（微生物学专业论文）鲤亚目几种名优鱼的随机扩增多态性dna分析.pdf

鲤亚目几种名优鱼的随机扩增多态性d n a 分析 专业：微生物遗传 研究生：刘会明指导教师：徐恒教授 摘要 本论文对八种名优鱼( 胭脂鱼科的胭脂鱼，鲤科鳃亚科的中华倒刺鳃和 光侄悚0 鳃，裂腹鱼亚科的齐口裂腹鱼，雅罗鱼亚科的丁鱼岁，鲤亚科的三角 鲤、岩原鲤和杂交岩原鲤) 进行了随机扩增多态性d n a ( r a p d ) 分析，根据 遗传相似率和遗传距离，重建了八种鱼之间的亲缘关系，将岩原鲤和杂交岩 原鲤进行了区分，并初步筛选了七种名优鱼的r a p d 分子标记。 实验首先比较了四种不同的鱼类基因组d n a 提取方法( 组织基因组 d n a 抽提试剂盒法，血液基因组d n a 抽提试剂盒法，组织基因组d n a 的 手工提取法和血液基因组d n a 的手工提取法) ，确定了血液基因组d n a 的 手工提取法为鱼类基因组d n a 提取的最佳方法，并采用此方法制备了本实 验所需的八种鱼的基因组d n a 。接着根据r a p d 特点对r a p d p c r 条件进 行了优化，确定了本实验最佳的反应条件( m 9 2 + 浓度l 5 m m o l l ，模板量为 3 0 n g 。退火温度3 6 1 2 ) 。在最佳反应条件下，采用o p a 、o p c 和o p m 三组 共6 0 条1 0 碱基随机引物对八种鱼基因组d n a 进行r a p d p c r 反应，分析 了实验结果，筛选了3 5 条引物作重复实验。对重复实验的3 5 条引物的扩增 条带进行了统计，包括单个引物扩增的总条带数，单个引物单种鱼( 即一个 泳道) 扩增的条带数，单种鱼扩增总带数，单个引物任两种鱼相同的带数以 及扩增条带大小等几个方面内容。根据统计结果，计算了八种鱼之间的遗传 相似率( s = 2 n a b n a + n b ) 和遗传距离( d = i s ) 。以遗传距离d 值，采用p h y l i p 3 5 c 版本软件包中的n e i g h b o r 程序进行u p g m a 聚类分析，重建了八种鱼 之间的亲缘关系，得到了与传统分类一致的结果，并且将杂交岩原鲤与纯种 岩原鲤区分开来。实验还初步筛选了七种名优鱼的r a p d 分子标汜，探讨了 用r a p d 技术来鉴定名优鱼应用的可行性。 关键词；鲤亚鼙随枧扩增多态性d n a 聚类分析分子标记 r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n aa n a l y s i sf o r s e v e r a lc y p r i n o i d e if i s h e s m a j o f ：m i c r o b i o l o g y s t u d e n t ：l i uh u i r u i n gt u t o r ：x uh e n g a b s t r a c t i nt h i sa r t i c l ew ea p p l i e dt h er a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a t e c h n i q u et oa n a l y s ee i g h tc y p r i n o i d e if i s h e si n c l u d e dm y x o c y p r i n u sa s i a t i c u s , s p i n i b a r b u ss i n e n s i s , s p i n i b a r b u sc a m w e i t 4s c h i z o t h o r a xp r e n a n t i , 1 i n c at i n c a ， m e s o c y p r i n u sm u l t i t a e n i a t a , p r o c y p r i sr a b a u d ia n dah y b r i d ( p r o c y p r i sr a b a u d i ) a t l a s t ，w e r e c o n s t r u c t e d e i g h tc y p f i n o i d e if i s h e s g e n e t i cr e l a t i o n s h i p ， d i s t i n g u i s h e dt h eh y b r i df r o mt h ep u r eb r e e d ( p r o c y p r i sr a b a u d i ) ，a n ds e l e c t e d t h er a p dm o l e c u l a rm a r k e r so ft h es e v e nc y p r i n o i d e if i s h e s i nt h ee x p e r i m e n t sw ec o m p a mf o u rd i f f e r e n tf i s hg e n o m i cd n ae x t r a c t i o n m e t h o d si n c l u d e dg e n o m i cb l o o dd n a p u r i f i c a t i o nk i t ，g e n o m i ct i s s u ed n a p u r i f i c a t i o nk i t ，t h em a n u a li s o l a t i o no fg e n o m i cb l o o dd n a a n dt h em a n u a l i s o l a t i o no fg e n o m i ct i s s u ed n a a tl a s t ，w ec o n d u d c dt h a tt h em a n u a li s o l a t i o n o fg e n o m i cb l o o dd n ai st h eb e s tm e t h o dt og e tt h ef i s hg e n o m i cd n a , a n dw e u s et h i sm e t h o dt og e tt h ee i g h tc y p d n o i d e if i s h e s g e n o m i cd n a a c c o r d i n gt o r a p d st r a i t s ，t h ee x p e r i m e n t a lp a r a m e t e r sw e r eo p t i m i z e d ，a n dt h eo p t i m a l e x p e r i m e n tc o n d i t i o n sw e r ea s c e r t a i n e d ( 1 5 m m 0 1 lm 9 2 + ，3 0 n gt e m p l a t e ，a n n e a l a t3 6 c ) u n d e rt h eo p t i m a le x p e r i m e n tc o n d i t i o n s ，t o t a l6 0r a n d o ml m m e r o l i g o n u c l e o t i d ep r i m e r so fo p a 、o p ca n do p mg r o u p sw e r ea p p l i e dt ot h e 3 r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a a n a l y s i so fe i g h tc y p r i n o i d e if i s h e s a f t e r w es t u d i e dt h er a p d sr e s u l t s ，3 5p r i m e r sw e r es e l e c t e dt oa m p l i f yr e p e a t e d l y w eg o tt h es t a t i s t i cr e s u l t so ft h er a p d sp r o d u c t so ft h e3 5p r i m e r si n c l u d e d t o t a la m p l i f i e db a n d so fs i n g l ep r i m e r , t o t a la m p l i f i e db a n d so fs i n g l ef i s h ，e ta 1 a m p l i f i e db a n d so f3 5p r i m e r sw e r e s e l e c t e dt oc a l c u l a t e s i m i l a r i t yi n d e x ( s = 2 n a b n a + n b ) a n dg e n e t i cd i s t a n c e s ( d = i - s ) a c c o r d i n gt og e n e t i c d i s t a n c e s ( d ) ，c l u s t e ra n a l y s i sb a s e do nt h er a p dr e s u l t sw a sp e r f o r m e db y u p g m am e t h o da n dt h eg e n e t i cr e l a t i o n s h i po ft h ee i g l l tc y p r i n o i d e if i s h e sw a s r e c o n s t r u c t e d t h er e s u l tw a si ng o o da g r e e m e n tw i t ht h er e s u l to ft h et r a d i t i o n a l a n a l y s i sa n dd i s t i n g u i s h e dt h eh y b r i d ( p r o c y p r i sr a b a u d i ) f r o mt h ep u r eb r e e d ( p r o c y p r i sr a b a u d i ) t h ee x p e r i m e n ta l s os e l e c t e dt h er a p d m o l e c u l a rm a r k e r s o ft h es e v e nc y p r i n o i d e if i s h e sa n dd i s c u s s e dt h ef e a s i b i l i t yo fu s i n gr a p d m a r k e rt oi d e n t i f vt h ef i s h e s k e yw o r d s ：c y p r i n o i d e i 、r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i c d n a 、 c l u s t e ra n a l y s i s 、m o l e c u l a rm a r k e r 4 鲤亚目几种名优鱼的随机扩增多态性d n a 分析 引言 保护生物多样性，就是保护人类自己，人类不能脱离多种多样的生物而 孤立地存在。2 0 世纪9 0 年代以来，生物多样性的保护一直成为人们研究的 热点之一，并得到各国的重视，先后有4 0 多个国家加入了生物多样性公 约。鱼类多样性是生物多样性的重要组成部分，其多样性的保护对人类社 会的可持续发展具有重要意义。近年来，由于鱼类栖息环境生态的破坏、污 染和过度的捕捞利用等原因，我国的鱼类资源正受到前所未有的威胁，保护 鱼类多样性，使渔业可持续发展造福社会，是迫在眉睫的大事t 。“。 盲目地向自然界索取鱼类资源，造成鱼类资源多样性受到严重的威胁。 过度开发利用、人工繁殖的群体向自然水体逃逸或不适当的投放、亲近交配 以及杂交鱼管理不善等，都是造成鱼类多样性丧失的重要原因。比如在2 0 世纪7 0 8 0 年代，我国杂交鲤一代利用曾风靡一时，先后有6 个杂交组合 在生产上广泛应用过，虽然创造了一定的经济价值，但大量的杂交鲤进入了 天然水体，给我国野鲤种质资源带来了无法弥补的混乱和损害。 由于天然水体中鱼类资源的急剧减少，人工养殖成为解决人们不断增长 的需求的一条有效途径。随着社会经济的发展，人们的需求也从单一常规鱼 类开始多元化，这就导致名特优新鱼类养殖的迅猛发展。在养殖品种中，名 特优新鱼类多数是近期人工驯养的野生鱼类，是重要的鱼类种质资源，其中 有一部分还是国家保护动物，因而是非常值得关注和保护的。发展人工养殖 可以从数量上解决物种灭绝的危险，但过度开发利用、亲近交配以及杂交育 种等因素，都可能造成鱼类资源多样性的丧失，再加上多数名优鱼研究较少， 遗传背景不是很清楚，就更加剧了这种趋势。因此，保护名优鱼种质资源首 先应对各种名优鱼类进行准确的分析鉴定，但仅靠传统的分类鉴别方法就不 太准确。因而，在传统鱼类分类学的基础上，采用新的技术对名优鱼进行快 速、准确的分析鉴定，对于保护鱼类种质资源，保持水产业的可持续发展具 有重要的现实意义。 r a p d ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ) d , i j 随机扩增多态性d n a 技 术，是由美国科学家w i l t i a m s i 3 j 和w e l s h ( 1 9 9 0 ) 1 4 】在聚合酶链式反应 ( p o l y i n e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 技术的基础上发展起来，它是一种用于检 测基因组d n a 多态性和基因组遗传标记的方法。它是以一个通常为1 0 碱基 的寡核苷酸序列为引物，对基因组d n a 随机扩增来鉴别多态性d n a 的过程。 r a p d 标记简便易行，目前已被广泛应用于系统发育研究、动植物种类鉴定、 基因图谱构建、种群的遗传分析、人类基因组研究等领域【5 8 j 。 我们采用r a p d 技术对七种鲤亚目的名优鱼( 胭脂鱼、中华倒刺鱼巴、 光倒刺鱼巴、齐口裂腹鱼、丁鱼岁、三角鲤、岩原鲤讦口一种杂交岩原鲤进行 了分析，重建了八种鱼之间的亲缘关系，得到了与传统分类一致的结果，将 杂交岩原鲤与纯种岩原鲤区分开来实验还初步筛选了七种名优鱼的r a p d 分子标记，探讨了用r a p d 技术来鉴定名优鱼应用的可行性。 第一章八种名优鱼的r a p d 扩增 l 材料与方法 1 1 实验材料 研究的名优鱼种类分别为：胭脂鱼科的胭脂鱼( m y x o c y p r i n u sa s i a t i c u s ) ： 鲤科亩巴亚科的中华倒刺鳃( s p i n i b a r b u ss i n e n s i s ) 和光倒刺啬巴( s p i n i b a r b u s c a l d w e l l i ) ；裂腹鱼亚科的齐口裂腹鱼( s c h i z o t h o r a x p r e n a n t i ) ，俗称雅鱼：雅 罗鱼亚科的丁鱼岁( 1 i n c at i n c a ) ；鲤亚科的三角鲤( m e s o c y p r i n u s m u l t i t a e n i a t a ) 、岩原鲤( p r o c y p r & r a b a u d i ) 和杂交岩原鲤。这些材料均由成都 通威水产科技有限公司提供。 1 2 主要药品与试剂 1 0 碱基r a p d 随机引物共3 套6 0 条( a 、c 和m 组) 购自o p e m n 公司( 序 列见表1 ) ；t a qd n a 聚合酶、d n t p 、m a r k e r 等购自博瑞克公司；组织基因 组d n a 抽提试剂盒、血液基因组d n a 抽提试剂盒购自上海华舜生物工程公 司i 其余相关药品和试剂均为国产。 表1r a p d 引物序列 编号编号序列 o p a 0 1c a g g c c c t t co p a 0 2t g c c g a g c t g o p a 0 3a g t c a g c c a co p ：a 0 4a a t c g g g c t g o p a 0 5 a g g g g t c r r go p a 0 6g g t c c c t g a c o p a 0 7g a a a c g g g t go p a 0 8g t g a c g t a g g q p a 0 9 g g ( n aa c g c co p a l o g t g a t c g c a g 0 p a “c a a t c g c c g t0 1 a 1 2t c g g c g a t a g o p a l 3c a g c a c c c a c o p a l 4 t c t g t g c t g g 0 p a l 5t t c c g a a c c co 队1 6a g c c a g c g a a o p a l 7g a c c g c t t g t o p a l 8a g g t g a c c g t 0 p a l 9c 从a c g t c g g0 p a 2 0g t t g c g a r c c 7 o p c 0 1t r c g a g c c a go p c 0 2g t g a g g c g t c o p c 0 3g g g g g t c t l to p c 0 4c c g c a t c t a c o p c 0 5g a r g a c c g c co p c 0 6g a a c g g a c t c o p c 0 7g t c c c g a c g a o p c 0 8t g g a c c g g t g o p c 0 9c t c a c c g t c c o p c i ot g t c t g g g t g o p c i la a a g c t g c g go p c i 2 t g t c a t c c c c o p c i 3a a g c c t c g t co p c i 4t g c g t g c t t g o p c i 50 a c g g a r c a g o p c i 6c a c a c t c c a g o p c i 7t t c c c c c c a g o p c i 8t g a g t g g g t g 0 p c i 9 g t t g c c a g c co p c 2 0a c t t c g c c a c o p m 0 1 g t t g g t g g c t o p m 0 2a c a a c g c c t c o p m 0 3g g g g g a t g a g o p m 0 4 g g c g g t r g t c o p m 0 5g g g a a c g t g t o p m 0 6c t g g g c a a c t o p m 0 7c c g t g a c r c a o p m 0 8t c t g t t c c c c o p m 0 9 g t c r r g c g g a o p m l ot c t g g c g c a c o p m l l g t c c a c t g t g o p m l 2g g g a c g t t g g o p m l 3g g t g g t c a a g o p m l 4 a g g g t c g t r c o p m l 5 g a c c t a c c a c o p m l 66 黜c c a g c c o p m l 7t c a g t c c g g g o p m l 8c a c c a ：r c c g t o p m l 9 c c t t c a g g c a o p m 2 0a g g t c 丌g g g 1 3 主要实验仪器 p c r 仪为t h e r m o h y b a i d 产品( h b p x 2 2 0 ) ，水平电泳系统、凝胶成像系 统f g e ld o c k 2 0 0 0 ) 、微量移液器和紫外检测仪( s m a n s p e d 刑3 0 0 0 ) 为b i o r a d 公司产品；其余相关仪器均为国产。 1 4 鱼基因组总d n a 提取方法的比较研究 1 4 1 使用组织基因组d n a 抽提试剂盒提取组织基因组d n a 1 具体步骤： ( 1 ) 组织( 包括肌肉、鳍和肝脏) 在1 5m l 离心管中用组织捣碎棒将组织彻 底捣碎。加入4 0 0 ld l 液，振荡悬浮后，置6 5 * ( 2 温浴使小块组织 消失( 1 5 分钟以上) ， 期间来回颠倒离心管数次。再加入2 0 0 , u l d t 液，2 0 p l r n a s e a 和2 5 l l p r o t e i n a s ek ，迅速温和地来回颠倒离，i i , 管 彻底混匀。置6 5 。c 温浴1 5 3 0 分钟，期间来回颠倒离心管数次。离心 3 分钟，将上清移至另外一个离心管中。 ( 2 ) 加入2 0 0 l 异丙醇，剧烈颠倒离，t l , 管使溶液混匀后，移取6 0 0 z l 至 吸附柱中，离心3 0 秒。弃去收集管中的液体。将吸附柱放入同一个 收集管中。将剩余的全部移至吸附柱中，离心3 0 秒。弃去收集管中 的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。 ( 3 ) 加入5 0 0 t l w l 液，静置1 分钟后，离心3 0 秒。 ( 4 ) 将吸附柱移入另外一个干净的收集管中。加入5 0 0 t lw l 液，离心 1 5 秒。 ( 5 ) 弃掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中。离一i , 1 分钟。 ( 6 ) 将吸附柱移入一个干净的1 5m l 离心管中。在吸附膜中央加入1 0 0 l t 1 液，6 5 静置5 分钟后，离一1 1 , 1 分钟。将离心管( d n a ) 2 0 c 保 存。 1 4 2 使用血液基因组d n a 抽提试剂盒提取血液基因组d n a i l o 具体步骤：按每个全血样品( 1 m ! 起始量) 使用1 2 m l4 xb p 液的比例 将4 xb p 液移入一个合适的容器中，再加入3 倍体积预冷的双蒸水配制1 x b p 液。混匀。置于冰上。 ( 1 ) 在5m l 离心管中加入1m l 含抗凝剂的新鲜全血，再加入3m l 预冷 的1 xb p 液，来回颠倒离心管以彻底混匀。冰浴1 0 分钟后，4 5 0 0 9 离心2 分钟。将上层液体彻底吸出，在离心管中加入1m l 预冷的i x b p 液。彻底混匀后，4 5 0 0 9 离心2 分钟，将上层液体彻底吸出。此 时沉淀应为无色，淡红色，否则用0 5m l 预冷的i xb p 液再洗涤一 次。 ( 2 ) 在自细胞沉淀中加入2 0 0 , t l d t 液，彻底振荡悬浮。 ( 3 ) 加入4 0 0 a ld l 液和2 5i t lp m t e i n a s ek ，迅速温和地来回颠倒离心 管彻底混匀。置6 5 c 温浴1 5 3 0 分钟，期间来回颠倒离，i i , 管数次。 ( 4 ) j h ) - 4 0 0 l 异丙醇，剧烈颠倒离一i i , 管使溶液混匀后，移取6 0 吮l 至 吸附柱中离心3 0 秒。弃去收集管中的液体，将吸附柱放入同一个 收集管中。将剩余的全部移至吸附柱中，离心3 0 秒。弃去收集管中 的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。 ( 5 ) 加入5 0 0 l w l 液，静置1 分钟后，离心3 0 秒。 ( 6 ) 将吸附柱移入另外一个干净的收集管中。加入5 0 0 p l w l 液，离一i i , 1 5 秒。 ( 7 )弃掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中。离心1 分 钟。 ( 8 ) 将吸附柱移入一个干净的1 5m l 离心管中。在吸附膜中央加入1 0 0 p l t l 液，6 5 静置5 分钟后，离心1 分钟。将1 5 m l 离心管( d n a ) 2 0 保存。 1 4 3 组织基因组d n a 的手工提取胁1 2 1 包括试剂：t e 缓冲液( 1 0 m m o l l t r i s h c i ，p h 8 o ；1m m o l le d t a ， p h 8 o ) 、裂解液( o 5 s d s + l m o l ln a c i ) 、2 0 m g m l 蛋白酶k 、1 0 m g m l r n a s e 、饱和酚、酚氯仿异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) 、氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) 、7 0 乙醇、无水乙醇。 具体步骤： ( 1 ) 组织( 肌肉、鳍和肝脏) 在液氮中研磨至细小颗粒，称取1 0 0 m g 转入 1 5 m l 离心管中。 ( 2 )向离一t l , 管中加入4 0 0 雎l 的裂解液和1 0 pl 2 0 m g m l 蛋白酶k ，混匀 于5 5 温育3 h 。 ( 3 ) 用等体积的饱和酚抽提裂解，颠倒使之充分混匀。于1 2 0 0 0 r p m 离心 1 0 r a i n ，回收上清液( 水相) 转入另一新管中。 ( 4 ) 加入等体积酚，氯仿异戊醇抽提上清液，颠倒使混匀。于1 2 0 0 0 r p m 离 心1 0 m i n ，上清液( 水相) 转入另一新管中。 ( 5 ) n a 等体积氯仿异戊醇抽提上清液，颠倒使混匀。于1 2 0 0 0 r p m 离心 1 0 m i n ，上清液( 水相) 转入另一新管中。 ( 6 ) 在上清中加入r n a s e ，室温反应1 h 。 ( 7 ) j 1 , x n 倍体积的无水乙醇，混匀后一2 0 。c 放置l h ，于1 2 0 0 0 r p m 离心 1 5 m i n ，去上清。 ( 8 ) 用7 0 7 醇洗涤两次，室温干燥，加入1 0 0ul 的t e 缓冲液5 54 c 温育2 0 m i n ，一2 0 保存。 1 4 4 血液基因组d n a 的手工提取1 2 i 根据鱼红细胞含细胞核的特点，在组织基因组d n a 手工提取方法的基 础上加以改进。包括试剂：t e 缓冲液( 1 0 m m o l l t r i s h c i ，p h 8 0 ：1m m o l l e d t a ，p h 8 0 ) 、裂解液( 0 5 s d s + 1 m o l ln a c l ) 、2 0 m g m l 蛋白酶k 、 饱和酚，酚氯仿，异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) 、氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) 、7 0 乙醇、 无水乙醇、0 3 5 n a c i 淡水鱼生理盐水。 具体步骤： ( 1 ) 取3 0 0 ul 实验鱼血，加入l m l 的0 3 5 n a c i 淡水鱼生理盐水，混匀， 离心去上清。沉淀中加入去离子水，混匀，低渗处理1 5 r a i n ，离心去上 清，获白色沉淀f 细胞核1 。 ( 2 ) 向离心管中加入4 0 0 “l 的裂解液和1 0 ul 2 0 m g m l 蛋白酶k ，混匀于 5 5 温育3 h 。 ( 3 ) 用等体积的饱和酚抽提裂解，颠倒使之充分混匀。于1 2 0 0 0 r p m 离心 1 0 m i n ，回收上清液( 水相) 转入另一新管中。 ( 4 ) 加入等体积酚氯仿异戊醇抽提上清液，颠倒使混匀。于1 2 0 0 0 r p m 离 心1 0 m i n ，上清液( 水相) 转入另一新管中。 ( 5 1 加入等体积氯仿异戊醇抽提上清液，颠倒使混匀。于1 2 0 0 0 r p m 离心 1 0 r a i n ，上清液( 水相) 转入另一新管中。 ( 6 ) 加入两倍体积的无水乙醇，混匀后一2 0 ( 2 放置1 h ，于1 2 0 0 0 r p m 离心 1 5 r a i n ，去上清。 ( 7 ) 用7 0 l 醇洗涤两次，室温干燥，加入1 0 0 ul 的t e 缓冲液，5 5 。c 温 育2 0 m i n ，2 0 保存。 1 5 基因组d l g a 的质量分析 1 5 1 电泳分析 所提样品总d n a 在0 7 的琼脂糖凝胶电泳分离( 0 5 x t b e ，3 v c m 恒 压) ，溴化乙锭染色，在凝胶成像系统( g e ld o ct m 2 0 0 0 ，b i o r a d ) 照相、观 察，判别d n a 分子的纯度、大小及一致性。 1 5 2 紫外检测 样品总d n a 稀释5 0 倍后在紫外检测仪上进行分析，主要分析其浓度和 纯度( a 2 6 0 a 2 8 0 ) 。 1 6 r a p d 的p c r 扩增 1 6 1r a id 扩增条件的优化 参照p c r 实验指南f 1 4 j 和多篇有关r a p d 的研究论文【1 5 - z s l ，分析了r a p d 实验的特点，确定了从m 9 2 + 浓度和模板浓度这两个主要影响因素进行优化。 本实验设定的反应体系为2 5 “l 。 m 9 2 + 浓度 m g “浓度优化的过程中。设定了7 个m 9 2 + 浓度梯度： 1 0 、1 5 、2 0 、2 5 、3 0 、3 5 、4 0m m o l l 摸板浓度 摸板浓度优化的过程中，设定了1 0 个摸板浓度梯度： l o 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 、8 0 、9 0 、1 0 0 n g 1 6 2r a p d 反应 采用o p e r o n 公司a 、c 和m 三组共6 0 条1 0 碱基引物，在p c r 仪 ( h b p x 2 2 0 ，t h e r r n o h y b a i d ) 上进行p c r 扩增反应。 r a p d 反应根据优化结果设定【猢6 1 。反应的总体积为2 5ul ，包括：2 5 ull o xp c rb u f f e r ，1 5ul2 5 m m o l lm g c l 2 ，2pl2 5 m m o l ld n t p 混合 物，5 0 n g 引物，3 0 n g 模扳d n a ，1 2 5 ut a q 酶( 博瑞克公司) ，d d h 2 0 补足 2 5 u l 。最后加2 0 i l l 矿物油。 r a p d 扩增反应程序：9 4 预变性3 m i n ，然后进入p c r 循环，9 4 c 变 性l m i n ，3 6 ( 2 退火l m i n ，7 2 延伸1 5 m i n ，共4 5 个循环，最后7 2 c 延伸 1 0 m i n ，4 c 保存。 p c r 产物用1 2 琼脂糖凝胶电泳分离( o 5 t b e ，3 v c m 恒压) ，染色， 凝胶成像系统( g e ld o cv m 2 0 0 0 ，b i o r a d ) 观察记录。 1 6 3 部分引物的重复鼬”d 实验 分析第一次r a p d 扩增结果，选择其中在八种鱼中扩增产物条带清晰多 态性好的引物进行了熏复实验，记录实验结果。 2 结果与讨论 2 1 鱼基因组总d n a 的提取 由于鱼类不同的组织，其特性差异很大，加上基因组d n a 片段大，易 断裂，所以要得到比较完整的总d n a 是比较困难的。除了实验操作过程要 十分小心外，方法的选择很大程度上影响实验结果。 比较四种提取方法，我们得到如下的实验结果： ( 1 ) 第一种方法提取的是组织( 肌肉、鳍和肝脏) ，尽管使用的是试剂盒， 但提取结果很不理想，拖尾很严重，主带不明显，结果不稳定。 ( 2 ) 第二种方法提取的是血液，使用的是试剂盒，结果很好，总d n a 比较 完整，没有拖尾现象，结果稳定，纯度也比较高。 ( 3 ) 第三种方法提取的是组织( 肌肉、鳍和肝脏) ，是手工提取，提取结果 也很不理想，拖尾很严重，主带不明显，结果不稳定。 ( 4 ) 第四种方法提取的是血液，也是手工法，但提取的结果也比较好，总 d n a 比较完整，基本没有拖尾现象，d n a 浓度为1 0 0u 咖l 左右， a 2 6 0 a 2 8 0 为1 7 左右，完全能满足本实验的要求( 见图1 ) 。 本实验图片中泳道m 为m a r k e r 、0 为空白、l 为疆疆鱼、2 为中华蓟裁鳃、3 为光 俄莉鳃，4 为齐口裂陵鱼、5 为t 鱼6 为三角鲤、7 为岩曝鲤、8 为杂交岩露鲤 b - x12345578 2 3 1 3 0 图1 八种鱼基因组d n a 提取结果 从上面的实验结果，我们可以看出组织的不同是影响鱼类基因组d n a 提驳结果的重要因素，对本实验所使用的四种组织来讲，血液最容易，肝脏 其次肌肉和鳍最难。 另外，在提取血液基因组d n a 时，手工法提取的结果基本上能达到试 剂盒法的水平。从d n a 得率和成本考虑，手工法是一种比较好的方法本 实验所使用的模板就是用这种方法提取。 2 2r a p d p c r 条件的优化结果 根据r a p d 实验稳定性较差的特点我们在进行优化实验时，充分考虑 到各种影响因素，严格统一实验的所有条件：整个r a p d 实验都使用同一台 p c r 仪所有的药品、试剂和耗材都使用同一批次的。在此基础上，我们确 定了从m 9 2 + 浓度和模板浓度这两个主要影响因素进行优化。 2 2 1m 9 2 + 浓度 m 9 2 + 浓度是一个十分重要的因素，它对t a q 酶的活性、引物的退火、模 板与p c r 产物的解链温度、产物的特异性等都能产生影响，尤其是t a q 酶 发挥聚合活性所必需的。m 9 2 + 浓度越高，t a q 酶活性越高，产物特异越低： 反之则t a q 酶活性越低，产物特异性越商。因此，需要在t a q 酶活性和产物 特异性两者之间寻求一种平衡。在m 9 2 + 浓度优化实验过程中，我们设定了 七个浓度梯度，结果表明m 9 2 + 浓度在1 5 3 0 m m o l l 范围内，扩增效果都比 较好。考虑到产物的特异性，我们最后确定的m 9 2 + 浓度为1 5 m m o l l 。 2 2 2 模板d n a 浓度 在p c r 实验中，理论上5 - 5 0 0 n g 的模板量能提供完全一样的扩增结果。 但在r a p d 实验中，模板d n a 量过低会影响r a p d 带型，过高时很多带会 丢失或整个扩增呈弥散状或完全得不到扩增带，一般认为模板量为2 0 - 8 0 n g 的范围内有最佳扩增。实验中最佳的模板量范围取决于研究类群与模板纯 度，在d n a 模板不很纯情况下，宁可使用有效浓度范围内的最低极限，使 抑制t a qd n a 聚合酶活性因子的影响降到最小。在优化的实验过程中，我 们设计了十个模板量梯度进行r a p d 扩增。结果表明，模板量为2 0 1 0 0 n g 时，扩增结果都很稳定，我们最后确定的模板量为3 0 r i g 。 2 2 3 确定的反应条件 l4 根据优化结果，我们设定r a p d 反应的统一条件。反应的总体积为2 5 ul ，包括：2 5 “l l o x p c r b u f f e r ，1 5 ul 2 5 m m o f l m g c l 2 ( 1 5 m m o l l ) ，2 ul2 5 m m o l ld n t p 混合物，5 0 n g 引物，3 0 r i g 模板d n a ，1 2 5 ut a q 酶， d d h 2 0 补足2 5p l ，最后加2 0 u l 矿物油。 r a p d 扩增反应程序基本上参照通用程序，具体有一点调整：9 4 ( 2 预变 性3 m i n ，然后进入p c r 循环9 4 c 变性l m i n ，3 6 * ( 2 退火l m i n ，7 2 * ( 2 延伸 1 5 m i n ，共4 5 个循环，最后7 2 延伸1 0 m i n ，4 保存。 2 3 r a p d 反应 采用o p e r o n 公司a 、c 和m 三组共6 0 条1 0 碱基引物，在p c r 仪 ( h b p x 2 2 0 ，t h e r m o h y b a i d ) 上进行p c r 扩增反应。 p c r 产物用1 2 琼脂糖凝胶电泳分离( o 5 t b e ，3 v e m 恒压) ，e b 染 色，凝胶成像系统( 吲d o ew 2 0 0 0 ，b i o 黜) 观察记录，见图2 - 5 。 2 4 部分引物的重复m 址d 实验 第一次r a p d 扩增后，我们发现6 0 个引物中有5 1 个引物在八种鱼中均 有扩增产物，对其中扩增产物条带清晰且多态性较好的3 5 个引物进行了重 复实验，凝胶成像系统观察记录。这3 5 个引物分别是o p a 0 1 、o p a 0 3 、 o p a 0 7 、o 队0 8 、0 e a l o 、o p a l 4 、0 p a l 6 、o p a l7 、o p a l8 、0 队1 9 、 o p a 2 0 ：0 p c o l 、o p c 0 2 、o p c 0 4 、o p c 0 6 、o p c 0 8 、0 p c 0 9 、o p c i l 、o p c i 3 、 o p c i 4 、o p c i 5 、o p c i 6 、o p c i 9 、o p c 2 0 ：o p 阱、o p m 0 5 、o p m 0 6 、o p m 0 7 、 o p m 0 9 、o p m l l 、o p m l 2 、o p m l 3 、0 p m l 6 、o p m l 9 、0 p m 2 0 。 l5 b t x l24567e 图2 随机引物o p m 0 9 r a p d 扩增结果 o12356t 8 i l 岫 4 5 0 0 3 0 0 0 2 0 0 0 1 2 0 ( i 图3 随机引物o p m 0 4 8 0 0 r a p d 扩增结果 5 0 0 2 4 0 岫i tl 2 3 456t8 6 图4 随机引物o p a 0 1 r a p d 扩增缩果 图5 随机引物o p a l 9 r a p d 扩增结果 黝一i| | i 第二章r a p d 数据处理与聚类分析 1 方法 1 1r a p d 扩增条带统计 我们对重复实验的3 5 个引物的扩增条带进行了统计，依据的原则：迁 移率相同的都视为相同的d n a 带。主要统计下面几个方面内容：单个引物 扩增的总条带数；单个引物单种鱼( 即一个泳道) 扩增的条带数：单种鱼扩 增总带数：单个引物任两种鱼相同的带数；扩增条带的大小。 1 2r a p d 数据处理与聚类分析 参照l y n c h 3 7 】遗传相似率计算公式s = 2 n a b ( n a + n b ) 和遗传距离计算公 式d = i s 进行数据分析。公式中s 为遗传相似率，n a 和n b 分别表示个体a 、 b 的d n a 带数，n a b 则为a 和b 共有的d n a 带数d 为遗传距离。最后以 遗传距离d 值，采用p h y m p3 ，5 c 版本软件包电的n e i g h b o r 程序进行 u p g m a 聚类分析【3 8 】。 1 3 七种鱼的r a p d 分子标记 在统计扩增产物的过程中记录七种鸯( 未统计杂交岩原鲤) 各自特异 性条带，对这些条带进行命名，作为七种鱼初步的r a p d 分子标记。 2 结果与分析 2 1r a p d 扩增条带统计结果 我们得到如下统计结果：单个引物扩增的总条带数为5 2 3 ( 见表，单 个引物单种鱼( 即一个泳道) 扩增的条带数为2 1 0 ，每个引物任两种鱼相 同的带数见表3 ，3 5 个引物任两种鱼相同的带数总和见表4 ：单种鱼扩增总 带数为1 2 8 1 9 5 ，平均为1 8 1 ，其中胭脂鱼扩增的条带数最少为1 2 8 ，杂交 岩原鲤扩增的条带数最多为1 9 5 ( 见表5 1 ；扩增条带的大小为1 5 0 2 5 0 0 b p 。 表中的髓代表疆聒鱼中代表中华鼬翱鳃光代表光镝藕鳃雅代表齐口裂骧鱼t 雅 鱼) t 代表t 鱼$ 三代表三角鲤、岩代表岩碾鲤，杂代表杂交岩鼹鲤， l7 表2 单个引物的扩增总条带数 引物扩增带引物扩增带引物 扩增带引物扩增带 数数 数数 o p a o l2 2o 队1 91 4 0 p c i 3 1 1 o p m 0 71 9 o p a 0 3l l o p a 2 0 l l o p c i 4 、1 7o p m 0 95 o p a 0 71 40 p c 0 11 4o p c i 51 5o p m l l1 6 o p a 0 89o p 0 0 21 70 p c i 61 5o p m l 21 6 o p a l o1 3o p c 0 41 2o p c i 91 9o p m l 31 2 o p a l 4 1 0 o p c 0 62 30 p c 2 01 4o p m l 6 l l o p a l 61 6o p c 0 81 3o p m 0 42 1o p m l 97 o p a l 71 8o p o d 91 5o p m 0 51 00 p m 2 01 4 o p a l 88o p c i l1 5o p m 0 61 0 表3 每个引物任两种鱼相同的带数 a 1胭中光雅丁岩杂a 3胭中光雅丁5杂 胭 64444333 胭 lo0o000