖基化位点。 u h m 研究了无花果曲霉f i c u u m ) 内型菊粉酶基因i n u 2 【6 6 】，结果显示o r f 长度1 5 5 1 b p ，编码4 9 2 个从，有2 2 个从为信号肽序列，该酶从序列与一株青霉 ( p e n i c i l l i u mp u r p r o g e n u m ) 内切菊粉酶酶蛋白的同源性高达7 3 3 f 6 7 】。将a f i c u u m 内切菊粉酶基因i n u 2 【6 8 】在& c e r e v i s i a e 中得到表达，得到了& c e r e v i m a e y s h 2 1 6 4 - 2 c ( p r 4 1 n u 2 ) 基因工程菌，只产内切酶，无外切酶。o n o d e r a 小组从 p e n i c i l l i u mp u r p r o g e n u m 中克隆到菊粉内切酶基因i n u a 并测序，o r f 长度 山东人学硕七学位论文 1 5 4 8 b p ，编码5 1 5 个a a ，其中2 5 个从为信号肽，4 9 0 a a 为成熟酶蛋白，酶蛋 白分子量为5 4k d a , g + c 4 7 8 。以ec o l i 为宿主菌所作用的表达初步研究表 明，i n u a 表达酶蛋白产量很低f 鲫。 k w o n 等a k b a c i l l u s p o l y m y x a 中克隆的基因( i n u ) 共1 4 5 5 b p ，编码4 8 5 个氨基酸 残基，分子量5 5 5 k d a l 6 8 1 p a n d e y 等，在啤酒酵母( & c e r e v i s i a e ) 上成功地表达了 菊粉内切酶基因，但所产酶量太少，尚不能与普通微生物生产酶相比 1 7 微生物菊粉酶的应用 1 7 1 菊粉酶的固定化研究 微生物菊粉酶的固定化研究已有很多报道 7 0 , 7 1 2 1 旧。菊粉酶的固定化研究较 多。载体般为几丁质或纤维衍生物1 4 1 。固定化酶具有良好的凝胶强度和酶解菊 粉重复操作的稳定性。获得的固定化酶凝胶颗粒表面具有众多微孔，能提高酶的 活性产率。对于固定化酶，其酸碱稳定性和热稳定性都有了都有较明显的改善， 为进一步应用奠定了基础。 1 7 2 外切型菊粉酶在高果糖浆生产中应用 利用外切型菊粉酶水解菊粉生产高果糖浆的研究有很多报道。黑曲霉纯外切 酶水解菊粉，2 4 小时后水解率大于9 0 ，产物中低聚糖为6 ，果糖达8 5 以上， 菊糖为8 克鲁维酵母菊粉酶，以每克菊粉加入6 u 酶在5 5 下进行降解反 应，l 小时降解率达到3 0 6 ，2 4 小时达到8 2 2 ，4 8 小时达到8 9 6 i ”】。王建华 等研究了利用菊芋汁原料进行一步法制备高果糖浆工艺，酶在5 0 水解6 小时 后，底物的水解率达到9 5 ，酶解产物中的果糖含量9 5 以上【7 4 1 。 1 7 3 内切型菊粉酶在低聚果糖生产中的应用 利用内切型的菊粉酶进行低聚果糖的研究也非常活跃p e n i c i l l i u m p u r p u r o g e n u m 内切菊粉酶，降解菊粉产物中以f 3 ，f 4 和f 5 低聚果糖为主，降解 率为3 2 纠7 5 1 k i m 研究了p s e u d o m o n a s s p 内切菊粉酶水解菊粉表明，底物浓度 山东文学硕士学位论文 为5 0 9 a _ ，反应4 8 h 后低聚果耱产率最大7 5 6 ，产物从f 2 到f 7 ，以f 2 和 f 3 为主【7 6 1 。c h o y j 研究了x a n t h o m o n a s s p 的内切菊粉酶的产物分析，结果表 明p h 7 0 时的菊粉最高转化率为9 3 ，水解产物中，果糖的聚合度多是f 5 的低 聚糖【8 0 1 。 1 7 4 菊粉酶在酒精生产方面的应用 利用菊粉酶生产酒精。由于许多酿酒酵母不能直接利用菊粉，因此利用分 泌菊粉酶的微生物或直接