（有机化学专业论文）类肽与金属蛋白活性中心的设计与模拟.pdf

中文摘要 中文摘要 蛋白分子是生命的主要物质基础。各种类型的分子间相互作用在蛋白分子 结构和功能上具有重要意义。因此，对非共价相互作用的研究在认识生命过程 和设计功能分子等方面具有重要含义。 阳离子- p i 相互作用是近年来新发现且受到广泛关注的新型非共价相互作用 力。在离子通道、神经细胞受体、金属蛋白和氧化还原酶分子活性中心的结构 和功能中起着重要作用。以芳香氨基酸为识别单元的离子受体和金属活性蛋白 中心设计是探索该类作用力的重要性手段之一。 我们以多胺多羧酸配体e d t a ，d t p a 作为二价的模板骨架，合成了含酪氨 酸和组氨酸的开链结构的受体分子e h y 、d h y ，利用圆二色光谱、荧光光谱、 核磁共振技术和质谱等分析手段，间接检测到了溶液中金属离子与咪唑环和酚 环之间的非共价相互作用。研究发现，这两个受体对多种具有重要生物学和环 境保护意义的金属离子有着很好的选择性识别作用。 同时，我们仍以e d t a 、d t p a 作为二价模板框架，合成含有葸环的开链结 构的分子e a 2 和d a 2 。研究表明，他们能够选择性地有效识别某些过渡金属离 子。 关键词：芳香氨基酸类肽非共价相互作用荧光光谱圆二色谱核磁共振质 谱离子识别 a b s t r a c t p r o t e i ni st h em a j o rb u i l d i n gb l o c kf o r b i o m o l e c u l e s m a n yt y p e so fn o n c o v a l e n t i n t e r a c t i o n sh a v eb e e nf o u n dt op l a yi m p o r t a n tr o l e si nt h i sf i e l d t h er e s e a r c ho n n o n c o v a l e n ti n t e r a c t i o n si st h o u g h tt ob ev e r yi m p o r t a n tt ot h eu n d e r s t a n d i n go fl i f e p r o c e s s e sa n dt h ed e s i g no ff u n c t i o n a ls u p e r m o l e c u l e s c a t i o n - p ii n t e r a c t i o n sa r en o v e ln o n c o v a l e n ti n t e r a c t i v ef o r c e sw h i c hh a v e r e c e n t l ya t t r a c t e dw i d ea t t e n t i o nf o rt h e i rv i t a lr o l e si nr e g u l a t i n gt h es t r u c t u r ea n d f u n c t i o no fn u m e r o u si m p o r t a n tb i o m o l e c u l e si n c l u d i n gi o nc h a n n e lp r o t e i n s ，c e l l s u r f a c e r e c e p t o r s ，m e t a l l o p r o t e i n sa n de n z y m e s d e s i g na n ds t u d yo fa r t i f i c i a l r e c e p t o r sa n dm o d e lp r o t e i nm e t a l - b i n d i n gs i t e si sap o w e r f u la p p r o a c ht oe l u c i d a t i n g s u c hw e a km o l e c u l a rr e c o g n i t i o ne l e m e n t s o u rw o r ki st o i n v e s t i g a t et h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nm e t a li o n sa n dr e c e p t o r s ( e h y a n d d m o ，w h i c ha r ep r e p a r e d b yu s i n g a v a i l a b l em u l t i d e n t a t e a m i n o c a r b o x y l a t e ，e d t aa n dd t p a ，r e s p e c t i v e l y , a sd i v a l e n t t e m p l a t e f o r p r e s e n t i n gp e p t i d y lh i si m i d a z o l ea n dt y rp h e n 0 1 ac o m b i n e dc d ，e s i - m s ，n m r a n df l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p i cs t u d yr e v e a l st h er o l e so fm e t a li o n i m i d a z o l ea n d p h e n o li n t e r a c t i o n s w ef i n dt h a tt h e ya r ee x c e l l e n tm e t a l l o r e c e p t o rm o d e l sw i t hh i g h s e n s i t i v i t ya n dr e m a r k a b l es e l e c t i v i t yf o rb i o l o g i c a l l yo re n v i r o n m e n t a l l yi m p o r t a n t m e t a li o n si nw a t e r a n o t h e rp a r to fo u rw o r ki st o s y n t h e s i z ee a 2a n dd a 2w h i c hc o n t a i n a n t h r a n c e n e t h ee d t aa n dd t p aa r eu s e dh e r ea sb a c k b o n e s t h e yc a n r e c o g n i z e s o m em e t a li o n sw i t h h i g hs e n s i t i v i t ya n dr e m a r k a b l es e l e c t i v i t y k e y w o r d s ：a r o m a t i ca m i n o a c i d ，p s e u d o p e p t i d e ，n o n c o v a l e n ti n t e r a c t i o n s ， f l u o r e s c e n c es p e c t r a ，c ds p e c t r a ，n m r ，e s i m s ，m o l e c u l a r r e c o g n i z a t i o n 符号说明 c d d c m d m f d m s o d t p a e d l a e s i m s e t 2 0 m e m e c n m e o h t e a h i s ( h ) t y r ( t r p ( w ) a 符号说明 圆二色光谱 二氯甲烷 甲酰二甲胺 二甲亚砜 二乙基三胺五乙酸 乙二胺四乙酸 电喷雾质谱 乙醚 甲基 乙腈 甲醇 三乙胺 组氨酸 酪氨酸 色氨酸 2 氨基葸 v i 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名： 年月日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名：学位论文作者签名： 解密时间：年月日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名： 年月日 第一章前言 第一章前言 第一节化学及生物体系中的分子识别 1 1 1重要的分子识别过程 底物与受体的选择性键合称为分子识别，它可能是一个具有专一性功能的 过程。对应于生物学中底物与受体的概念，我们把分子识别过程中相互作用的 化学物质广义地称为底物及受体，较小的分子称为底物，较大的分子称为受体。 识别过程很可能引起体系的电学、光学性质及构象的变化，也可能引起体系化 学性质的改变。这些变化意味着化学信息的存储、传递及处理。因此，分子识 别在信息处理及传递、分子及超分子器件的制备过程中起着重要作用。分子识 别的目标是研究分子间专一性的相互作用，这在化学及生命过程中起着非常重 要的作用。分子识别的研究已经成为化学、生命科学、材料科学和信息学等众 多学科中的前沿热点研究课题。图1 1 是分子识别的一般模型。 图1 1 分子识别的一般模型 以下是几类重要的分子识别过程n 1 ： 1 球形分子识别： 球形底物的分子识别是最简单的分子识别过程。碱金属、碱土金属、稀土 金属等阳离子及卤素等阴离子都是常用的球形底物。对于这类底物，具有球形 空腔的受体比平面大环有更高的识别能力。冠醚、穴状配体、球状配体等都能 同相应的球形底物形成稳定的络合物 2 】。图1 2 是典型的球形分子识别。 第一章前言 图1 2 典型的球形分子识别 这类识别虽然简单，但在化学、材料科学、信息学及生命科学中有重要意 义，与分子及超分子器件的研制、分离纯化过程、分析化学过程、神经细胞的 电感应过程、金属离子跨细胞膜运输等有密切的关系。 2 多重识别及线性识别过程口1 ： 一个受体能同时识别两个或更多个底物或同时识别一个底物上的两个或多 个功能基团的过程称多重识别过程。它同协同效应、变构、调控以及信号传输 等过程有着密切的联系。 线性识别的受体分子的两端应分别具有成键的亚单元，它们分别同底物的 相应功能基团键合。底物功能基团间的距离应同受体两个亚单元间的距离相匹 配。这就是受体识别底物分子长度过程的距离互补。 许多生物分子如双羧酸化合物、双胺肽、氨基酸、多胺等都可以作为线性 识别的底物。对这类识别过程动力学特征的研究有重要意义。 3 四面体识别过程： 四面体底物的选择性键合要求受体分子具有四面体的识别位点。多氮杂环 类受体对阳离子的识别经常采用这种方式。生命过程中，某些酶同底物的识别 也属于四面体类型的识别过程。图1 3 是典型的四面体分子识别。 图1 3 典型的四面体分子识别 2 1 夕 国艺 镬 第一章前言 4 有机合成中的分子识别： 在分子识别指导下的有机分子设计、合成和自组装，是二十一世纪有机化 学发展的重要方向【4 1 ，在反应试剂与底物的识别研究的基础上发展的对映选择性 不对称合成已取得重大进展【5 】，建立在高度控制分子间相互作用基础上的自组织 及自组装有机合成化学已经取得了长足的进步。 自组织和自组装合成是指分子通过氢键、范德华力、静电相互作用、给体 及受体效应等自发构筑成三维结构，并形成具有确定功能的超分子体系。分子 晶体、液晶、胶束、l b 膜、二维薄膜、三维骨架都可以通过这种方式来合成。 5 生命体系中的分子识别过程： 生命过程中的各种分子识别过程，如酶与底物、激素与受体、抗原与抗体 的识别等都是各种生物功能的分子机制及调控原理的重要基础。原核和真核细 胞的基因表达非常精确地被蛋白质控制。调节蛋白质对一定的d n a 区域的专一 性识别过程是这种调控作用的重要基础。在乳糖操纵子中，乳糖操纵子阻遏蛋 白能够选择性地识别并结合到操纵基因的2 0 个碱基对区域，并防止r n a 聚合 酶结合到启动基因上，从而调控基因的表达。 催化抗体研究领域的诞生，为化学工业开辟了一条绿色革命的新途径。催 化抗体是用识别办法选择反应物及过渡态，并在专一性结合中进行反应，使过 程的活化能降低、选择性提高，能催化某些常规的催化剂难以实现的反应，已 成为当前热门的研究领域。 分子印记技术是在催化抗体概念启发下发展的新技术 6 】，已成功用与d l 对 映体分离。它相当于半抗原的模板分子与特定的小分子或生物大分子以非共价 键结合。多重非共价相互作用的协同效应使之固定化。然后用溶剂洗去模板分 子得到专一性空穴，这些空穴可识别某些分子达到分离的目的【7 j 。 6 无机超分子建筑： 无机超分子建筑起着越来越重要的作用。生命过程中涉及数十种金属离子， 它们的配位作用影响到离子通道的开关、基因调控等重要的生命过程。在分子 筛内组装某些金属络合物使具有酶的催化功能，是一种酶的模拟物，称 z e o z y m e1 8 1 。 金属离子在自组装过程中起模板的作用。在程序化的超分子体系中，金属 离子读出储存于配体中的信息，根据配位几何组装结构【9 】。金属离子以三种主要 的途径参加反应过程：一是通过结合反应底物为反应定向，二是通过可逆地改 3 第一章前言 变金属离子的氧化态调节氧化还原反应，三是通过静电以稳定和屏蔽负电荷。 不管是哪种反应过程，都存在着显著的非共价相互作用。这些弱相互作用的影 响是深远的，甚至可以对酶或其他蛋白起到结构调控的作用。 膜蛋白的研究更是联系到很多受体和离子通道的功能，这些蛋白在维持人 体的正常生理过程以及药物治疗中都有着重要的意义。从金属酶的催化到蛋白 中的协同效应以及构效关系，从各种金属离子通道的工作机理到基于c a 2 + 第二 信使的生物膜信号传递，生命体系中许多重大问题都与此类金属离子参与的超 分子体系的构建过程有关。 1 1 2 受体设计应遵循的一般原则 受体是一种能够识别和选择性结合某种配体的大分子物质，包括与配体结 合和产生效应的两个区域，受体与配体结合后，构象的改变导致生物学活性的 产生。设计合成各种受体不仅在底物一受体识别方面能够提供很多关键的信息， 而且随着探针在医学和环境分析等方面【lo 】越来越广泛的应用而越发显出其重要 性。在过去几十年里，人们在主体客体化学和超分子化学领域取得了显著的成 绩 1 ，推动了合理设计各种受体的长足进步。 近来受体设计方面的发展强调的是化学工程结构意义和作用基团，例如： 官能团的补足和新的离子载体作为选择性的络合单位【1 2 k 设计多种类型的受体 使之适合于过渡金属离子及其他阳离子、阴离子、中性的无机、有机及生物分 子等各种类型的底物，需遵循一些基本原则【l j ： 为了达到较高的识别效果，受体与底物应有大的接触面积，受体应具有包 容底物的空腔以能产生较多的非共价相互作用，并与底物很好的互补。根据这 个原则设计的各种受体包括各种大环及大环化合物【1 3 1 ，如冠醚类化合物、穴状 配体、开链配体及球状配体等。这些受体都具有能同底物匹配的空腔，并有不 同数目的连接段、枝权等使其具有某些动力学特性，具有合适的键位置及功能 基团。 受体设计必须遵循柔性与刚性的平衡，它关系到受体及受体同底物识别过 程中的动力学特性。受体结构的稳定性需要刚性的分子结构，但是识别过程中 的变换、调控、协同及变构过程需要一定的柔性，特别是对于生物体系，受体 的柔性是非常重要的。因此受体设计应兼顾受体的动态及静态性质。 4 第一章前言 第二节非共价相互作用 1 2 1常见的非共价相互作用 化学键是指分子或晶体中相邻的两个或多个原子( 离子) 之间的强烈相互 作用，其主要类型有离子键、共价键( 包括配位键) 和金属键等：与化学键不 同，非共价作用力是指分子内或分子间的原子之间的吸引。 在非共价作用力中，o h o 和n h o 等较强的氢键是人们研究和使 用最广泛的分子间作用力，然而许多较弱的作用力包括c h o 氢键【l 1 7 1 、c h 氢键【1 8 】、兀堆积作用1 蛆1 1 、静电作用、范德华力和疏水作用广泛存 在于核酸和蛋白质等多种生命化合物中。 非共价作用力属于弱作用力，众所周知共价键能量一般为4 0 0k j m o l ，而非 共价作用力的强度比共价键要低一两个数量级，一般为4 4 0k j m o l 。这种弱相 互作用力很难单独形成稳定的复合物。但若分子在空间的位置取得某种构象， 使较多的弱相互作用力和较多的结合点相协调，则可以在分子间形成较强的结 合力或选择性，这将会起到决定生物大分子构象的作用。因此，非共价相互作 用是生物高层次结构的主要作用力，非共价作用力对生物体系意义重大。 各种非共价相互作用结合能的大小也有差别，在不同级别生物结构中的地 位也有不同。结合能较大的氢键，在较低的结构级别( 如蛋白质的二级结构) 、 较小的尺度间，把氢受体基团与氢供体基团结合起来。结合能较小的范德华力 则主要在更高的结构级别、较大的尺度间，把分子的局部结构或不同分子结合 起来。 最近新发现的一种非共价作用力是发生在阳离子与富电子体系之间的相互 作用阳离子- p i 相互作用，是数年前加州理工学院的d o u g h e r t y 所提出【2 引。现 在，生物分子上的芳香环( 如色氨酸的支链残基) 对阳离子( 包括季胺盐离子， 金属离子等) 的识别，已经被认为是很多神经细胞表面受体识别阳离子的分子 科学基础。 5 第一章前言 。 图1 4k + 与苯环的相互作用示意图晗3 1 1 2 2 四种富电子的芳香氨基酸 生命体系中大量的蛋白质分子均由2 0 种天然氨基酸组成。这些氨基酸根据 各自带有的不同的有机基团，可分为极性与非极性的；在中性介质中带正电和 带负电的；疏水的和亲水的；带芳香基的和不带芳香基的。自然界里组成蛋白 的结构单元是2 0 种天然氨基酸以及基于这2 0 种天然氨基酸而后修饰的一系列 非天然氨基酸。其中除脯氨酸及其衍生物外，这些氨基酸在结构上的共同点是 与羧基相连的碳原子上都有一个氨基，因此称为q 氨基酸。连接在q 碳上的还 有一个氢原子和一个可变的侧链，称为r 基团，各种氨基酸的区别就在于r 基 团的不同，这也是天然蛋白的种类和功能多样性的根本原因。在这2 0 种的氨基 酸的侧链具有芳香性的并不多，只有4 种，它们是苯环( b e n z e n e ) 、酚环( p h e n 0 1 ) 、 吲哚环( i n d o l e ) 和咪唑环( i m i d a z o l e ) ，分别为苯丙氨酸( p h e ，f ) 、酪氨酸( t y r , y ) 、色氨酸( t r p ，w ) 以及组氨酸( h i s ，h ) 的侧链。其中咪唑是很强0 d o n o r ， 而其余三种为很强的兀d o n o r 。计算表明电子提供能力大小顺序为：吲哚环 酚环 苯环。图1 5 是4 种侧链具有芳香性的氨基酸。 6 第一章前言 o 0 一c h c o h 一c h _ 一洲 式 让么 p h e ，ft y r , yt r p ，wh i s ，h 图1 5 天然氨基酸中带芳香性的氨基酸 三个带苯环的氨基酸有紫外吸收，f - 2 5 7a m ，e = 2 0 0 ；y ：2 7 5a m ，s = 1 4 0 0 ； w ：2 8 0a m ，e = 5 6 0 0 。通常蛋白质的紫外吸收主要是后两个氨基酸决定的。相关 蛋白质由于含有这些氨基酸所以也有紫外吸收的能力，一般最大吸收在2 8 0n l t l 波长处，因此能利用这点来测定样品中蛋白的含量。芳香氨基酸在紫外区呈现 比较弱的荧光，近来还证明了色氨酸呈现磷光( 一种寿命较长的发射光) 。这些 荧光和磷光性质在研究蛋白质、多肽以及仿肽的结构和动力学中有着特别的重 要作用。 第三节生命体系中的金属离子 1 3 - 1金属蛋白中常见金属离子介绍 在酶催化中广泛地存在着阳离子与芳香体系的相互作用。几乎三分之一的 酶催化活性需要金属离子。 根据金属离子一蛋白质相互作用强度，可将需要金属离子的酶分为两类： ( 1 ) 金属酶，含紧密结合的金属离子，多数属于过渡金属离子，如f e 2 + f e ”、 c u + c u 2 + 、z n 2 + 、m n 2 + 和c 0 2 + 等，这种金属离子通常以配位键的形式，与氨基酸 残基的侧链基团相连，有时也与酶蛋白中的辅基如血红素的卟啉环相连。金属 酶中的金属离子作为酶的辅助因子在酶促反应中传递电子、原子或官能团。 ( 2 ) 金属激活酶金属激酶中的金属离子与酶的结合一般比较松散，在溶液中， 酶与这类离子结合而被激活，这类金属离子主要是指碱金属离子和碱土金属离 子，如n a + 、k - 、m 9 2 + 和c a 2 + 等。 7 o i c l 一： h h 、 cic上， ，) 第一章前言 表1 1 金属酶中的金属离子与配体 金属离子配体酶或蛋白 m n 2 +咪唑丙酮酸脱氢酶 f e 2 + f e 针 卟啉环、咪唑、含硫配体血红素氧化还原酶、过氧化氢酶 c u + c u 2 + 咪唑、酰胺 细胞色素氧化酶 c 0 2 +卟啉环变位酶 z n 2 + 一+ n h 3 ，咪唑，( - r s ) 2 碳酸酐酶，醇脱氢酶 p b 2 +- - s h 6 一氨基一丫一酮戊二酸脱水酶 n i 2 +一s h 脲酶 金属离子以三种主要的途径参加反应过程，一是通过结合反应底物为反应 定向；二是通过可逆地改变金属离子的氧化态调节氧化还原反应；三是通过静 电稳定和屏蔽负电荷。但无论是哪种类型，都存在着显著的阳离子与芳香体系 的相互作用。这种弱相互作用的影响是深远的，甚至可以对酶或其它蛋白起到 结构调控的作用。 1 3 2 金属蛋白中金属离子的作用 金属元素在整个生命体系中起着重要的作用，已知有2 5 种金属元素为生命 体所必需。金属离子与核酸、蛋白质等生物大分子的作用可以对神经系统产生 不正常的影响，也可以直接或间接地损伤d n a 从而引起细胞的变异；同样金属 配合物又可以用于治疗和诊断疾病。这无疑引起了众多化学家、生物学家和医 学家的广泛兴趣。正因为如此，世界各国投入大量人力、物力来研究金属在生 命过程、医学甚至环境中的作用。2 0 0 1 年美国n i h 特别设立一个“金属在医学 中的应用”的大课题。其宗旨是鼓励无机化学家和分子生物学家的密切合作， 也弥补在这方面的投资不足。而欧共体更是联合欧洲的科学家在1 9 9 6 年即开始 这一类综合性课题的研究，例如金属在医学中的应用、镧系元素用于医疗诊断 和治疗、金属化合物用于治疗癌症和病毒感染、金属酶和生物模拟等等。这方 面的研究成果已集中在生物无机化学杂志上登载。 为金属离子选择合理配基是自然界中常见的现象。自然界中最为常见的是 选择复合的氮和硫作为配体或者辅基，比如铜蓝蛋白【2 4 ，2 5 1 、铁和钴的腈基水解 8 第一章前言 酶【2 6 ，2 7 1 、胞啶脱氨酶2 8 ，2 9 1 、碳酸酐酶3 0 1 、溶酶体【3 l 】、维生素、乙醇脱氢酶 3 2 ，3 3 1 、 多肽变形酶 3 4 - 3 8 】。研究它的活性中心的结构，就是含有金属离子的氮和硫的配 合物。其中金属离子可以是铁、锌、铜、镍等。 金属蛋白中金属离子起到的作用主要包括下面几个方面： ( 1 ) l e w i s 酸作用：金属离子通过吸电子的诱导效应使金属蛋白部分显正 电性，使羟基或者水分子易于亲核进攻底物，例如在大多数的水解酶体系中。 ( 2 ) 桥联作用：通过配体与金属离子的作用，使金属蛋白的整体分子结构 更加利于发生生理生化反应。如羧肽酶中的锌离子就起到这个作用。 ( 3 ) 结构固定作用：金属离子使金属蛋白的结构固定，以便于某一特定结 构底物附着在相应的位点。 ( 4 ) 电子传递作用：这主要体现在氧化还原酶体系中。 ( 5 ) 模板作用：利用自身的结构特征使配体和受体的空间构型发生变化， 达到预期的目的。 第四节论文选题 生物分子中的芳香环对阳离子的非共价识别阳离子p i 体系非共价作用 力是近年来新发现并受到广泛关注的新型非共价作用力。该类普遍程度类似于 氢键的作用力在离子通道、神经细胞受体、金属蛋白和氧化还原酶分子活性中 心区域的结构和功能中起着重要调节作用，而且在分子组装、药物设计和生物 活性分子设计等方面，都是不可忽视的重要因素。以芳香氨基酸为识别单元的生 物受体和生物分子模型的设计，是深层次认识这种非共价弱作用力之重要性的 有效手段。 我们的工作以e d t a 和d t p a 为模板，利用组氨酸以及酪氨酸为核心识别 单元，设计合成了新型的开链式结构的受体：e h y 、d h y ( 具体结构见图1 6 ) ， 利用圆二色光谱、荧光光谱、核磁共振技术以及电喷雾离子化质谱等检测手段， 对其与金属离子在水溶液中的非共价作用识别进行了系统的研究，深入地探索 了在水溶液仿生体系中芳香氨基酸与金属离子的协同识别作用。 9 第一章前言 婶：x o 铅x ：u c 图1 6e h y 和d h y 的结构式( 左为e h y ，右为d h y ) 另外，我们同样以e d t a 和d t p a 为模板，利用简单方法合成了含有稠环 的开链式受体：e a 2 和d a 2 ( 具体结构见图1 7 ) ，主要采用荧光光谱和电喷雾离 子化质谱这两种检测手段，对e a 2 和d a 2 与金属离子在水溶液中的非共价作用 作了初步的研究。 n r “o h 电 图1 7 受体e a 2 和d a z 的结构式( 左为e a 2 ，右为d a 2 ) 1 0 。j 州八v认c 冬协凡 第二章含酪氨酸残基和组氨酸残基的生物受体的阳离子识别研究 第二章含酪氨酸残基和组氨酸残基的生物受体的阳离子 识别研究 第一节引言 2 1 1一种重要的富电子的芳香氨基酸组氨酸 组氨酸是碱性伐氨基酸之一，但碱性较弱，在生理条件下是否带电与周围 内环境有关。各种蛋白质中都含有l 组氨酸，l 组氨酸是存在肌肉中的一种肌 肽成分。碱性物质可与酸反应产生盐，由p a u l i 反应即和重氮苯磺酸反应产生红 色。组氨酸对人体来说不一定是必需氨基酸，但对鼠和其它动物是必需氨基酸。 我们已经知道，在生物体内的主要代谢途径有通过组氨酸脱氨酶进行脱氨，通 过脱羧酶形成组胺以及氨基转移反应。生物合成是从a t p 的腺嘌呤部分和磷酸 核糖丝磷酸形成咪唑甘油磷酸，进行氨基转换反应。 组氨酸的咪唑环显示出很强的配位能力，咪唑环是很强的0 - d o n o r ，在金属 蛋白中通常可以作为最为重要的配位点。它在活性中心常起传递电荷的作用。 组氨酸能与铁等金属离子配位，比如在血红蛋白中和铁卟啉发生作用。 2 1 2 模型化合物的结构式 图2 1 化合物e h y 和d h y 的结构式( 左为e h y ，右为d h y ) 第二章含酪氨酸残基和组氨酸残基的生物受体的阳离子识别研究 2 1 3 模型化合物中可能存在的相互作用 1 氢键x h y 由于与电负性大的x 原子形成共价键的h 原子有剩余作用力，可与另一个 电负性大的y 原子发生以静电相互作用为主的有方向性和饱和性的较强作用力。 其键能介于一般共价键和范德华力之间0 , 2 】。氢键x h y 中的x 和y 通常是 电负性较大、半径较小的原子，如f 、o 、n 等。后来发现c 、c l 、b r 、i 、p 、s 等在某些特殊的环境中也能参与形成氢键【3 a 】。氢键在分子识别、组装和分子晶 体工程中占有非常重要的基础地位【5 】。由于氢键的方向性和选择性，近年来普遍 用来构筑超分子体系。氢键的方向性是指它有可能预知分子亚单元之间的排列 方式，而选择性是指在具有多重氢键相互作用体系中可以通过挑选精确互补的 分子亚单元来对氢键驱动过程进行控制，得到期望结构的聚集体。单个氢键的 相互作用力相对较弱( 1 0k j m 0 1 ) ，但多个氢键的强度可达到5 0k 1 m o l 或更高【6 j 。 氢键对生物体系有重大意义，特别是在稳定生物大分子的二级结构中起主 导作用。 2 疏水作用 在水溶液或极性溶液中，疏水作用会导致非极性分子趋向于聚集在一起。 疏水作用是一种方向性很差的弱相互作用力，当两个疏水分子相互接近时，可 造成体系的熵增加，促进了疏水区的稳定性。 疏水相互作用比范德华力强得多。例如，一个苯丙氨酸侧链由水相转入疏 水相时，体系的能量降低约4 0 k j m o l 。 生物分子有许多结构部分具有疏水性质，如蛋白质的疏水氨基酸侧链，核 酸的碱基，脂肪酸的烃链等。它们之间的疏水相互作用，在稳定蛋白质、核酸 的高层次结构和形成生物膜中发挥着主导作用。 3 c h 7 【作用 c h - ，r 作用是一种发生在c h 基团( 软酸) 和7 c 体系( 软碱) 之间的弱的氢 键作用，具有通常氢键的一般特征【7 1 。它作为一种弱的分子间相互作用，不但影 响有机化合物的构象、不对称光学性质、立体选择反应、手性识别及超分子体 1 2 第二章含酪氨酸残基和组氨酸残基的生物受体的阳离子识别研究 系的固态结构，而且在控制固态有机分子的晶体堆积、生物体系中蛋白质和d n a 的结构和性质方面起着积极的作用嗍。 4 兀- 兀作用 兀兀作用是一种发生在兀体系和7 c 体系之间由于电荷分布不均匀引起的静电 引力及诱导偶极作用力。由于它在生物学、化学、物理学和材料科学中的广泛 存在并扮演着重要角色，因而得到了广泛的研究9 舶】。芳香环之间兀兀堆积作用 的强度在1 - 5 0k j m o l 的范围内，且多数在1 0k j m o l 左右和以下。 5 阳离子- 兀作用 阳离子兀作用是一种发生在简单阳离子或复杂阳离子与芳香环兀体系之间 的强烈吸引作用1 7 1 。其本质归属于氢键作用18 1 。 阳离子- 兀相互作用及其在生物分子结构中的作用得到了科学家的关注和研 究 1 9 。2 1 】。在蛋白质中，阳离子兀作用可以发生在赖氨酸( l y s ) 、精氨酸( a r g ) 或组氨酸( h i s ) 的带正电荷的侧链和苯丙氨酸( p h e ) 、酪氨酸( t y r ) 或色氨酸 f e 2 + c 0 2 + m n 2 + - 一c d 2 + 一n i 2 + z n 2 + p h 4 6 0 时 c u 2 + f e 2 + c 0 2 + c d 2 + z n 2 + m n 2 + n i 2 + 对d h y 而言，c u 2 + 、v e 2 + 、c 0 2 + 、n i 2 + 、m n 2 + 、z n 2 + 、c d 2 + 最大荧光淬灭效 率分别： p h 7 0 0 时 c u 2 + f e 2 + c 0 2 + n i 2 + m n 2 + z n 2 + c d 2 + p h 4 6 0 时c u 2 + f e 2 + c 0 2 + n i 2 + m n 2 + z n 2 + c d 2 + 得到上面的序列，并不符合螯合作用中的i r v i n g w i l l i a m s 序列 ( z n 2 + n i 2 + c 0 2 + f e 2 + m n 2 + m 9 2 + c a 2 + ) 。说明在这之间起作用的不仅为 e d t a 或者d t p a 的骨架，氨基酸中的酚环、咪唑环同样起到对于金属离子具有 选择性识别作用。 第三节e h y 、d h y 与金属离子作用的e s i - m s 研究 2 3 1 实验条件和方法 取l m l l 1 0 - 3m 的受体分子e h y 水溶液于1 5 m l 塑料离心管中，分别加入 1 1 o “l 的o 1 m c a c l 2 、c d c l 2 、c o c l 2 、c u c l 2 、m n c l 2 、n i c l 2 和z n c l 2 溶液，振 荡使混合均匀。 取l m l l 1 0 _ 3 m 的受体分子d h y 水溶液于1 5 m l 塑料离心管中，分别加入 i i o p l 的0 i m c a c l 2 、c d c l 2 、c o c h 、c u c l 2 、m n c l 2 、n i c l 2 和z n c l 2 溶液，振 荡使混合均匀。 以上所得溶液直接用于e s i m s 分析。 2 3 2 结果和讨论 a ) e h y 与金属离子络合物的质谱分析： e h y 中分别加入c a c l 2 、c d c l 2 、c o c h 、c u c l 2 、m n c l 2 、n i c l 2 、z n c l 2 ， 在+ _ e s i m s 谱图中，均发现金属离子与e h y 形成l ：1 的络合物的分子离子峰。 c a 2 + _ e h y ：c 2 7 h 3 6 n 6 0 1 lc a , c a l c df o re x a c tm a s s ，6 6 0 21 ； 第二章含酪氦酸残基和组氨酸残基的生物受体的阳离子识别研究 ( e s l + m s ) ：f o u n d ，6 5 9 4 e h y + c a 2 + i - r ； ( e s i m s ) ：f o u n d , 716 1 e h y + c a 2 + + c i 一2 h + 】 c d 2 + _ e h y ：c 2 7 h 3 6 n 6 0 l l c d ，c a l c df o re x a c tm a s s ，7 3 4 15 ； ( e s i + m s ) ：f o u n d ，7 5 5 5 7 e h y + c d 2 + + s a + 2 i - i + ； ( e s i m s ) ：f o u n d ，7 3 2 0 1 e h y + c d 2 + 3 旷】，7 6 6 5 2 e h y + c d 2 + + c 1 。2 矿】 c 0 2 + - e h y ：c 2 7 h 3 6 n 6 0 l l c o ，c a l c df o re x a c tm a s s ，6 7 9 18 ； ( e s f m s ) ：f o u n d ，6 7 8 5 4 e h y + c 0 2 + - h + ； ( e s i m s ) ：f o u n d ，6 7 6 7 2 e h y + c 0 2 + - 3 h + 1 c a 2 + _ e h y ：c 2 7 h 3 6 n 6 0 l l c u ，c a l c df o re x a c tm a s s ，6 8 3 1 7 ； ( e s l + m s ) ：f o u n d ，6 8 3 21 e h y + c u 2 + - h + ； ( e s i 。m s ) ：f o u n d ，6 8 0 4 2 圆尉r 斗c i 产勺劬，7 1 6 2 9 e h y + c u 2 + + c 1 。2 h + 1 m n 2 + _ e h y ：c 2 7 h 3 6 y 6 0 llm n ，c a l c df o re x a c tm a s s ，6 7 5 18 ； ( e s i + 一m s ) ：f o u n d ，6 7 4 5 4 e h y + m n 2 + - h + ； ( e s i 。m s ) ：f o u n d ，6 7 2 91 e h y + m n 2 + - 3 i - 1 + n i 2 + - e h y ：c 2 7 h 3 6 n 6 0 l l n i ，c a l c df o re x a c tm a s s ，6 7 8 18 ； ( e s f m s ) ：f o u n d ，6 7 7 7 5 e h y + n i 2 + - h + ； ( e s i - m s ) ：f o u n d ，6 7 5 6 9 e h y + n i 2 + - 3 i - r ，7 1 3 4 1 e h y + n i 2 + + c 1 。2 i - 1 + 1 z n 2 + _ e h y ：c 2 7 h 3 6 n 6 0 l l z n ，c a l c df o re x a c tm a s s ，6 8 4 17 ； ( e s i + m s ) ：f o u n d ，6 8 4 0 7 e h y + z n 2 + - h + ； ( e s i 。m s ) ：f o u n d ，7 1 9 。1 7 e h y + z n 2 + + c 1 2 矿】 b ) d h y 与金属离子络合物的质谱分析： d h y 中分别加入c a c l 2 、c d c l 2 、c o c l 2 、c u e l 2 、m n c l 2 、n i c l 2 、z n c l 2 ， 在+ e s i m s 谱图中，发现了c d + 与d h y 形成1 ：1 的络合物的分子离子峰；在 e s i m s 谱图中，发现了m _ n 2 + 与d h y 形成l ：l 的络合物的分子离子峰：在 第二章含酪氨酸残基和组氨酸残基的生物受体的阳离子识别研究 e s i m s 谱图中，发现c a 2 + 、c 0 2 + 、c u 2 + 、n i 2 + 、z n 2 + 与d h y 形成1 ：1 的络合 物的分子离子峰。 c a 2 + _ d h y ：c 3 l h 4 3 n 7 0 1 3 c a ，c a l c df o re x a c tm a s s ，7 61 2 5 ； ( e s i + m s ) ：f o u n d ，7 6 0 4 d h y + c a 2 + - i - r ； ( e s i m s ) ：f o u n d ，7 2 0 5 d h y - h + 1 c d 2 + _ d h y ：c 3 1 h 4 3 n 7 0 1 3 c d ，c a l c df o re x a c tm a s s ，8 3 5 2 0 ； ( e s i + 一m s ) ：f o u n d ，8 3 4 4 0 d h y + c d 2 + 呐 c 0 2 + d h y ：c 3l h 4 3 n 7 0 1 3 c o ，c a l c df o re x a c tm a s s ，7 8 0 2 3 ； ( e s i + m s ) ：f o u n d ，7 7 9 4 6 d h y + c 0 2 + - h + ； ( e s i 。一m s ) ：o u n d ，7 7 7 3 3 d h y + c 0 2 + - 3 h + 】 c u 2 + d h y ：c 3 l i - 1 4 3 n 7 0 1 3 c u ，c a l c df o re x a c tm a s s ，7 8 4 2 2 ； ( e s f m s ) ：f o u n d ，7 8 3 3 0 d h y + c u 2 + - h + ； ( e s i 。m s ) ：f o u n d ，7 81 2 4 d h y + ( 妒- 3 i - i + m n 2 + _ d h y ：c 3 l i - 1 4 3 n 7 0 1 3 m n ，c a l c df o re x a c tm a s s ，7 7 6 2 3 ； ( e s i 。m s ) ：f o u n d ，7 7 3 4 2 d h y + m n 2 + - 3 h + 1 n i 2 + - d h y ：c 3 l i - l , 3 n 7 0 1 3 n i ，c a l c df o re x a c tm a s s ，7 7 9 2 3 ； ( e s f m s ) ：f o u n d ，7 7 8 3 9 d h y + n i 2 + - h + ； ( e s i m s ) ：f o u n d ，7 7 6 5 8 d h y + n i 2 + - 3 r 】 z n 2 + d h y ：c 3 l i - l , 3 n 7 0 1 3 z n ，c a l c df o re x a c tm a s s ，7 8 5 2 2 ； ( e s f m s ) ：f o u n d , 7 8 4 4 5 d h y + z n 2 + - 一】； ( e s i - - m s ) ：f o u n d ，7 8 2 37 d h y + z n 2 + 一3 矿】 根据以上分析，我们可以得出结论：e h y 与d h y 可以与金属离子形成l ： 1 的稳定的络合物。 第二章含酪氨酸残基和组氨酸残基的生物受体的阳离子识别研究 第四节e h y 、d h y 的核磁共振研究 核磁共振和1 3 c - n m r 已经发展