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r n a i 沉默光合膜磷脂合成酶基因的研究 摘要 磷脂是动物和植物非光合组织细胞膜系统的主要组成成分，在细胞生命过 程中扮演着重要角色。尽管绿色植物光合膜的的甘油脂主要是糖脂，但是它仍 然含有大约1 0 的磷脂，说明磷脂在光合膜的结构和功能中起重要作用。构成 生物膜的磷脂有多种，但是，光合膜只含有磷脂酰甘油( p g ) 一种磷脂。光合 膜中的p g 有其特殊性，即：在p g 的s n 2 位上总连着一个棕榈酸( 1 6 ：0 ) 或 者反式十六碳烯酸( 1 6 ：1 t r a n s ) ，说明了这种具有特殊结构的甘油脂在维持类囊 体膜的结构和功能方面具有重要的作用。 叶绿体中有两个重要酶参与了p g 的生物合成，它们分别是胞嘧啶二脂酰 甘油合成酶( c d s ) 和磷脂酰甘油合成酶( p g s ) 。本实验以烟草和马铃薯为材 料，利用r n a i 技术，对c d s 和p g s 基因的表达进行抑制，通过p g 缺失突变 体，研究其功能。 对转含有p g s 片段的沉默结构的转基因烟草叶片膜脂进行了分析，结果表 明，与野生型烟草相比较，其p g 含量下降了约2 0 ，同时，s q d g 和p c 的 含量增加。p g 含量的降低没有引起m g d g 和d g d g 含量的变化。另外，我们 还对转基因植株目的基因片段的r n a 表达水平进行了r t - p c r 分析，发现其表 达量大幅度降低。这些结果表明，在转基因株系中，p g s 基因的表达受到了抑 制，说明我们获得了p g 部分缺失的烟草p g s 突变体。 对烟草p g 缺失体的p g 脂肪酸组成进行分析，表明其特征性脂肪酸反式 十六碳烯酸含量明显下降，比野生型降低了4 4 ，c 1 8 ：0 、c 1 8 ：1 和c 1 8 ：2 的相 对含量增加，整个变化与总脂脂肪酸变化基本一致。 为了研究p g 缺失对光合作用的影响，我们分析了多种光合指标。对叶绿 素含量的分析表明，p g 含量的降低影响了光合色素的组成。p g 部分缺失的转 基因烟草中的叶绿素总的含量下降，其中叶绿素b 含量下降更为明显，结果， 叶绿素a 与叶绿素b 的比值较野生型高。转基因植株净光合速率下降，二氧化 碳利用率降低；p s i i 的最大光化学效率( f v f m ) 和实际光化学效率( q b p s i i ) i v 中国科学院研究生院博士学位论文 降低，光化学猝灭下降，非光化学猝灭增加，尤其老叶的变化更为明显。这些 结果说明了p g 的部分缺失影响了植株的光合能力，捕光色素蛋白复合体的结 构受到了影响，p s i i 功能遭受损伤。 同时，我们根据已经报道的马铃薯c d s 基因，克隆了一个片段，构建沉默 结构，并对沉默结构进行了转化。通过抗性基因的筛选以及r t - p c r 检测，证 明了沉默结构转化成功，目的基因的表达受到抑制，获得了马铃薯c d s 转基因 植株。 对马铃薯野生型和c d s 转基因植株进行膜脂和脂肪酸分析表明，转基因植 株叶片的p e 、p g 和p c 等磷脂含量降低，s q d g 和d g d g 含量增加；c 1 6 ：1 ( 3 f ) 、c 1 6 ：2 、c 1 6 ：3 、c 1 8 ：1 和c 1 8 ：2 含量下降，c 1 6 ：0 和c 1 8 ：3 含量增加，而 c 1 6 ：1 和c 1 8 ：0 变化不明显。马铃薯c d s 转基因植株的叶绿素荧光分析表明， p s i i 最大光化学效率降低，从野生型的0 8 2 下降到0 7 7 。 关键词：磷脂酰甘油合成酶；胞嘧啶- - 酰甘油合成酶；r a n 干扰；烟草；马 铃薯 v r n a i 沉默光合膜磷脂合成酶基因的研究 a b s t r a c t p h o s p h o l i p i d sa r em a j o rc o m p o u n d si nn o n p h o t o s y n t h e t i ct i s s u e so fa n i m a l s a n dp l a n t s ，a n dp l a n yi m p o r t a n tr o l ei nt h el i f ec y c l eo fc e l l i ti sv e r yi m p o r t a n ti n t h es t r u c t u r ea n df u n c t i o no fp h t o s y n t h e t i cm e m b r a n e ，w h i c hh a s1 0p e r c e n to f p h o s p h o l i p i da l t h o u g hg a l a c t o l i p i d s c o n s t i t u t et h e m a j o r i t y o fi t p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l i s g e n e r a l l y c o n s i d e r e da s u n i q u e m o l e c u l e a m o n g p h o s p h o l i p i d s f o ri t s s p e c i a l i t y , t h a ti s ，i t h a s p a l m i t i ca c i d ( 16 ：0 ) o r a 3 一t r a n s - h e x a d e c e n o i c ( 1 6 ：l t ) e s t e r i f i e da ts n 一2p o s i t i o no fg l y c e r 0 1 t w ov i t a l e n z y m e s ，p h o s p h a t i d y l g l y c e r o ls y n t h a s e ( p g s ) a n dc y t i d i n e d i a p h o s p h a t ed i a c y l g l y c e r o ls y n t h a s e ( c d s ) i n v o l v e dt h ep h o s p h o l i p i db i o s y n t h e s i s i nc h l o r o p l a s t i nt h i ss t u d y , t h et w og e n e sa r ei n h i b i t e di nt o b a c c oa n dp o t a t o r e s p e c t i v e l yb yr n a i n t e r f e r e n c e a m o n gt h et o t a ll i p i d so ft h el e a v e sf r o mp g sp a r t i a l l yd e f i c i e n tl i n e s ，t h e c o n t e n to fp gr e d u c e da b o u t2 0 ，a n dt h ep e r c e n to fs q d ga n dp ci n c r e a s e d n o o b v i o u sc h a n g ei so b s e r v e di nt h ec o n t e n to fm g d ga n dd g d g 【i na d d i t i o n ， r t - p c ra n a l y s i sd e m o n s t r a t e dt h a tt h em r n a e x p r e s s i o ni si n h i b i t e dg r e a t l y t h e s e r e s u l t ss u g g e s tt h ep g sg e n ei sb l o c k e da n dw eo b t a i n e dp gp a r t i a l l yd e f i c i e n tl i n e s a n a l y s i so fp gl i p i da c i d sc o m p o s i t i o nd e m o n s t r a t e dt h a tt h ea m o u n to f 1 6 ：1 ( 3 t ) d e c r e a s e d4 4 ，w h i c hi st h er e p r e s e n t a t i v ef a t t ya c i do fp gt h ec o n t e n to f c 1 8 ：0 ，c 1 8 ：1a n dc 1 8 ：2i n c r e a s e d t o t a ll i p i da c i d sa n a l y s i se x h i b i ts i m i l a rf o r m w i t hp gl i p i da c i d s t h ed e f i c i e n c yo fp ga f f e c t e dt h ec o n t e n to fp i g m e n ti nt h el e a v e s t h ep g p a r t i a l l yd e f i c i e n tp l a n t sh a v el e s sp i g m e n t ，a n dt h ec h l bd e c l i n e dm o r et h a nc h l a ， s ot h er a t i oo fc h l at oc h l bw a sh i g h e rt h a nt h ec o n t r 0 1 d e f i c i e n tl i n e se x h i b i t w e a k e rn e t p h o t o s y n t h e t i cr a t e ，l o w e r c a r b o nd i o x i d eu t i l i z a t i o n b e s i d e s ， p h o t o c h e m i c a le f f i c i e n c yo fp s i id e c r e a s e d ，p h o t o c h e m i c a lq u e n c h i n gr e d u c e da n d v i 中国科学院研究生院博士学位论文 n o n 。p h o t o c h e m i c a lq u e n c h i n gi n c e a s e d t h er e s u l t sa b o v ei m p l yt h a tp gp a r t i a l l y d e f i c i e n th a sd e p r e s s e dt h ep h o t o s y n t h e t i cc a p a c i t y , a f f e c t e dt h es t r u c t u r eo fl i g h t h a r v e s t i n gc o m p l e x ，a n dr e d u c e dt h ef u n c t i o no fp h o t o s y s t e mi i s i m u l t a n e o u s l y , w eh a sc l o n e dp a r t i a lc d n as e q u e n c eo fc d si np o t a t ob a s e d o nr e p o r t e dr e l e v a n t g e n e ，a n dt h es i l e n c i n gc o n s t r u c to ft h i sg e n ei s u s e dt o t r a n s f o r mp o t a t o r e s i s t a n c eg e n ea n dr t - p c ra n a l y s i sd e m o n s t r a t et h a tt h et a r g e t g e n ei sr e s t r a i n e di ne x p r e s s i o n ，a n dp o t a t oc d st r a n s g e n i cl i n e sa r eo b t a i n e d t h ea n a l y s i so fm e m b r a n el i p i da n dl i p i da c i do fp o t a t oc d s t r a n s g e n i cl i n e s i n f e r r e dt h ec o n t e n to fp h o s p h o l i p i dd e c r e a s e di n c l u d i n gp e ，p ga n dp c ，a n ds q d g a n dd g d g i n c r e a s e d c 1 6 ：1 ( 3 t ) ，c 1 6 ：2 ，c 1 6 ：3 ，c 1 8 ：1a n dc 1 8 ：2r e d u c e di na m o u n t f u r t h e r m o r e ，t h ea c t u a lp h o t o c h e m i c a le f f i c i e n c yi nt h ed e f i c i e n tl i n e si sl o w e rt h a n t h ec o n t r 0 1 k e y w o r d s ：p g s ；c d s ；r n a i ；n i c o t i a n at a b a c u m ；s o l a n u mt u b e r o s u m l 中国科学院研究生院博士学位论文 缩写词表( a b b r e v i a t i o n s ) r n a i 沉默光合膜磷脂合成酶基因的研究 l l 中国科学院研究生院博士学位论文 i l l 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名：强鹊 例7 年砂月 岔e 有口， 关于学位论文使用授权的说明 本人完全了解中国科学院植物研究所有关保留、使用学位论文的 规定，即：植物研究所有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅 和借阅；学校可以提供目录检索以及公布论文的全部或部分内容，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后遵守此规定) 学位论文作者虢弓戛多桅 1 年硼q 日 中国科学院研究生院博士学位论文 第一章前言 “光合作用是地球上最重要的化学反应”，是绿色植物特有的生理功能，它 利用太阳能合成有机物，储存能量，并且释放出氧气。7 0 年代以后，分别对其 原初光能转化过程、碳素同化作用、光呼吸作用、光合一固氮偶联放氢和环境 因子的影响与调控等开展了比较广泛的研究。光合作用不仅仅是生命科学的重 大基础理论问题，而且与当今人类所面临的粮食、能源、资源和环境等问题密 切相关。要解决这些问题，必须彻底了解并且充分利用绿色植物的光合作用。 关于脂在光合作用中功能的研究很早已经引起了人们的注意( c u l l i se t a 1 ，1 9 7 9 ；b a r b e re ta 1 ，1 9 8 6 ；w e b be ta 1 ，1 9 9 1 ；w i l l i a m s ，1 9 9 4 ) 。在高等植物中，脂 是植物细胞的重要组成部分，可占营养细胞干重的5 1 0 ，并且几乎全部分布 于膜中，称为膜脂，构成了生物膜的脂质双层结构( o h l r o g g ee ta 1 ，1 9 9 5 ) 。类 囊体膜是基本的光合膜系统，也是细胞中主要的质体膜系统，由脂质双层膜和 ( 色素) 蛋白复合体构成，是地球上脂含量最丰富的膜系统( g o u n a r i se t a 1 ，1 9 8 3 ) 。光合作用包括很多过程都是在类囊体膜中进行的，比如光能的吸收、 传递和转化以及a t p 的合成等。 然而，迄今为止，关于光合膜脂结构与功能的关系，以及膜脂与光合膜蛋 白相互作用的机理等问题还有很多方面没有解决。很多原因使得研究工作不能 深入而全面的进行。首先，脂与蛋白不同，脂本身没有催化活性，到目前，还 没有直接的方法对它们的作用进行鉴定。另外，类囊体膜脂是由结构脂( b u l k l i p i do rs t r u c t u r a ll i p i d ) 和功能脂( f u n c t i o n a ll i p i d ) 组成( m u r a t a e ta 1 ，1 9 9 8 ) ， 类囊体膜脂的主要组成部分就是结构脂，结构脂在维持膜的骨架结构和流动性 方面起着重要的作用，功能脂与膜蛋白紧密结合在一起，这些脂中的脂肪酸饱 和程度比较高，可能在维持膜中蛋白的构象( 或者定向) 中发挥重要作用，但 是由于实验手段和实验技术的限制，现在还无法区别结构性脂和功能性脂，难 以确定膜脂的作用是结构效应还是功能效应所致( m u r a t ae ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 长期以来，研究人员通过各种途径对脂的功能进行研究，常用的比如脂的 r h iz 赢光争雕磷日夸戌酶基因研完 提取、脂酶处理、脂肪酸催化加氢、体外重组和免疫学方法等，获得了一些好 的结果。特别是近年来分子生物学技术的飞速发展，筛选出了许多脂缺失突变 体，这就为研究脂在植物体内的功能提供了一个理想的研究体系。 1 膜脂的组成和结构 叶绿体是高等植物进行光合作用的场所，成熟的叶绿体外面包裹着双层膜， 结构f 口国1 - 1 所示，分别命名为内被膜( i n n e rm e m b r a n e ) 和外被膜( o u t e r m e m b r a n e ) ，内部为无定型的凝胶基质( s t r o m a ) ，其中悬浮若类囊体膜。类囊 体膜由垛叠的基粒膜区和非垛叠的间质膜区构成。光合膜具有独特的膜脂组成 o v e b be t 缸。1 9 9 1 ) ，一般动物细胞膜膜脂的主要成分为磷脂，而高等植物光合膜 膜脂主要由糖腊组成，仅含少量的磷脂。 o u t e r 鼍一 e m b ”“。、， 图1 - i 高等植物叶绿体的结构 ( a d s p i e d f r o mp u r v 瞄e ta l l i f e ：t h es c i e e c e o f b i o l o g y , 4 山f a l c o n ) 膜脂在类囊体膜上的组成与植物细胞内其他膜系统上的组成不同。像内质 网膜、质膜和线粒体膜等，磷脂是主要的组成成分，而类囊体膜上主要是糖脂 ( g l y c o l i p i d ) 。高等植物的类囊体膜含有三种糖脂：单半乳糖甘油二酯 ( m o n o g a l a t o s y ld i a c y l g l y c e m l ，m g d g ) 、双半乳糖甘油二酯( d i g m a c t o s y l d i a c y l g l y c e r o l ，d g d o ) 和硫代异鼠李糖甘油二酯( s u l f o q u i n o v o s y ld 沁一酣y c e r o l ， 中国科学院研究生院博士学位论文 s q d g ) 。另外，类囊体膜还含有一种磷脂，叫做磷脂酰甘油( p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l ， p g ) 。这四种膜脂的结构如图1 2 。 蚤黎， 铡 似眠 c h t o c c 麓i r 2 s 睡胼 o 一 纠。c o 寰， h ) c c o 鸭 坳一q 辩 r v - g 粉- c ho ( 氇一卜? 一0 一i 0 的h c 以嫩 p g 图i - 2 类囊体膜中主要极性甘油脂的结构 r 1 ，r 2 ，r 3 表示甘油骨架3 个羟基的位置和连接的基团， r 表示连到甘油$ z 1 和$ z 2 位上的脂肪酸分子 类囊体膜中的膜脂是两性物质，脂类分子中即有亲水基团也有疏水基团。 把这两种不同极性的基团连接在一起的是甘油骨架。所以，可以说类囊体膜脂 都是甘油的衍生物，称为甘油脂( g l y c e r o l i p i d ) 。甘油脂主要由疏水的尾部和 亲水的头部组成，甘油的s i 1 和s n 2 羟基分别与两个脂肪酸结合，形成了甘油 脂的疏水基团；甘油的s t l 3 位羟基通过形成糖苷键或磷酸酯键与亲水的极性头 部相连接。对于高等植物来讲，类囊体膜中主要含有5 种脂肪酸分子，它们是 棕榈酸，油酸，亚油酸，亚麻酸和十六碳三烯酸。在海藻中，除了含有上述常 见的脂肪酸外，还含有长链多不饱和脂肪酸如二十碳五烯酸( e i c o s a p e n t a e n o i c a c i d ，e p a ) 和二十碳六烯酸( d o c o s a h e x e n o i ca c i d ，d h a ) ( h a r w o o d ，1 9 9 8 ) 等。而 蓝藻中脂肪酸的组成随物种不同有很大的变化。某些蓝藻的脂肪酸含有四个双 键，而另一些物种中含有单不饱和脂肪酸( w a d ae ta 1 ，1 9 9 8 ) 。这些特殊的脂肪 酸可能与海藻和蓝藻生境的多样性有关。 3 潍| 一 ；l i j 溉 建 r n a i 沉默光合膜磷脂合成酶基因的研究 在类囊体膜的四种甘油脂中，m g d g 和d g d g 含量分别占5 0 和3 0 ， s q d g 和p g 各占5 1 2 ( m u r a t ae ta 1 ，1 9 9 8 ) 。叶绿体内被膜含有与类囊体膜 相同的四种甘油脂，并且相对含量也与其类似。但是在叶绿体外被膜上，脂的 含量与类囊体膜不同。外被膜中除了含有半乳糖脂和p g 外，还含有磷脂酰胆碱 ( p h o s p h a t i d y l c h o l i n e ，p c ) 和磷脂酰肌醇( p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l ，p i ) 。虽然构成 类囊体膜的甘油脂主要有四种：m g d g ，d g d g ，s q d g 和p g ，但是它们的含 量和电荷性各不相同，m g d g 和d g d g 是不带电荷的中性脂，而s q d g 和p g 在生理条件下为阴离子脂。 2 膜脂的合成 甘油脂分子由甘油、脂肪酸和极性头部基团三部分组成。但是，在植物细 胞中，这三种成分的来源不同。甘油分子骨架来自细胞质中合成的3 磷酸甘油， 脂肪酸来自叶绿体基质，而甘油脂的极性头部基团也是在细胞质中合成的。因 此，甘油脂分子的合成是叶绿体和细胞质共同协调完成的( b r o w s ee ta 1 ，1 9 9 1 ； o h l r o g g ee ta 1 ，1 9 9 5 ) 。 2 1 脂肪酸的合成 植物细胞中脂肪酸在叶绿体基质中合成。植物细胞中脂肪酸合成的酶不是 多酶复合物，而是以单体酶的形式游离于叶绿体基质中( o h l r o g g ee ta 1 ，1 9 9 5 ； j o y a r de ta 1 ，1 9 9 8 ) 。在脂肪酸合成过程中，酰基载体蛋白( a c y lc a r r i e rp r o t e i n ， a c p ) 起酰基载体的作用。叶绿体合成的脂肪酸有两种去路，一是新合成的1 6 ： 0 - a c p 和1 8 ：1 - a c p 直接用于叶绿体内甘油脂的合成，另外一条去路是脂肪酸 转运到叶绿体外，参与了质体外磷脂和三酯酰甘油( t r i a c y l g l y c e r o l ，t a g ) 的合 成。脂肪酸在这两种途径中的比例分配随植物的种类不同而不同。在1 8 ：3 植 物中，绝大多数脂肪酸运送到叶绿体外，而只有一小部分脂肪酸用于叶绿体内 p g 的合成。而在1 6 ：3 植物中，有相当数量的脂肪酸用于叶绿体内糖脂和p g 的合成。如在1 6 ：3 植物拟南芥中，3 8 的新合成的脂肪酸用于叶绿体内甘油脂 的合成( b r o w s ee ta 1 ，1 9 8 6 ) 。 4 中国科学院研究生院博士学位论文 2 2 甘油脂的合成 关于甘油脂的合成，在高等植物体内有两条合成途径，一是存在于叶绿体 被膜中的原核合成途径( p r o k a r y o t i cp a t h w a y ) 或者称为质体合成途径( p l a s t i d i c p a t h w a y ) ；一是发生在内质网上的真核合成途径( e u k a r y o t i cp a t h w a y ) 或者称 为内质网合成途径( e rp a t h w a y ) ( h e i n ze ta 1 ，1 9 8 3 ；b r o w s ee ta 1 ，1 9 8 6 ) ( 图1 3 ) 。 由于质体酰基转移酶对酰基a c p 的底物专性，经原核途径合成的磷脂酸 ( p h o s p h a t i d i ca c i d ，p a ) 在s n 2 位上结合着1 6 ：0 ，并且在s n 一1 位上主要结合 着1 8 ：1 ，这种类型的p a 分子( 1 8 ：1 1 6 ：0 ) 可以用来合成p g 或在p a 磷酸化酶 ( p a p h o s p h o h y d r o l a s e ) 的作用下生产二酯酰甘油( d i a c y l g l y c e r o l ，d a g ) 分子。 具有c 1 8 ：1 c 1 6 ：0 结构的d a g 分子可以继续参与质体中半乳糖脂和硫脂的合 成。在内质网上的酰基转移酶，与质体内的酰基转移酶不同，它以酰基c o a 为 底物，合成的p as n 2 位上富含1 8 碳脂肪酸，而在s r 1 位上结合着1 6 ：0 或1 8 碳脂肪酸。这个途径合成的p a 分子作为叶绿体外其他膜中p c ，p e 和p i 的合成 前体。之所以出现两种合成途径，普遍认为是进化的结果。对于低等植物来讲， 真核合成途径对叶绿体脂的贡献是很小的，像一些绿藻的叶绿体已经完全能够 合成所有的叶绿体脂了( w a l l i se ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 2 3 磷脂的合成 磷脂生物合成途径可分为两种一般性类型：c d p 二酯酰甘油途径和二酯酰 甘油途径，分类的依据是活化的底物是c d p 一二酯酰甘油还是c d p 头部基团。 原核生物中只有c d p 二酯酰甘油途径，而植物、酵母和动物同时使用c d p 二 酯酰甘油途径和二酯酰甘油途径，只是两种途径所占比例不同。酵母可以用 c d p 二酯酰甘油途径合成其所有的磷脂，动物通过二酯酰甘油途径合成它们主 要的磷脂p c 和p e 。植物中磷脂合成的细节还没有研究透彻，很多知识是由其 他生物推断得知的，因为在动物和酵母中存在的很多途径在植物中也存在。 胞嘧啶二酯酰甘油( c d p d a g ) 位于磷脂合成途径的交叉点上，是各种磷 脂合成的共同前体，它由磷脂酸和c i p 经胞嘧啶二酯酰甘油合成酶( c d s ) 催 化合成，这个酶在叶绿体、线粒体和微粒体中都有分布。由c d p 二酯酰甘油 r n a i 沉默光合膜磷脂合成酶基因的研究 衍生来的磷脂包括磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇和磷脂酰丝氨酸； 二酯酰甘油途径主要用于植物和动物中磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱的合成。 e 嘣) 1 j 管婚cr e | i c u l u m i ：a 蓦l _ 夏”一：刍唯一：一1 ：磊：i ： t i b - l m - - 坠- ! 坚、n ( 仁多孓h夕：炎。 e j。及 薹墨t 呦 啪 ：2 。氛2 jji p 一 l。， 偿 l 枷：，p k 兰：一 。下；t 了t - ft “” - - 6 6j 一妇 j- -。翱俄 ：竹。踟细 孽。i -可t - i -t 廓嘲 i厂_ _r；r ? 缸删 m 图1 - 3 高等植物拟南芥中甘油脂的合成途径( b r o w s ee ta 1 ，1 9 9 1 ) 箭头的宽度表示反应的流量；= 表示突变体中酶的缺失； 小写斜体字母表示各种突变体：x 表示1 8 ：3 植物中合成途径的中断位点 磷脂酰甘油( p g ) 作为一种磷脂，与s q d g 类似，是一种阴离子脂，广泛 分布在动物、植物和微生物的各种膜系统中，而且在原核生物和真核生物中的 合成途径是一样的( d o w h a n ，1 9 9 7 ；m o o r e ，1 9 8 2 ；s h i b u y a ，1 9 9 2 ) 。在植物中，p g 是组成类囊体膜的唯一磷) 指( m a r e c h a le ta 1 ，1 9 9 7 ) ，高等植物中8 5 的p g 分布 在叶绿体中( b r o w s ee ta 1 ，1 9 8 6 ) ，而且叶绿体中的p g 都是原核结构脂，即叶 绿体中的p g 全部是在叶绿体内( 内被膜) 合成的。 在叶绿体中，p a 是d a g 和p g 合成的共同前体( 图1 4 ) 。关于p g 的详 细合成过程如下：i 初始前体3 一磷酸甘油通过3 一磷酸甘油酰基转移酶的作用 生成溶血磷脂酸( 1 y s o p h o s p h a t i d i ca c i d ，l p a ) ；i i 溶血磷脂酸通过溶血磷脂酸 酰基转移酶继续发生酰基化；i i i 上述两步酰基化作用产生的磷脂酸( p a ) ，通 6 中国科学院研究生院博士学位论文 过c d p d a g 合成酶转移到c d p d a g ( 胞嘧啶一二酯酰甘油) 上；i v 再通过 p g p 合成酶( e c 2 7 8 5 ) 形成p g p ；vp g 合成的最后一步是p g p 去磷酸化， 这个过程由p g p 磷酸化酶( p h o s p h a t i d y l g l y c e r o p h o s p h a t ep h o s p h a t a s e ) ( e c 3 1 3 2 7 ) 催化( j o y a r de ta 1 ，1 9 9 8 ) 。合成的p g 可以作为双磷脂酰甘油的合成前 体，双磷脂酰甘油在真核生物中，只分布在线粒体内膜上( b l i g n ye ta 1 ，1 9 8 0 ) 。 实验证明，p g 合成酶( p h o s p h a t i d y l g l y c e r o ls y n t h a s e ) 的活性与线粒体内膜、 内质嘲以及叶绿体有关( m o o r e ，1 9 7 4 ；a n d r e w se ta 1 ，1 9 8 5 ；g r i e b a ue ta 1 ，1 9 9 4 ) 。 a 。1 榔t pp a 景| = ：童， p 一”j | a 斜tp - e 磁p c d p d a g 嚣。= - j 习聋 c 嘲 一“_ 土 蚓1 铆t p - g r 谚 p g p p l 一j 罩 枷1 撕t p 觚p g 雕嚣? 二 e 触p 。一0 j 把1 1广a o 一 触7 t p 弋孙一p ，a 聊c lo p 岱一p oc l 图1 - - 4p g ( 磷脂酰甘油) 和c l ( 双磷脂酰甘油) 的合成过程( e l e n ae ta 1 ，2 0 0 3 ) 1 c d p d a g 合成酶；2 p g p 合成酶；3 p g p 磷酸化酶；4 c l 合成酶 不同生物中p g p s ( p h o s p h a t i d y l g l y c e r o p h o s p h a t es y n t h a s e ) 分布不同。在 酵母细胞中，p g p s 位于线粒体内膜上，为双磷脂酰甘油的合成提供底物p g ( 磷 脂酰甘油) ( c h a n g e ta 1 ，1 9 9 8 ；k u c h l e re ta 1 ，1 9 8 6 ；m i n s k o f fe ta l ，1 9 9 7 ) 。在植物 细胞中p g 的合成发生在不同的亚细胞结构中( m o o r ee ta 1 ，1 9 8 2 ) ，除了真核 生物共有的保守性线粒体途径外，还可以通过一个位于内被膜上的质体途径进 行合成，叶片中的p g 主要来源于后一个途径( a n d r e w se ta 1 ，1 9 8 5 ) 。另外，植 物和动物的内质网上也具有合成p g 所必须的酶( m o o r ee ta 1 ，1 9 7 4 ) 。不过， 对于动物来讲，线粒体途径在p g 合成中的作用更显著。 7 r n a i 沉默光合膜磷脂合成酶基因的研究 2 4 脂肪酸的去饱和作用 脂肪酸合成是在高等植物叶绿体的基质中完成的( o h l r o g g ee ta 1 ，1 9 9 5 ) 。 乙酰c o a 经过一系列的酶促反应最终在成质体内形成两种主要的酰基c o a 形 式：1 6 ：0 a c p 和1 8 ：0 a c p ，参与真核途径甘油脂的合成，或者转化为1 6 ：0 c o a 和1 8 ：1 c o a 运输到内质网中，参与真核途径甘油脂的合成。叶绿体或者内质网 上的1 6 ：0 和1 8 ：1 酰基基团首先参与甘油脂的形成，它们通过相应的去饱和酶 作用，在甘油脂的水平上进行脂肪酸的去饱和反应，最终形成了饱和程度不同的 各种脂分子。 由于去饱和酶都是与膜结合在一起的，用传统的生化分析方法难以研究 ( m i q u e le ta 1 ，1 9 9 8 ；w a l l i se ta 1 ，2 0 0 2 ) ，所以人们用分子生物学手段，在拟南芥中 找到了7 种与脂肪酸去饱和作用有关的拟南芥突变体，并确定了各种去饱和酶的 基因( f a t t ya c i dd e s a t u r a s e ，厨d ) ( 图1 - 3 ) ，加深了对脂合成过程中脂肪酸去饱和过 程的认识( w a l l i se ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 3 膜脂的功能 一般生物膜具有脂双层结构，这个双层结构由多种不同的脂类组成，每种脂 都具有各自的生化特征，比如渗透性，流动性等。不同细胞以及同一细胞的不同区 域分布着不同的脂或者脂的混合物，这个特点说明，脂不仅是膜的结构成分， 可能在功能上也有特异的作用。 3 1 传统方法对膜脂功能的研究 有关膜脂与色素蛋白复合物相互作用的研究，以前主要是分析色素蛋白复 合物的生化特征，即提取光合膜蛋白复合物，分析所含脂的种类及含量，试图 解释这些脂的作用。通过研究，发现类囊体膜中4 种主要的色素蛋白复合物中 都有脂的存在。 菠菜p s i i 复合物( p s i ic o m p l e x ) 、p s i i 核心复合物( p s i ic o r ec o m p l e x ) 以及 p s i i 反应中心复合物( p s i ir e a c t i o nc e n t e rc o m p l e x ) 中脂的分布有异质性( m u r a t a e ta 1 ，1 9 9 0 ) 。p s i i 复合物中含有类囊体膜中的所有4 种脂；s q d g 仅存在于p s i i 8 中国科学院研究生院博士学位论文 复合物中，不存在于p s i i 核心复合物和p s i i 反应中心复合物中；p s i i 反应中 心复合物中仅存在m g d g 。l h c i i 是p s i i 的捕光天线，主要分布于类囊体膜的 垛叠区，它通过三聚体形式行使功能，而在l h c i i 聚集化的过程中，都有 m g d g ，d g d g 和p g 的参与。s i m i d j i e v 等人( 2 0 0 0 ) 发现，当把m g d g 与提纯 的l h c i i 以一定比例混合时，m g d g 形成了双层脂相，而不再形成六角型相。 n u s s b e r g e r 等人( 1 9 9 3 ) 指出，豌豆l h c i i 晶体中含有d g d g 和p g ，其中p g 直 接参与了l h c i i 三聚体的形成。m a a n n i 等人( 1 9 9 8 ) 在p g 缺失的莱茵衣藻突变 体中发现l h c i i 不能形成三聚体结构，并且类囊体膜不能形成垛叠结构。 l e e ( 2 0 0 0 ) 总结了前人的文献，认为m g d g ，d g d g 和p g 在l h c i i 聚集过程 中有不同的作用。p g 结合于l h c i i 蛋白的表面，直接参与了三聚体的形成， 并起着稳固三聚体的作用；而d g d g 结合在三聚体的外围，使三聚体形成二维 晶体状片层；最后，m g d g 推动了片层结构的垛叠形成了类囊体膜基粒。 有关p s i 复合物中脂的研究比较少。m a k e w i z 等人( 1 9 9 5 ) 发现烟草的p s i 复合物中含有m g d g 和p g ，而且p g 与p s i 的结合更加紧密。最近，人们已 经解析了蓝藻p s i2 5 a 分辨率的晶体结构，发现p s i 中结合着1 分子m g d g 和3 分子p g ( j o r d a n e ta 1 2 0 0 1 ) 。 菠菜和盐藻( d u n a l i e l l as a l i n a ) 的c f 0 c f l 结合着硫脂( p i c ke ta 1 ，1 9 8 5 ) ， 用磷脂、其它的糖脂对提纯的c f o c f l 进行处理后，s q d g 并不会被这些甘油 脂取代；当用去垢剂处理后，c f o c f l 中还存在着s q d g 。不难推断，至少一 部分s q d g 是与c f o c f l 专一性并且紧密结合在一起的。当用去垢剂去除 1 0 3 0 的结合s q d g 后，c f o c f l 的活性受到抑锘l j ( b a r b e re ta 1 ，1 9 8 6 ) 。h a a s 等 ( 1 9 9 3 ) 用抗体研究表明，半乳糖脂、p g 与s q d g 的抗血清与c f o c f l 复合物的 a 、b 亚单位专一性反应，说明c f o - c f l 复合物中结合着半乳糖脂、p g 与s q d g 。 由于这些糖脂中富含不饱和脂肪酸，认为这些脂分子的构像影响了c f o c f l 亚 9 r n a i 沉默光合膜磷脂合成酶基因的研究 基的相互作用，从而可以调节c f o c f l 的催化活性。 关于c y t b 6 f 中脂的组成，存在不同的观点。d o y l ea n dy u ( 1 9 8 5 ) 发现在纯化 的c y t b 6 f 中仅存在着磷脂，而不含有糖脂和硫脂：而h u r t 和h a u s k a ( 1 9 8 1 ) 发现 m g d g 存在于c y t b 6 f 中；毛大璋等( 1 9 9 8 ) 从菠菜中分离出了缺失膜脂的c y t b 6 f 复合体，并且利用体外重组实验发现半乳糖脂和p c 能有效促进其电子传递活 性( y a he ta 1 ，2 0 0 0 ) 。对于c y t b 6 f 复合物中结合着不同膜脂的原因可能是提取过 程中去垢剂处理强度和时间的不同造成的。 3 2 突变体中膜脂功能的研究 对脂功能的研究，传统方法是在体外进行的，实验方法和结果分析受样品 以及处理方式等因素的影响，很难准确判断脂在植物活体内的功能。近年来， 人们利用分子生物学手段获得了许多脂缺失突变体，极大地促进了脂研究的进 展。利用突变体研究脂功能，具有一个最大优点：可以通过某种脂的缺失来判 定其在体内的作用。到目前为止，人们已经在拟南芥，蓝藻，衣藻等模式植物 中找到了许多脂突变体( h a g i oe ta 1 ，2 0 0 0 ；s a t oe ta 1 ，2 0 0 0 b ；g o m b o se ta 1 ，2 0 0 2 ； s a t oe ta 1 ，1 9 9 5 a ，1 9 9 5 b ，m i n o d ae ta 1 ，2 0 0 2 1s a t oe ta 1 ，2 0 0 3 ) ，这为了解脂的功能 提供了一个很好的研究体系。 3 2 1 糖脂功能研究 m g d l 是编码m g d g 的基因，通过分子生物学方法获得了拟南芥m g d j 突 变体。突变体中m g d g 合成酶活性与野生型相比下降了7 5 ，m g d i 突变体中 m g d g 含量下降了4 2 ，而突变体中叶绿素含量下降了一半并且叶绿体的超 微结构受到了显著影响，如类囊体膜的发育严重缺陷。表明突变体中部分 m g d g 缺失对植株生长和叶绿体生物合成有显著影响，m g d g 对叶绿体的功 能和发育具有很重要的作用( j a r v i se ta l 。，2 0 0 0 ) 。 拟南芥d g d l 突变体中，d g d g 含量与野生型叶片d g d g 含量相比下降了 1 0 中国科学院研究生院博士学位论文 9 0 ，而且突变体生长严重受阻，叶绿体的超微结构发生了改变( d 6 r m a n ne t a 1 ，1 9 9 5 ) 。虽然突变体中p s i i 与p s i 活性比例显著下降，但是突变体的光合放 氧活性并没有受到明显影响( h i i n e