（微生物学专业论文）高效富集镉菌株的筛选及其富集特性研究.pdf

独创性声明 s s 6 s 譬3 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：卮姘幽 时间： 驯3 年月知日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：茬妨蜥 时间： 圳j 年f 月扣日 ，。 导师签名 渤多年6 月f7 日 囔；幽 时间 中国农业人学硕士论文 摘要 环境中的镉污染问题已经引起了普遍的关注。微生物在治理镉污染中有着很大的应用前景， 尤其是微生物吸附剂的研究成为目前研究的热点。本实验进行了抗镉和富集镉菌株的筛选，并对 其抗性和富集特性及机制作了系统的研究，为扩大微生物在镉污染治理中的应用范围奠定基础。 从高镉含量的闪锌矿土样中经分离、筛选，得到一株可在2 0 0 0 m g l 镉浓度f 存活并对镉具 有较强的富集能力的丝状真菌，编号为f 2 ，经形态学鉴定归入茎点霉属( p h o m a ) 。f 2 在液体培养 时，培养基初始镉浓度在4 6 1 m g , l 以下时对其生长无抑制作用，镉浓度为1 6 3 8 m g l 时有较大 影响，但仍有明显生长：f 2 对液体培养基中低浓度镉( 4 6 1 m g l 以下) 的去除效果不太稳定， 但初始镉浓度为1 6 3 8 m g l 时，其去除率为9 6 ，菌体最大镉含量可达2 8 ，显示了较大的富集 容量。菌龄对活体富集镉能力有较大影响，培养基成分对富集有干扰作用。f 2 冷冻干燥菌体对水 中镉的吸附能力远大于烘干菌体，镉浓度为0 9 6 m g l 、9 2 2 m g l 、5 1 3 m g l 的溶液中镉的去除率 均在8 8 以上吸附过程符合一级吸附动力学特征，而且受到o r - i 的限制作用很小。 f 2 在1 0 0 m g l 镉浓度下培养后。经环境扫描电镜( e s e m ) 观察显示，菌体表面有较大晶体 状沉淀物；透射电镜( t e m ) 和能谱分析( e d a m ) 表明，细胞壁周围形成大量细小的高镉含量 沉淀物。所以认为胞内外沉淀物的形成可能在该菌的抗镉和富集镉机制中起了重要作用。f 2 生长 过程中培养基p h 值明显上升，推测沉淀物的形成可能与该菌产生碱性物质有关。 茎点霉属真菌在治理重金属污染的研究中未见报道，本研究为该领域提供了新的材料来源及 相关信息。类似的胞内重金属沉淀物在真菌中也未见报道，此发现为真菌对重金属的抗性机制研 究提供了一个新的切入点。 关键词：镉，富集，沉淀，抗性，茎点霉( p h o m a ) 中国农业大学硕士论文 a b s t r a c t e n v i r o n m e n t a lc a d m i u mp o l l u t i o ni so fi n c r e a s i n gc o n c e r n m i c r o o r g a n i s m sa r ed e e m e dt oh a v e g r e a tp o t e n t i a li nt r e a t i n gc a d m i u mp o l l u t i o nb i o s o r p t i o n ，h a se m e r g e d a st h em o s tp r o m i s i n gp r o c e s s b e c a u s eo fi t sh i g he f f i c i e n c ya n df a v o r a b l ee c o n o m i c s i nt h i ss t u d y , m i c r o o r g a n i s m sw i t hh i g ha b i l i t y o fc a d m i u mr e s i s t a n c ea n da c c u m u l a t i o nw e r ei s o l a t e d a n ds c r e e u e d t h e nc h a r a c t e r i s t i c sa n d m e c h a n i s m so fc a d m i u mr e m o v a lb ys e l e c t e ds t r a i nw e r es t u d l e d o n ec a d m i u mr e s i s t a n c es t r a i no ff u n g id e s i g n a t e da sf 2w h i c hc o u l ds u r v i v e2 0 0 0 m g lo f c a d m i u mw a si s o l a t e df r o mb l e n d es o i lw i t hh i g hc o n t e n to fc a d m i u m ，i ts h o w e dh i g ha b i l i t yo f c a d m i u ma c c u m u l a t i o n i tb e l o n g st op h o m as p a c c o r d i n gt om o r p h o l o g i cc h a r a c t e r i s t i c s w h e n c u l t u r e di n l i q u i dm e d i u m ，c a d m i u mw i t hi n i t i a l c o n c e n t r a t i o nb e l o w4 6 1 m g ld i d n ti n h i b i t e dt h e g r o w t ho ff 2 ，1 6 3 8 m g r lo fc a d m i u ma f f e c t e di to b v i o u s l yb u tg r o w t hc o n t i n u e dt oag r e a te x t e n t c a d m i u mr e m o v a lf r o mm 喇i u mb yf 2u n d e rl i q u i dc u l t u r ew a sn o ts os t a b l ew i t h1 0 wc a d m i u m c o n c e n 订a f i o nb e l o w4 6 1 m g l ，b u tr e m o v a lr a t i or e a c h e d9 6 w i t hi n i t i a lc a d m i u mc o n c e n t r a t i o no f 1 6 3 8 m g c la n dc a d m i u mc o n t e n to f b i o m a s sr e a c h e d2 8 ，w h i c hs h o w e dh i 【g hc a p a e i t yo fc a d m i u m a c c u m u l a t i o nb yf 2 g r o w t hp h a s eo fb i o m a s sw a si m p o r t a n tf o rc a d m i u mr e m o v a lb yl i v i n gb i o m a s s o ff 2 ，a n dc o m p o n e n t so fm e d i u ms e e m e di n t e r f e r e di nt h er e m o v a la b i l i t y c a d m i u ma d s o r p t i o nb y l y o p h i l i z e d b i o m a s so f f 2w a sm o r ee f f i c i e n tt h a no v e nd r l e db i o m a s sw i t hr e m o v a lr a t i oa b o v e8 8 i n w a t e rw i t hc a d m i u mc o n c * n t r a t i o n so f0 9 6 9 2 2a n d5 1 3 m g l t h ea d s o r p t i o np r o c e s sa c c o r dw i t h s t a i ra d s o r p t i o nk i n e t i c s ，a n di n i t i a lp hv a l u eo f s o l u t i o n sh a sal i t t l ee r i e c to nc a d m i u mr e m o v a l e n v i r o n m e n t a ls c 卸n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y 疆s e m ) o b s e r v a t i o no ff 2m y c e l i n mc u l t u r e di n l i q u i dm e d i u m w i t hl o o m g d lo fc a d m i u ms h o w e dt h a tt h e r ew e c r y s t a l l i n ep r e c i p i t a t i o n sa t t a c h e dt o t h es u r f a c eo ff 2 t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p yo e m ) a n d e n e r g y - d i s p e r s i v ea n a l y s i sm i c r o s c o p e ( e d a m ) e x a m i n a t i o nr e v e a l e dt h a tt h e mw e r em a n yg r a n u l e sw i t hh i g lc o n t e n to f c a d m i u ma r o u n dt h e c e l lw a l l t h u sp r e c l p i t a d o n so f c a d m i u mo u 括i d ea n di n s i d et h et e nw e r ec o n s i d e r e dt ob ei m p o r t a n t m e c h a n i s m so f c a d m i u mr e s i s t a n c ea n da c c u m u l a t i o no f f 2 ，a n di ti sp o s s i b l yr e l a t e dt oa l k a l ip r o d u c e d b yf 2d u r i n gg r o w t h t h e s er e s u l t sp r o v i d en e wi n f o r m a t i o no n 曲j d yo fm e c h a n i s m so fc a d m i u m r e s i s l a n c ea n da c c u m u l a t i o ni nf u n g i k e yw o r d s ：c a d m i u m ，a c c u m u l a t i o n ，p r e c i p i t a t i o n ，r e s i s t a n c e ，p h o m a 2 中国农业大学硕士论文 1 研究意义 1 1 镉的用途及毒性 前言 镉( c d ) 是一种具有银白色光泽、软性、延展性好、耐腐蚀的稀有金属。它于十九世纪初首先 在z n c o ，的杂质中发现，主要存在于锌的各类矿石中，目前大部分镉常在炼锌时以副产品得到。镉 的主要用途是用于颜料和电镀工业，作颜料主要是c d s 作为镉黄用它镀到钢铁或铜上可增加金属 的强度和耐磨性，但不影响其导电性：它还应用于制备镍镉、铜镉台金，这些合金作为材料具有 优良的性能被广泛用于尖端科技；还可用于半导体和荧光体，原子反应堆的控制棒等；它的化台 物还能作为农药治理植物的病虫害。镉同时是一种劂毒的重金属元素，早在1 9 7 4 年联合国环境规 划署和国际劳动卫生重金属委员会就将其定为重点污染物，是当今重金属污染中面积最广、危害 最大的重金属元素之一，被称为“五毒之首”。研究表明，单质镉本身并没有毒性，然而其化合物 具有毒性及腐蚀性，其中c d o 、c d s 0 4 、c d o q 0 3 ) 2 的毒性比较高。6 0 年代于日本富山县爆发的“骨 痛病”，其罪魁祸首就是镉。多年来诸如此类事件的发生已引起国际上的极大重视。镉作为机体 生长发育非必需元素，环境中很少的量通过生物放大( b i o m a g n i f l c a t i o n ) 和生物积累 c o i o a c c u m u l a f i o n ) 。进入人体即可对肾、肺、肝、睾丸、脑、骨骼以及血液系统产生一系列损伤， 而且还有研究揭示镉具有一定的致癌和致突变性。另外，镉在体内的半衰期长达1 0 3 5 年，为己 知的晟易在体内蓄积的毒物。美国毒物管理委员会0 ”s d r ) 已将其列为第六位危及人类健康的有 毒物质【1 】o 1 2 镉污染现状 环境中镉的自然来源很少镉主要是以硫化物、氧化物、碳酸盐形式与闪锌矿共存。据资料 介绍，地壳中含镉为o 1 8m g l ，土壤中镉的含量随不同地区而异。但大多数在0 1 2m g l 以下。环境 中镉的污染主要是工业生产造成的，采矿、冶炼、合金制造、电镀、油漆颜料制造、核反应堆、 陶瓷等工业部门是引起镉污染环境的主要源泉。工业发达国家尤为突出，如美国工业向大气排放 的镉多达1 0 0 0 吨以上，日本神户每年排放含镉的废水高达3 0 0 0 吨。据联合国环境资料报道表明， 目前空气中镉的年均浓度为：市区0 0 2 岭几，郊区o 0 0 3 g 几，而工业区高达o 6 1 a g l 。淡水中平均 含镉量为8 p g l ，海水中则为0 们0 0 5 p g l ，工业区水域镉浓度比平均含量高几十倍。我国镉的 污染形势虽不很严重，但随着工业的发展，特别是乡镇企业的发展，形势将是严峻的。据中国近海 检测站测得镉的浓度范围为o 0 2 0 ，0 4 5 p g l ，平均浓度为o 1 p g ，l ，南海最高，东海最低，但均未 达到5 g 几的标准口j 。据报道，我国受镉污染的耕地面积约1 3 3 万公顷，已有l l 处污灌区达到 了生产镉米的程度1 3 】。据有关调查，在广西某地，农产品的镉污染较为严重，当地居民因长期食 用被镉污染后的稻米和蔬菜等农产品，部分已出现了明显的“痛痛病”症状。在沈阳张士灌区， 农产品受重金属污染的状况亦较严重1 4 】。镉污染状况已受到了政府的高度重视，正在采取有力措施 中国农业大学硕士论文 加以解决。 1 3 微生物治理镉污染的优点 传统的治理重金属污染的方法包括化学沉淀、化学氧化还原、离子交换、过滤、电化学处理 及蒸发等。这些方法都有一些较大的缺点，比如去除不完全、能量要求较高、会产生需要进一步 处理的毒性淤泥及废弃物，且通常成本较大。近十年来发展起了一些替代方法，其中生物修复由 于造成二次污染的机会少，对生态环境的破坏较小，成本低且专一性较高而引起了很人的关注。 其中尤其以植物富集修复土壤及微生物吸附剂处理水体重金属污染受到了较大的重视。微生物在 重金属污染的治理上有多方面的应用潜力，在这方面世界各国已有过较多的研究。 2 研究概况 应用微生物修复重金属污染( 包括锅) 在上世纪七、八十年代已陆续有人研究，但大多数的 工作则在九十年代以后展开，研究重点包括：微生物吸附体的筛选及吸附特性研究，对重金属的 富集与抗性机制，以及对重金属的固定或活化作用。 2 1 微生物与重金属的相互作用 2 1 1 重金属对微生物的毒性 大多数重金属原子具有未全满的d 轨道，这些d 轨道使重金属离子具有形成复杂化合物的能 力，所以在生化反应中起着重要的微量元素的作用。但在高浓度下，重金属离子在胞内形成非专 一性的复杂化合物，产生毒性作用。重金属对微生物的毒性在于它们的离子性质可与许多细胞 外配体结合，并从正常的结合位点上置换有生命意义的金属离子。金属可通过与巯基结合破坏蛋 白质，和磷酸基、羟基结合破坏核酸，使蛋白质和d n a 构象改变、功能丧失，例如：镉可与细 胞中的锌竞争，与d n a 的断口结合。金属也可以影响氧化磷酸化和细胞膜的通透性。环境因素 如有机物质、阴阳离子及p h 值等会影响到重金属的毒性。 2 1 2 微生物对金属离子的运输 金属离子进入细胞一般要经过胞外结合与运输到胞内两个过程。前者快速，不需能量：后者 缓慢，一般依赖能量及代谢系统调控。金属运输的关键是质膜的离子梯度及膜电位。由于很多重 金属在高浓度时具有毒性，因此微生物通过多种方式如减少运输、阻渗作用或排出作用来降低重 金属的危害。 2 1 3 微生物对重金属的固定作用 2 1 3 i 表面吸附 吸附作用一般指活的和死的微生物菌体都能进行的被动吸附过程，也育人将微生物的主动吸 收过程也归入其中。微生物表面结构( 细胞壁和生物聚合物) 对重金属的吸附起着重要的作用。 一些研究表明，生物吸附机理主要有静电吸附、离子交换、络合和氧化还原等作用【。一种生物吸 附剂可能通过上述机制中的一种或多种吸附某一金属离子，而对不同的金属离子的吸附机制也可 4 中周农业大学硕i 论文 能不同。大量的金属阳离子可与细胞表面的阴性基团通过静电引力结合，有时可在壁膜之间形成 晶体【5 1 。细胞壁是重金属离子的主要积累场所。细胞壁主要由甘露聚糖、葡聚糖、蛋白质和凡丁 质组成，这些多糖中的氮、氧、硫等原子都可提供孤对电子与金属离子配位，细胞壁上可与金属 离子配位的官能团主要包括一c o o h 、- n h 2 、- s h 、一o h 、p 0 4 3 - 等。此外，这些多糖中的离子能与 溶液中的二价金属离子交换，例如海洋藻类中的褐藻细胞壁中的藻酸盐，含有k + 、n a + 、c a ”或 m 9 2 + ，这些离子能与溶液中的c o ”、c u ”、c d ”、z n 2 + 交换结果溶液中的金属离子被吸附到细 胞壁上【“。许多细菌可在细胞表面产生荚膜或粘液层，含水率在9 0 以上，固体物质成分主要是多 糖多肽，其它的物质成分是蛋白质、核酸、c l c 4 酸、营养盐类，这些成分相互作用产生聚合 阴离子。具有生物吸附作用。生物聚合物吸附重金属离子的机制是通过离子交换和络合两种方式进 行的【7 1 。 2 1 。3 2 胞外络合 除了微生物细胞本身及表面结构的吸附作用之外，微生物的代谢产物也能在胞外络合重金属 离子例。一些微生物如动胶菌、蓝细菌、硫酸盐还原蕴以及某些藻类，能够产生胞外聚合物如多 糖、糖蛋白、脂多糖等，具有大量的阴离子基团，可与金属离子结合。在多形态真菌出芽短梗霉， 还分泌一种叫m e l a n i n 的黑色素，是含酚基、多肽、脂肪烃及脂肪酸的聚合物，能够结合数量可 观的金属离子如c u 2 + 、f e 等。柠檬酸是一种有效的金属螫合剂，草酸则与金属形成不溶性的草 酸盐沉淀，此种情况常常发生在一些接触含金属防腐剂的腐木真菌中。有些细菌、真菌、蓝细菌 和藻类在限定铁的条件下，产生一些低分子量的铁载体( s i d e r o p h o m s ) ，能与铁、铝、铜、铀、 锰等金属结合。上述微生物产生的聚合物己被证明在含金属污水的处理上有很大的应用潜力。 2 1 3 3 胞外沉淀 在厌氧条件下( 有时也可在有氧条件下实现) ，硫酸盐还原菌及其它微生物可在好氧或厌氧 的情况下在胞外形成c d s 沉淀 9 , 1 0 1 。英国的m a c a s k i e 等分离的柠檬酸细菌，具有一种抗镉的酸性 磷酸酯酶，分解有机的2 磷酸甘油，产生的h p 0 4 2 与c r + 形成c d h p 0 4 沉淀。该菌不仅能大量地 积累镉，而且在处理含铀废水中具有很高的效能，在含金属废水的处理中已发挥出重要的作用【l “。 许多微生物通过依赖或不依赖代谢的作用，能够将多种金属转化成为沉淀物的形态【l “。还有的微 生物可以通过产碱来提高环境p h 值从而促进重金属沉淀物的形成i l 。 2 1 3 4 胞内积累 金属进入细胞后，通过“区域化作用”分布在细胞内的不同部位。在细菌、藻类和真菌中， 吸收的金属形成一些成分尚未查明的电子稠密颗粒。在某些真菌中，金属以离子状态或者以无毒 的氧化态方式存在，还有些与聚磷酸盐结合积累于空泡中或线粒体内，随后经代谢作用排到胞外。 近年来，国内外学者加强了对胞内金属硫蛋白( m r ) 的研究。该蛋白基本特征是：低分子量( 2 0 0 0 1 0 0 0 0 ) ，富含半胱氨酸，能够结合铜、镉、锌等重金属。在动植物中普遍存在。在有的酵母、蓝 细菌中也发现有金属硫蛋白或类金属硫蛋白。除了金属硫蛋白外，研究者已从许多藻类、植物和 裂殖酵母菌中分离到一些多肽，仅由三种氨基酸组成，即l - 谷氨酸、l 半胱氮酸和l 甘氨酸，结 构通式为( r - g l u - c y s ) n g l y ，这类多肽被称之为p h y t o e h e l a t i n s ( p c ) ，能结合铜、镉、锌等重金 属i 。金属硫蛋白或类似的多肽的主要生理学功能是储备、调节和解毒胞内的金属离子，而且有 可能用于治理重金属污染的生物净化技术中。 2 1 4 微生物对重金属的活化作用 中国农业大学硕i 论义 微生物浸沥过程中起作用的主要是硫杆菌属( t h i o b a c i l l u s ) 类细菌，它们大多数属于严格的化 能自养型，通过氧化还原态的硫化合物获得能量。根据硫杆菌氧化硫化合物的方式的不同，可以 把生物浸沥分为两类：直接浸沥和间接浸沥。直接浸沥的机理是：硫杆菌类细菌直接氧化还原态 硫化合物，同时产生h + ，周围环境的p h 值下降，氧化还原电位升高，在这种条件f ，环境中的 重金属逐渐由有机质结合态或沉淀态转化为游离的离子态。间接浸沥的机理是：硫杆菌类细菌先 氧化一些金属离子，使其从低价态变到高价态，利用这些高价态金属离子的氧化性去氧化低价态 的硫化合物，在这过程中，污泥的p h 降低，氧化还原屯位升高，污泥中的重金属的存在形态发 生变化，生物浸沥得以完成。氧化亚铁硫杆菌( t h i o b a c i l l u 5 7 f e r r o o x i d a n s ) 是一类既能进行直接浸沥 又能进行间接浸沥的硫杆菌。有些微生物如曲霉i l ”可以产生有机酸而增强重金属的可溶性。还有 一些微生物可以通过降解重金属络合物如e d t a l l “、柠檬酸1 等释放重金属离子。 2 1 5 微生物的转化作用 微生物能够通过氧化还原、甲基化和去甲基化作用转化重金属使呈不同的价态或化合态并改 变其毒性。这些转化作用不仅与重金属的地球化学循环有关，也构成了微生物对重金属的抗性和 解毒机理。例如，细菌、放线菌及某些真菌中的汞还原酶可以催化h 矿+ 还原成h g o 。汞及其它金 属诸如铅、硒、碲、砷、锡、锑等能被微生物甲基化。c ，能被多种细菌还原成为c r 3 + f ”1 ，高毒 的a s “可被微生物中的砷酸盐氧化酶氧化成为a s “，更易于被f c 3 + 沉淀o ”】。 2 2 微生物对重金属的抗性机制 微生物对重金属的抗性和解毒方式在以上微生物与重金属的相互作用中已有体现，下面再作 一些归纳和补充。由于重金属离子不可能像有毒的有机化合物那样被降解或修饰，除了细胞表面 的络合和胞外沉淀作用外，对于进入胞内的重金属离子只有三种可能的基本的抗性机制【2 0 】：一、 可以通过外排作用将重金属离子主动排出胞外，从而减少对该离子的富集；二、阳离子，尤其是 “硫爱好者”，可以与含硫分子如各种金属螯合肽及金属硫蛋白等结合形成复杂化台物；三、有 的金属离子可以被还原成毒性较低的价态。对于许多金属，抗性包括了两种或三种以上所说的基 本机制的联合作用。大量的研究表明，微生物对重金属的抗性在很多情况下是由染色体外的遗传 物质质粒或转座子上的抗性基因编码的。 2 2 1 氧化还原作用 要通过还原作用解毒，该重金属的氧化还原电位必须介于h ，h + 对( - 4 2 1 m y ) 和o h 对 ( + 8 0 8 m v ) 之间 计算自w b a s t ( 3 0 ，p h = 7 0 ) ，这是大多数好氧细胞的还原范围。那样，h 9 2 + ( + 4 3 0 m v ) 、铬酸盐( + 9 2 9 m v ) 、砷酸盐( + 1 3 9 m v ) 、c u ”( - 2 6 8 r n v ) 可以被细胞还原，z n ” ( 1 r 1 8 v ) 、c d ”( 一8 2 4 m v ) ，c o ”( ，7 0 1 m v ) 以及n i ”( - 6 7 8 m v ) 则不太可能。但也有报道通 过转基因植物可以还原h 9 2 + 、a u ”、c d ”、p b ”、a 旷等金属【2 1 j 。可被还原的重金属化合物必须 能被排出胞外，否则可能发生自身重新氧化。然而大多数还原产物溶解性差( 如c r 3 + ) ，而且有 的甚至比其离析物毒性更强( 如a s o f ) 。那样，如果细胞选择还原方式来解毒，则必须具有一个 外排系统来输出还原产物。对于汞，其被还原能力和产物的低蒸汽压同时符合，随着h g o 的挥发 扩散。h g ”可被还原成h g o 而解毒。 2 2 2 复合作用 6 中国农业大学硕士论文 如果一种重金属化合物在胞内环境下不能被还原，或者还原方式不是很值得，剩余的选择就 只有复合作用和外排作用，或两者兼而有之。然而，如果考虑到以下情况，复合作用对于一个快 速生长的细胞耗费较大。假设一个好氧细胞通过形成c d s 来解除c d ”毒性必须吸收硫酸盐 ( 1 a t p ) ，形成p a p s ( 磷酸腺苷5 磷酰磷酸，3 a t p ) 并将其还原成亚硫酸盐( 丢失两电子， 通过呼吸作用可产生3 个a t p ) 最后还原成硫化物( 丢失6 个电子，相当于9 个a t p ) 。这样， 形成复合一个c d ”所需的硫化物，累计耗费1 6 个a t p 。如果考虑到谷胱甘肽衍生物甚至金属硫 蛋白的合成，这些耗费是非常巨大的。所以如果有其它更为合算的抗性方式，细胞可能不会选择 这种方式来解毒。 表1 在重金属运输中起重要作用的蛋白家族 f a | i l i l y d i r e c t i o no f e n e r g y m e t a li o n s c o m p o s i t i o n t r a n s p o r t a t p a s ep m t s = a b ecore。 p e r i p l a s m i eb i n d i n gp r o t e i n e 国u x a 1 p-abc c 0 化+ m e m b r a n ef u s i o n p r o t e i na n do u t e rm e m b r a n ef a c t o r p - t y p e b b o t h册 m 矿im n 2 + ，c 扩，r ，c u ”，lm e m b r a n e _ b o u dp r o t e i na sc o r e z n ”，c d 2 + ，p b 计，a g 十 a - t y p e e f f l u xa t pa r s a n i t ei m e m b r a n e - i n t e g r a lp r o t e i n + a d i m e r i c 册a s es a l b a n i t r n d 豳u xp r o t o ng r a d i e n t c 0 2 + z n ”，c d 2 in i c u 2 1 ， ic p mp r o t o n c a t i o n a n t i p o r t e r + a g t ? m e m b r a n ef u s i o np r o t e i n ( d i m e r n + o u t e rm e m b r a n ef a c t o r ：c b a ，t r a n 印o n s y s t e m s h o x n u p t a k e c h e m i o s m o t i cc o ”n r m e m b r a n e - l m e g r f lp r o t e i n c f i r a n t i p o r t ? c h e m i o s m o t i cc h r o m a t e m e m b r a n e i n t e g r a lp r o t e i n ( c h r a ) m i t u p t a k e c h e m i o s m o t i cm o s tc a t i o n s m e m b r a n e - i n t e g r a lp r o t e i n ( c o r a ) c d fe 母u xc h e m i o s m o t i c z r i tc d 誓c f 矿 m e m b r a n e i n t e g r a lp r o t e i n ( c z c d z r c i g z n t n 弋丽再茹雨而磊品而画丽孬丽面丽面葛磊莳面丽面鬣蕊再藏研函两萄蔬嚣面a 面i 试c d ld i v i s i r r - - m - ( s 日- t 百百丁。添酉 s a i e r1 9 9 4 ) , c h re h l o l l l , 血u t r a l x m ( n i 酷蕊蚰1 9 9 8 ) , m 1 tm c 咖m o r g a n i e 如m s 叶( h m 溜l 蕊村1 9 9 s ) , c d fe a t i o n - d i f u s i o nf a c i l i t a t o r s 删i e s _ i l d s i l v e r l 9 9 5 ：p a u l s c n a n ds a i e r l 9 9 7 ) 2 2 3 外排作用 通过外排系统排出1 个c d ”只需约一个a t p ，但是可能形成一个外流和吸收的无用循环。只 有在微生物群体可将紧密接触的环境中所有的c d 2 + 复合时，复合作用才比外流系统合算。但这在 大多数情况下是不可能的。所以，复合作用一般仅作为细胞暴露于较低浓度的重金属时的有效解 毒方式。由于将还原作用作为唯一的解毒方式不太可能，或者是不明智的，所以在高浓度重金属 污染的环境中快速生长的任何生物都必须通过作为单独的或者联合其它方式的外流作用来解毒。 因此，重金属离子的代谢主要就是运输代谢。微生物中存在许多与金属离子运输有关的蛋白家族， 大多位于细胞膜上，起着离子泵的作用。在重金属运输中起重要作用的蛋自家族列于表1 l2 0 】。 2 2 4 微生物对镉的抗性系统 c d s 的溶解系数是1 4 xl f f “，而z n s 为2 9 1 l o 。，所以，镉的毒性比锌强得多。虽然在 镉对微生物的毒性上有过大量研究，但是没有阐明确定的作用机制，大多都可归于普通的“与硫 结合使蛋白变性”、“影响钙代谢造成膜破坏”、“影响锌代谢”，以及保护功能的丧失机制之下。 7 中国农业大学硕士论文 只在少数的例子中发现有个别的重要机制。编码形成二硫化物所需产物的凼6 a 基因突变导致 e s c h e r i c h i ac o i l 对镉敏感1 2 2 ，因而d s b a 蛋白是g 细菌周质中镉的一个作用靶子。在e c o l i 中，镉压力下诱导产生的颧外蛋白的影响还不清楚“。 镉的吸收在分子水平上了解得很少。在r a l s t o n i as p c h 3 4 中1 2 4 l ，镉由m 9 2 + 吸收系统吸收，可 能在s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 中也是【2 5 】。在其它细菌中，镉由m n 2 + 吸收系统进入细胞 2 6 , 2 7 1 。 在植物中，镉由钙吸收系统吸收【2 ”。 已知的细菌中与镉代谢相关的蛋白家簇 见图i f 2 ”。虽然在细菌中，对镉的抗性主要 基于镉的排出，然而在蓝细菌中，含有金属 硫蛋自口。金属硫蛋白基因s m t 的扩增提高 了对镉的抗性p ，其缺失则导致抗性降低 1 3 1 】。金属硫蛋白基因s m t a 受s m t b 控$ 1 j 3 2 1 ， s m t b 也调控转运锌的p 型a t p 酶。由于 在蓝细菌中存在多种多样的r n a 型和p 型 运输系统，运输作用在这些细菌中可能也起 着重要作用。 图1细菌中与镐代谢相关的蛋白家族 在g 细菌中，铺看来由r n d 驱动的系统解毒，如主要作为锌的输出者的c z c 系统 3 4 1 和主要 作为镍的输出者的n e c 系统1 3 5 1 。在g + 细菌中，输出镉的p 型a t p 酶的第一个例子是来源于 s t a p h y l o c o c c u s a u r e u s 的c a d a 泵【3 6 】。这个蛋白是重金属p 型a t p 酶的一个亚族的第一个成员， 后来发现的所有铜、铅、锌的运输者都与这个蛋白有关。在其它口细菌中，对镉的抗性也被发 现由类似于c a d a 的蛋白介导p ”。 酵母中与镉代谢相关的蛋白家族见图2 1 2 9 1 。在 & c e r e v i s i a e ，镉与谷胱甘肽结合，形成的镉双谷 胱甘肽复合物由一种a b c 运输蛋白酵母镉抗性因 子y c f i p 运输进入液泡p 8 】。这可能是所有真核生 物中的一个普遍原理。人体中与多重药物抗性有 关的蛋白可能在镉的抗性上可以与y c f i 突变产 生功能互补9 。如果由谷胱甘肽形成了 p h y t o c h e l a t i n s ( p c ) ，产生的镉一p c 复合物则可以被 h m t i p a b c 运输者运输”“，类似的运输者也在 a t h a l i a n a 中被发现一j 。此外，在酵母的四个属中 都发现有金属硫蛋白的存在。所以在真核生物的 镉代谢中，像z r c l 这样的c d f 运输蛋白的运输 作用和金属硫蛋白的结合作用可能都被包括在 图2 酵母中与镉代谢相关的蛋白家族 内，但看来主要的解毒机制是经过a b c 运输蛋白 将谷胱甘肽p c 复合物转运进入液泡。 随着分子生物学的不断发展，在很大程度上揭示了微生物对重金属抗性的本质，但仍有许多 问题有待解决，尤其对真菌的抗性机制缺少深入的研究。 中国农业大学碗士论文 2 3 微生物在重金属污染上的应用潜力 利用微生物对重金属多方面的作用方式和强大的作用能力，微生物在治理重金属污染环境中 有着很大的应用潜力，其中研究最多的是微生物吸附剂的应用。 2 3 1 微生物吸附剂在水处理中的应用 利用以上所述的微生物或其代谢物对重金属的多种多样的吸附和积累作用，微生物吸附剂在 水处理中的应用得到了很大的重视，也进行了较多的研究。用微生物吸收重金属对于生态和现实 都有重要作用。生态学上，尤其在水生环境中对于金属的分布起重要作用；在现实上，微生物对 重金属的吸附作用为水中修复提供了一种经济可行的技术。水中重金属的传统处理方法包括：化 学沉淀法，离子交换法，活性炭及硅胶吸附法，电化学法及膜分离法等，它们各有优缺点。但是， 在处理较低浓度的重金属离子废水时，其操作费用和原材料成本均相对过高。微生物吸附剂的优 点是原料来源广泛，如发酵工业或各种活性污泥中可利用的微生物包括细菌、酵母、真菌和藻类 等及其代谢物，具有在低浓度下处理重金属效果更高，吸附容量大，速度快，选择性好，吸附设 备简单，易操作等特点1 + 2 , 4 3 。在去除水中重金属方面有广阔的应用前景。 许多微生物包括其活体或干菌体被发现对重金属具有较强的吸附能力，在吸附机理、影响因 素及工程化方面也有过较为全面的研究。用于生物吸附的原核微生物主要有芽孢杆菌属“】、假 单胞菌属如铜绿假单胞菌”8 1 及一些其它细菌1 4 9 ”1 等。与镉有关的微生物吸附剂以真菌研究较 多，酵母中以酿酒酵母为主队5 2 】，霉菌包括根霉、青霉、毛霉、担子菌等 s 3 - s g 及许多藻类 6 0 “1 对 重金属( 包括镉) 都有很强的吸附能力。其中又以霉菌和藻类研究的种类较多，有的已经尝试应 用，如m a r ks p i n t i 等f 叫用聚合砜固定泥炭藓制成固定化菌体，其球状小粒机械强度高、化学稳定 性好、容易再生、不膨胀收缩该固定化藻体已成功她用于从酸性矿井水中去除z n 、c d 、m g 等 金属。 尽管微生物吸附剂的应用有过较多研究，但其工业化的步伐一直显得很缓慢。其中吸附能力 及成本的高低是阻碍其发展的重要因素之一。目前，微生物吸附金属的机理尚未完全被了解，深 入探索和研究微生物吸附金属的机理，对于充分利用微生物吸附金属的能力，开发更多有效的微 生物吸附剂，用于去除或回收贵、重金属具有重要的经济和社会意义。继续深入研究生物吸附机 理，加强拓宽微生物吸附剂的原料范围，寻找更多吸附量大、选择性高或能同时吸附多种金属的 微生物材料，以及降低生产成本仍是促进微生物吸附技术实用化的努力方向。 2 3 2 微生物对重金属的其它转化作用的应用 利用微生物对重金属的固定作用，可以降低土壤或水体中重金属的浓度或其活动性，从而减 少其生物有效性和对地下水及其它地方的污染，降低其危害作用。例如在莺金属污染的土壤中加 入真氧产碱杆菌的抗重金属菌株使得土壤水悬浮液得以净化。利用硫酸盐还原菌生物反应器将土 壤沥出液中的金属离子以硫化物沉淀下来忡j 。而利用微生物对重金属的活化作用可以提高重金属 的活动性，结合淋滤法可以去除工业废弃物和土壤中的重金属如利用曲霉产生的柠檬酸可以使土 壤中的镉淋溶去除9 9 e ”i 。结合硫杆菌的淋滤作用和硫酸盐还原菌的沉淀作用，则可有效去除土 壤中重金属l o 。 此外，利用微生物对重金属的氧化还原、甲基化和去甲基化作用，可以将重金属转变成毒性 9 中国农业大学硕_ 上论文 较低的形态从而降低或去除其危害。 微生物除了直接在治理重金属污染中起作用外结合其它净化技术也有着重要的应用价值。 尤其是根际微生物与植物修复的结合在最近几年受到了高度的重视p 。对根际的研究表明，根际 的环境状况直接影响重金属在土壤、植物系统中的迁移和转化，而重金属的形态与迁移转化和生物 有效性有着密切的关系【7 0 1 。微生物与菌根对重金属生物有效性的影响是多方面的，利用它们可提 高植物提取修复的效率，因此根际微生物尤其是菌根菌与重金属的相互作用近几年也引起了较多 的关注 7 1 7 2 i 。 2 3 3 分子生物学技术与微生物在重金属污染中的应用 分子生物学技术的引入使得微生物在治理重金属污染中应用前景更为广泛。为提高吸附重金 属的能力，已将多种金属硫蛋白p 3 7 4 】和天然的或人工合成的金属结合肽1 7 5 7 6 ( 主要为富含组氨酸 和半胱氨酸的多肽) 转到微生物中得到表达，可以提高富集能力及抗性。硫代硫酸盐还原酶基因 转入到ec o l i 可以产生硫化氢而沉淀重金属1 7 ”。微生物的抗性和解毒基因也被转入植物中得到表 达，以提高植物修复能力。如细菌的汞还原酶m e r a 首先在酵母【，8 】然后在植物中【叫得到了表达， 释放的h g o 为原来的l o 倍。在利用微生物抗性基因提高植物的抗性上令人满意的研究结果较少， 但被认为有很大的研究前景。 2 4 研究前景 微生物与重金属的相互作用的研究已成为环境微生物学中的重要研究领域。从发展趋势来 看，今后的研究重点将会朝着生物净化技术的开发以及生物净化机理的深化两个方面发展，从而 充分发挥微生物在环境保护中的作用。1 发现更多的微生物菌种，深入了解微生物的组成结构、代 谢工程、遗传表达等内容，揭示微生物对重金属的吸附和富集机理。2 筛选具有专一吸附能力的微 生物和降低微生物培育的成本。研究提高微生物吸附特定重金属离子的能力及收集被吸附重金属 的方法。3 加强极端微生物的研究应用。极端微生物由于其特殊的生理机制，在环境保护中具有 极大的应用价值。4 利用有代谢活性的细菌作为金属离子的生物吸附剂，解决如何保证在废水化 学组成和浓度不断变化情况下，维持细菌的吸附活性。5 解决如何通过对环境介质中各生态因子 的有机调控，充分发挥微生物净化功能，实现微生物生态修复的更大功效。 3 实验目标 本实验的主要目标是筛选抗镉和富集镉的微生物，研究其去除镉的特性，及其与镉的相互作 用主要为富集和抗性机制，为利用微生物进行镉污染的修复奠定基础。 1 0 中国农业大学硕士论文 1 土样 材料与方法 采自河北省赤城县青羊沟闪锌矿周围，共1 1 个土样，分别采自矿池旁边( 1 号) 、矿池里边( 2 号) 过筛、矿池淤泥( 3 号) 、尾矿( 4 号) 、尾沙( 5 、6 号) 、污水沟旁土( 7 、8 、9 、1 0 、1 1 号) 。 其中1 、2 、3 号土样金属含量较高，有机质含