（植物学专业论文）乙烯和生长素对atacs4atacs5atacs7表达调控的研究.pdf

摘要 摘要 气体植物激素乙烯对高等植物的生长发育具有重要的调控作用，其生物合 成受到正向和负向两方面的调控。控制乙烯生物合成的关键酶是a c c 合成酶。 a c c 合成酶由多基因家族( m u l t i g e n ef a m i l y ) 编码，不同的发育、环境和激素 刺激等信号可以诱导不同组群的( d i s t i n c es u b s e t s ) a c c 合成酶基因的表达。 利用启动子一报告基因( 1 3 一葡萄糖醛酸酶，b e t a - g l u c u r o n i d a s e ，g u s ) 系统， 可以检测基因的表达模式。在实验室前期工作中，曾证实拟南芥多基因家族成 员a t a c s 4 ，a t a c s 5 ，a t a c s 7 对乙烯的响应方式不同，a t a c s 4 ，a t a c s 7 基因的 表达受乙烯自催化调控，a t a c s 5 基因的表达则不受乙烯影响。 本文中我们对乙烯受体突变体e t r l j 中的a t a c s 4 ，a t a c s 5 ，a t a c s 7 的表达 及激素响应情况进行进一步的深入分析，并将受乙烯自催化调控的 a t a c s 4 ：g u s ，a t a c s t ：g u s 转入其他的乙烯信号传导途径突变体和生长素信 号传导突变体中，初步探讨乙烯和生长素信号对a t a c s 4 ，a t a c s 7 的时空表达 模式的影响。 衬e t r l 1 组t a c s 4 ：g u s e t r l 1 组组c s 5 ：g u s ，e t r l 1 组t a c s 7 ：g u s 转基鼠 植物的的组织化学染色结果发现：在拟南芥生长发育的各个阶段以及花器官中， e t r l j 突变强烈抑制了a t a c s 7 的表达，轻微抑制了a t a c s 4 的表达，对a t a c s 5 的表达则没有影响。g u s 荧光活性测定的结果显示：在二周苗龄的光照苗中， 除了6 - b a 对三种a t a c s 基因没有影响外，其余的7 种植物激素或者激素前体 ( l a a ，a b a ，g a ，b r ，j a ，s a ，a c c ) 至少诱导了彳t a c s 4 ，a t a c s 5 ，a t a c s 7 中的一个基因表达，从而促使乙烯合成的增加。a c c ，a b a ，j a 诱导的a t a c s 4 的表达，l 执和a b a 诱导的a t a c s 5 的表达，以及g a ，a c c ，s a 和b r 诱导 的a t a c s 7 的表达都被e t r i j 突变所抑制。 此外，g u s 染色结果显示：乙烯受体基因e r s 2 突变对a t a c s 4 ，a t a c s 7 的表达影响不大；而乙烯信号途径组分基因e i n 2 突变对幼苗时期的a t a c s 4 ， a t a c s 7 的表达具有抑制作用，其中对a t a c s 7 的表达抑制程度仍小于e t r l 突变 对其的抑制。以上结果说明虽然a t a c s 4 ，a t a c s 7 的表达响应乙烯的自催化调 控，但并不是主要通过e r s 2 或e i n 2 介导的信号途径，并且其响应的信号途径 摘要 可能随生长发育阶段不同而变化。 生长素运输突变体a u x l 7 对幼苗时期的a t a c s 4 ，a t a c s 7 的表达也有抑制 作用，一定程度上揭示了生长素对乙烯合成的时空调控。 关键词：拟南芥a c c 合成酶乙烯突变体基因表达g u s 报告基因 n a b s t r a c t a b s t r a c t a m i n o c y c l o p r o p a n e 一1 - c a r b o x y l a t es y n t h a s e ( a c cs y n t h a s e ， a c s ) ( s a d e n o s y l l m e t h i o n i n em e t h y l t h i o a d e n o s i n e l y a s e ；e c4 4 1 14 ) ，t h ek e ye n z y m e f o re t h y l e n eb i o s y n t h e s i s ，i ss u b j e c t e dt op o s i t i v eo rn e g a t i v ef e e d b a c kr e g u l a t i o nb y t h eh o r m o n ei t s e l f w eh a v ep r e v i o u s l yd e s c r i b e d ，a i d e db yp r o m o t e r - g u s ( b g l u c u r o n i d a s e ) r e p o r t e ra p p r o a c h , t h a ta m o n gm e m b e r so ft h em u l t i g e n ef a m i l yo f a r a b i d o p s i sa c cs y n t h a s e ，a t a c s 4 ，a t a c s 5a n da t a c s 7g e n e se x h i b i td i f f e r e n t r e s p o n s e st oe x o g e n o u se t h y l e n et r e a t m e n t h e r ew er e p o r td i f f e r e n c e si nt h e i rd e v e l o p m e n t a le x p r e s s i o np r o f i l e sa n d h o r m o n er e s p o n s e sb e t w e e nw i l dt y p ea n de t r l - lm u t a n t s i tw a sf o u n dt h a tt h e s e t h r e ea c sm e m b e r sw e r ea l la c t i v e l ye x p r e s s e di n2 - w e e k - o l dw i l dt y p el i g h t g r o w n s e e d l i n g sb u te x h i b i t e dd i f f e r e n tp r o f i l e s i ne t r l 一1m u t a n t t h ee x p r e s s i o no f a t a c s 7 ：g u sd u r i n gt h ee n t i r el i f ec y c l eo fa r a b i d o p s i sw a sg r e a t l ys u p p r e s s e di n e t r l 1m u t a n tw h i l et h ee x p r e s s i o n so f a t a c s 4 ：g u sa n da t a c s 5 ：g u se x h i b i t e d1 1 0 s i g n i f i c a n tc h a n g e s t h ee f f e c t so fs e v e nm a j o rp l a n th o r m o n e sa n de t h y l e n e p r e c u r s o ra c c o nt h ep r o m o t e ra c t i v i t i e so ft h e s et h r e ea c s g e n e sw e r es t u d i e db y f l u o r o m e t r i cg u sa c t i v i t ya s s a y i tw a sf o u n dt h a te x o g e n o u st r e a t m e n to fl 认， a c c ，a b ao rj ai n c r e a s e dt h ep r o m o t e ra c t i v i t yo fa t ac s 4i n t h ew i l dt y p e b a c k g r o u n db u tt h ep r o m o t i o n sb ya c c ，a b aa n dj aw e r ea l m o s ta b s e n ti nt h e e t r l 一1b a c k g r o u n d b l o c ko ft h ee t h y l e n es i g n a l i n ga l s oa b o l i s h e db o t ht h ei a a a n d t h ea b a i n d u c e da t a c s 5 ：g u se x p r e s s i o n t h ea c s 7p r o m o t e rw a sr e s p o n s i v et o s i xm e m b e r so ft h ee i g h th o r m o n e s ( g a 3 ，a c c ，a b a ，j a ，s aa n db r ) ，a m o n g w h i c h , t h ei n c r e a s e sb yg a 3 ，a c c ，s aa n db rw e r ea b o l i s h e di nt h ee t r l 一1m u t a n t b a s e do nt h e s er e s u l t s ，t h er o l eo fe t h y l e n es i g n a l i n gi nr e g u l a t i n gr e s p o n s e so f a t a c s 4 ：g u s , a t a c s 5a n da t a c s 7 ：g u st od i f f e r e n th o r m o n e sw a sd i s c u s s e d f u r t h e r , t h ee x p r e s s i o n so fa t a c s 4 ：g u sa n da t a c s 7 ：g u sw e r ei n v e s t i g a t e d i nt w oo t h e re t h y l e n e i n s e n s i t i v em u t a n t s ，e r s 2 一ja n de i n 2 1 ，a n di na u x i ni n f l u x m u t a n ta u x l 7 i tw a sf o u n dt h a tt h ee x p r e s s i o np a t t e r n so fa t a c s 4 ：g u sa n d a t a c s 7 ：g u si na u x l - 7w e r es i m i l a rw i t ht h o s ei ne i n 2 1 ，r e s p e c t i v e l y , i n d i c a t i n ga i i i a b s t r a c t c r o s s - t a l kb e t w e e na u x i na n de t h y l e n ei nr e g u l a t i n gt h ee x p r e s s i o no ft h e s et w oa c s g e n e s k e y w o r d s ：a r a b i d o p s i s ；a c cs y n t h a s e ；e t h y l e n e ；m u t a n t ；g e n ee x p r e s s i o n ；g u s r e p o r t e r i v 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，同意如下 各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学 位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、扫描、数字化或其它手段保存 论文；学校有权提供目录检索以及提供本学位论文全文或者部分的阅览服务； 学校有权按有关规定向国家有关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在 不以赢利为目的的前提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术 活动。 学位论文作者签名： 汤1 雪奴 2 0 0g 年歹月砬日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签学位论文作者签 名：名： 解密时年月日 间： 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名： 勿雪奴 如g 年5n 砚日 第一章引言 第一章引言 第一节课题的研究背景 1 1 1乙烯的性质和功能 乙烯( c 2 i - 1 4 ) 是植物激素中结构最为简单的唯一的气态物质，影响着植物 生长发育的许多过程，如种子萌发、花与叶片的衰老、果实成熟、叶的脱落、 根表皮细胞命运决定、性别决定、细胞程序化死亡、对各种环境胁迫与病原体 袭击的响应等；由于其对果实成熟过程的调节作用，乙烯又被称为“成熟激素 【l 】。乙烯合成能力的丧失将导致遭受胁迫的植物死亡，过量乙烯的生成，将导致 植株矮化和早衰。当对黑暗生长的植株( 黄化苗) 用乙烯或其代谢前体1 一氨基 环丙烷一1 一羧酸( a c c ) 处理时，植株会表现出三重反应，即：抑制茎的伸长 生长、促进茎或根的增粗和使茎横向生长( 即使茎失去负向地性生长) 。三重反 应已经被公认为植物对乙烯做出应答的标志和用来筛选乙烯应答缺陷性突变体 眩3 】 o 控制乙烯的生物合成可以有效延缓植物花和果实的成熟与衰老，因而有重 要的商业价值。如抑制乙烯的产生可使许多重要农产品的运输和贮藏更为方便， 同时也延长了货架期，可以增值增效。随着植物生理生化及分子生物学研究的 深入，近年来对乙烯的生物合成途径及其基因工程的研究取得了一系列令人鼓 舞的成果，使之成为现代植物科学研究的热点之一。 1 1 2乙烯的生物合成途径 由植物体内的一部分蛋氨酸合成的s 一腺苷甲硫氨酸( s a m ) 是乙烯生物 合成的重要前体物质，它在a c c 合成酶的催化下合成一个重要的中间产物，1 - 氨基一1 羧基环丙烷一1 一羧酸( 1 - a m i n o c y c l o p r o p a n e - 1 - e a r b o x y l a t e , a c c ) ，它是 一种非蛋白氨基酸。乙烯由a c c 直接产生，其反应为：a c c + 0 2 譬 c 2 h 4 + c 0 2 + h c n + 2 h 2 0 。这里乙烯来源于a c c 的c 2 和c - 3 ，c 0 2 来源于羧基。 除了合成a c c ，a c s 也可催化合成m t a ( 甲硫基腺苷) ，然后m t a 又被转化 第一章引言 为蛋氨酸。这个途径可保证供给继续合成乙烯所需的甲基，而不需要蛋氨酸的 大量存储州。乙烯的生物合成反应如图1 1 所示。 i l l ； 阴，s c a r c a r c a - e r m e t l t c e m o n e s 抽gc ) l o k i n i n 舳i o t i 蝴嘲c 。8 。氓b r ， 嗨( _ 啦 e t h y l e n e 图1 1乙烯生物合成途径a d o m e t ：s 一腺苷酸甲硫氨酸；m e t ：甲硫氨酸；a c c ：1 氨基一 1 羧基环丙烷一1 一羧酸；m t a ：甲硫基腺苷。在转录水平或转录后水平调控各关键酶的因 素如图所示( c r i s t i a n ate ta 1 2 0 0 7 ) 但此反应过程中的中间产物并不只是乙烯一种产物的前体，它们还参与其 他反应，这也是乙烯合成受到多方面影响的一个可能的原因。下面简单说明一 下乙烯生物合成的前体的分流情况： s 一腺苷酸甲硫氨酸( s a m ) 的分流：一般认为a c c 的合成及转化是乙烯 生物合成的限速步骤，a c c 合成受阻是因为a c c 合成酶活性较低。但近来通过 基因工程手段降低番茄植株内s a m 含量也可显著减少a c c 合成，从而抑制乙 烯生成【5 】，这表明影响植物体内s a m 含量的因子，如s a m 的合成及分流也在 一定程度上影响乙烯合成。 a c c 的分流：a c c 是乙烯生物合成的重要中间产物，除此以外, a c c 可以转 化成n 丙二酰一l 一氨基环丙烷1 一羧酸( m a c c ) 及1 0 一l 一谷氨酰氨基 环丙烷1 羧酸) ( g a c c ) 嘲，还可以在a c c 脱氨酶作用下脱氨降解【1 7 1 。a c c 在a c c 酰化酶( m a c c 合成酶) 催化下与酰基c o a 反应生成m a c c ，可以降低游离 a c c 含量，从而减少乙烯生成。这过程可能是乙烯生物合成具自抑制作用的一 个原因。 1 1 3a c c 合成酶的生化特性 在乙烯的生物合成过程中，有三个重要的酶已被鉴定和研究，这三个酶是： 2 第一章引言 催化腺苷蛋氨酸形成的腺苷蛋氨酸合成酶( s a ms y n t h e t a s e ，s a m s ) ；催化s a m 生成a c c 的a c c 合成酶( a c cs y n t h a s e ，a c s ) ；a c c 氧化酶( a c co x i d a s e ，a c o ) 又称乙烯形成酶( e t h y l e n e - f o r m i n gd l z y m e ，e f e ) ，它催化a c c 形成乙烯。其 中控制乙烯生物合成的限速酶是a c c 合成酶( a c cs y n t h a s e ，a c s ) 瞄j 。 作为乙烯生物合成过程中的限速酶，在多种情况下，a c s 的活性限制了乙 烯的形成，同时它的活性也受到了乙烯及不同胁迫条件的调控，如l i c l 处理以 及伤害可以提高成熟番茄果皮内a c s 的水平【9 】，有实验证明高浓度的底物可以 降低酶的活性【lo 】。在体内有活性的a c s 酶极其不稳定，而且含量也很低，这说 明乙烯的生物合成是被严格控制的。 a c s 最早是在番茄的果皮组织中发现的。a c c 合成酶以单体或二聚体【l h 1 2 】甚至三聚体【1 3 】形式存在，其中以单体形式存在时活性最强 8 1 4 1 。对其突变体的 研究表明，a c s 是以二聚体的形式行使生理功能的。 a c c 合成酶结构中含有磷酸吡哆醛( p l p ) 基副1 5 】，它的活性位点和空间 折叠方式也与带有p l p 集团的氨基转移酶类似。各种a c s 的最大同源性部分是 在多肽的内部，酶的活性中心位于保守区域，该中心含有一个赖氨酸残基，这个残 基和结合辅酶p l p 、催化该酶反应并和参与依赖基质的酶钝化有关，而差异最大 的是在c 末端，这个结构域负责a c s 的磷酸化和转录后调控i l 酬。 根据c 末端保守序列的不同，拟南芥中的a c c 合成酶可以大致分为三类【l 7 j ( 图1 2 ) ：( 1 ) c 末端既含有三个可被丝裂原活化蛋白激酶6 ( m a p k 6 ) 磷酸 化的保守丝氨酸残基【l 引，又含有一个可被钙依赖钙调素不依赖的蛋白激酶 ( c d p k ) 磷酸化位点的保守丝氨酸残型1 9 加】；( 2 ) c 末端只含有可被c d p k 磷 酸化的保守丝氨酸残基；( 3 ) c 末端不含两种磷酸化位点。 第一章引言 卜 i = = 嚣。i 厂 二二三：! = 。i 斗【二二二：i l 二二竺：b ， 1 卅1 躅_ t 9 0 e2 _ t y p e3 i 图1 2 拟南芥( a r a b i d o p s i s ) 和番茄( l y e o p c r s i c o ne s e u l e a t u m ) e p a c s 蛋白进化树( 上) 及 三种类型a c s 蛋r 结构酗解( c f i s f i a n a te ta l2 0 0 7 ) 1 14月岱基因的克隆及其调控 第一个a c s 基因序列是1 9 9 0 年v a nd e rs t r a e t e n 等人从番茄果实的c d n a 文库中分离得到的l “1 。目前国际上已有五十多种a c c 合成酶基因从不同植物 中克隆出来，一般每一种高等植物至少有三至六个不同的a c c 合成酶基因。例 如：番茄的a c c 合成酶至少由十个基因编码p j ，分别响应番茄植株在对应诸如 淹水【2 们，果实成熟1 卸，创伤反应”1 等过程中所需要的乙烯台成反应。但是除了 拟南芥外，在植物界其他品种中，每种植物的基困组中到底存在多少个a c s 基 因还都不清楚。 a c c 合成酶基因在序列上均存在8 个保守区j ，并且与氨基转移酶基因家族 具有一定同源性 1 。不同成员编码区长度与序列略有差异，非编码区同源性则很 差【捌内含子数目并不保守1 2 3 】。从e d n a 克隆推断出的a c s 的一级结构表明不 一 第一章引言 同来源的酶分子量极为接近，在5 3 5 8 k d 之间。n o r t h e r n 印迹表明编码不同a c s 基因的m r n a 在1 8 2 1 k b 之间l 川。 十字花科植物拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 具有生育期短、基因组小、便 于转基因操作等特点，已被称为“模式植物 。拟南芥中一共有1 2 个a c s 同源 基因【2 9 】，a c s l - - 1 2 ，分布在5 条染色体上，但能催化合成a c c 的只有8 个。 a c s l 和a c s 3 在细菌或酵母的表达系统内没有相应的a c s 酶活性【3 们。这是因为 a c s l 丢失了一个高度保守的3 肽序列，t n p ( m a 踮一p r o ) ，而这个序列位 于活性位点附近，且可能对酶活性影响很大。a c s 3 被认为是一个假基因，它是 a c s l 的部分复制【3 1 1 。而通过对大肠杆菌氨基转移酶突变体d l 3 9 的研究表明 a c s l o 和a c s l 2 的编码产物是氨基转移酶【3 2 | 。 植物体内的a c c 合成酶由多基因家族编码，不同的发育、环境、刺激信号 诱导植物体内不同组群的a c c 合成酶基因表达。每一个多基因家族的成员表达 既具有特异性t n y 有所重叠【3 3 1 。例如：在拟南芥的根，叶，花，荚果，茎和黄花 苗中可以观察到a c s 转录本的表达阴3 5 3 6 】。以拟南芥的花为例，在萼片，花丝， 花柱中表达的为a c s 2 ，4 ，5 ，6 ，7 ，o ”_ 卅；在花梗中表达的为a c s 2 ，4 ，5 ， 8 ；在花粉囊中表达的为a c s 2 ，7 ，8 ；在柱头中表达的为a c s 5 ，9 ；a c s 5 和a c s 9 在花中的表达十分微弱，前者主要在柱头中表达，后者主要在萼片香毛簇中表 达。由此可见a c s 基因家族在花中的表达模式是不尽相同的。人们认为，这种 多家族基因的存在也许是为了使不同细胞或组织能够适应不同的生化环境【37 1 。 也就是说，每种酶的生理功能被其特有的生化性质所决定。 越来越多的证据证明，除了转录水平调节以外，转录后调控对a c s 活性调 节也具有非常重要的影响。序列分析表明，多种a c s 蛋白的c 末端都有一个 ( r k ) ( l v ) ( s ) - - - 肽保守域，在对拟南芥a t a c s 6 的研究中发现，a t m p k 6 通过一 种未知的机制磷酸化a t a c s 6 以增强其稳定性【3 8 】。对拟南芥乙烯过量合成突变体 的研究再一次证明了转录后调控的重要性。拟南芥体内的e t 0 1 基因负调控 a c s 5 蛋白活性及乙烯的生物合成【3 3 9 , 4 0 ，其编码的e t 0 1 蛋白直接作用于全长 的a c s 5 并抑制其活性，但不与截短的a c s 5 作用。e t o l 突变体产生过量乙烯 是由于其对a c s 转录后调控，现有数据表明可能的机制就是它增强了a c s 5 的 稳定性 4 1 1 。e t 0 2 j 是由一个单碱基插入造成a t a c s 5 c 末端氨基酸序列改变形成 的，而这一突变区域恰好包括了根据“三肽保守域 推测的a t a c s 5c 末端第 4 6 1 位丝氨酸磷酸化位点。e t 0 2 j 在m r n a 水平上没有什么改变，但是它的黄化 第一章引言 苗乙烯产量是野生型的2 0 倍左右，这说明增加的a c s 酶活性不是由于基因表达 的增加引起的，而是通过转录后调控造成的【4 2 | 。e t 0 3 经研究表明是由于在a c s 9 的c 末端的单碱基突变而造成的，但它并不会影响a c s 9 的特异催化活性，可 能也是通过延长蛋白稳定性以生产过量乙烯。以上结果说明，a c s 在体内稳定 性不高，很容易降解，所以a c s 蛋白的稳定性在调节乙烯生物合成方面具有重 要作用，而c 末端又在很大程度上影响着蛋白的稳定性。 第二节课题的提出 1 2 1乙烯的自我反馈调控 尽管乙烯在植物体内的含量很低，几乎所有的植物器官都具有合成乙烯的 能力。不同的发育事件如萌发，叶片和花的衰老，脱落以及果实成熟都能诱导 乙烯的合成；不同的外界刺激如伤害胁迫，病原体侵害，淹水，干旱，缺氧， 温度变化，物理承重，臭氧之类的有害化学物质同样可以引起植物体内乙烯水 平的增加【5 0 5 1 1 。响应各种刺激而诱发乙烯合成的增加是乙烯调控的各种级联反 应中的一个普遍步骤，这一能力的丧失导致遭受胁迫的植物死亡【5 引。 乙烯在植物体内的生物合成受到严格自我正向和负向两方面的反馈调控， 分别称为自催化和自抑制调拶弱j 。 根据果实成熟过程中乙烯生成量的变化有人提出第l ( 自抑制) 系统乙烯和 第2 ( 自催化) 系统乙烯的概念，不同的a c c 合成酶可能参与不同系统的乙烯 生物合成瞰，5 5 1 。第1 系统乙烯是指具有呼吸跃变的果实在呼吸跃变前 ( p r e - c l i m a c t e r i c ) 所产生的基础水平的少量乙烯；随着果实成熟，伴随呼吸跃 变产生的大量乙烯称为第2 系统乙烯。至今为止，已经有多个第二系统乙烯合 成的a c s 基因被克隆，而l ea c s 6 是目前报导唯一一个可能参与第一系统乙烯 合成的番茄a c c 合成酶【5 6 | 。 近年来杨祥发研究小组在此基础上提出了第1 系统乙烯和第2 系统乙烯在 果实成熟过程中的作用模型 5 7 】。在番茄果实成熟过程中，a c c 合成酶l e a c s 2 和 l e a c s 4 基因的表达导致第2 系统乙烯的显著增加，这2 个基因的转录本分别在呼 吸跃变前和呼吸跃变过程中迅速累积，而且可以在成熟绿果中被低量乙烯诱导 表达，其中，l e a c s 2 基因转录本在呼吸跃变过程中的累积量是l e a c s 4 的l o 倍 6 第一章引言 之多。目前，人们普遍认为l e a c s 2 和l e a c s 4 基因的表达是导致番茄果实呼吸 跃变和果实成熟过程中产生大量乙烯( 第2 系统乙烯) 的主要原因。这一论点已 被反义r n a 技术所证实：反义l e a c s 2 转基因的番茄果实如不经外源乙烯处理 则无法成熟。 与此相反，目前对于第l 系统乙烯生成的调节及其在果实成熟过程中的作 用都了解甚少。1 9 9 7 年杨祥发实验室从番茄中克隆到一个新的a c c 合成酶 l e a c s 6 的e d n a 5 8 1 ，最近，n a k a t s u k a 等发现这一a c c 合成酶可能参与第一 系统乙烯的合成：l e a c s 6 m r n a 在番茄绿果中累积但在果实成熟过程中消失， 以乙烯结构类似物处理可以抑制l e a c s 6 基因在绿果中表达，而乙烯作用抑制剂 则可诱导该基因在成熟番茄果实中表达【5 6 1 。这说明在番茄果实中第l 系统乙烯 和第2 系统乙烯的合成是分别通过对特定的a c c 合成酶基因的负向和正向反 馈控制来调节的。在系统1 和系统2 乙烯形成过程中，a c s 基因存在着差异表 达。在番茄绿果和营养组织中l e a c s 6 和低水平l e a c s i a 基因表达很可能调控 着系统1 乙烯的形成。 多数植物激素能够通过乙烯合成限速酶a c s 基因的响应来影响乙烯在植物 体内的合成。这些植物激素作用的完全发挥有赖于乙烯响应途径的介导。而乙 烯自调控机制的存在和其表达的时空特异性使得这一机制更加复杂。如外源生 长素可在转录水平诱导大多数a c s 基因【5 9 删，在一些生长素调控的a c s 基因中， 多种顺式作用因子a u x r e s ( a u x i nr e s p o n s ee l e m e n t s ) 也得到鉴定。在根中，尽 管多数a c s 转录本在队a 处理后上升，但其空间上的表达模式不刚6 1 】。a c s 8 的表达主要扩增在侧根根冠第二层细胞，表皮细胞和原生木质部内；a c s l l 则是 在根中分生区所有细胞内。但是，生长素信号对乙烯合成的时空调控特异性机 制，这些a c s 基因的表达是直接还是间接通过乙烯自调控机制响应生长素信号， 某一个a c s 基因的表达所引发的乙烯的生成对其他a c s 基因的表达具有怎样的 影响都是仍待研究的。 1 2 2乙烯信号传导路径及植物激素之间的交叉作用 乙烯的特异的三重反应使得乙烯突变体的筛选变得便利，也使乙烯的信号 传导途径在过去的十几年中取得了突破性的进展，建立了从乙烯信号感知到转 录调控的线性信号转导模型。 7 第一章引言 乙烯在辅助因子铜的作用下可与定位在内质网膜上的乙烯受体家族成员包 括e t r i 、e t r 2 、e r a 2 、e r s 2 和e i n 4 结合f 6 2 1 ，乙烯受体家族成员在结构上与 细菌和真菌中存在的双元组分系统类似。在此过程中一个pt y p ea t p a s e r n a l 起l 转运亚铜离子的作用，在亚铜离子存在的情况下受体才有功能啷】。最 近的研究结果表明，一个进化上保守的蛋白r t e i 对乙烯受体e t r i 的功能非常 重要，但其牛化功能未知。叫。遗传分析表明乙烯与受体结合能使其失活，而在 缺乏乙烯的情况下活化的受体激活下游类似于r a f 的丝苏蛋白激酶c t r l1 6 5 。 c t r l 的存在暗示了m a p 激酶级联参与乙烯信号转导过程。s a n - d o n g y o o 等的 研究证实在乙烯信号传导途径中存在具有双重作用的m k k 9 - m p k 3 6 链 6 6 1 。在 没有乙烯存在时c t r i 直接或间接使m k k 9 一m p k 3 6 链失活，m k k 9 m p k 3 6 链下游m a p k s 磷酸化下游的核转录因子e i n 3 上的t 5 9 2 伉点从而导致了e i n 3 的降解。而被乙烯活化的c t r i 澈括了m k k 9 m p k 3 6 链，m k k 9 m p k 3 6 链通 过磷酸化e i n 3 上的”7 4 位点使其稳定。e i n 2 、e i n 3 e i l s 、e i n 5 和e i n 6 位于 c t r 下游，是乙烯信号途径的正调控因子m , 6 s , 6 9 。两个f - b o x 蛋白e b f i 和e b f 2 通过泛素2 6 s 蛋白体降解途径调控e i n 3 的稳定性 7 0 , n j 2 】。5 一3 的外切核酸酶 e i n 5 通过启动e b f l 和e b f 2m r n a 的降解拮抗e b f l 和e b f 2 对e i n 3 的负 反馈调控。 m 。二。一曙意焉寸、 。9 0 i 刚l4 乙烯信号传导途径( s a n g d o n g y o o na l2 0 0 8 ) 第一章引言 随着多种植物激素信号传导途径研究的突破性的进展，已有多种植物激素 信号传导组分，例如受体、信号传导中间体( 如特殊的蛋白激酶和磷酸酶) 、下 游转录调控因子等被克隆和鉴定。但是这些单一路径和、或组分的鉴定，还远 远不能描绘出各大类不同植物激素共同协调控制完整的植物生长发育过程的整 体机制。因为，虽然每个不同的植物激素都有自己独特的信号传导机制，但是 其传导路径上某一特殊组分的变化，往往会影响到除自身以外，多于一种的其 他激素。乙烯受体e t r l 的突变降低了拟南芥根系对外源a b a 的敏感性，同时， 却能够增加拟南芥种子对外源a b a 处理的敏感性【7 3 1 ；另一受体e i n 2 的突变导 致突变体对外源细胞分裂素的不敏感性，推测原因可能为e i n 2 的突变阻断了细 胞分裂素对乙烯合成代谢的调控【。搠；而生长素反应基因a x r l 编码r u b 复合物 的活化酶，后者可以修饰多种信号传导途径的中间组分，a x r l 的突变对生长素、 茉莉酸、a b a 参与的多种调控过程都有重要影响【7 5 1 。这些研究结果暗示：在整 个高等植物的生长发育过程中，多种不同植物激素可以在不同层次上发生相互 作用，从调控生物合成、到共享信号传导途径的某些特殊组分，进而形成相互 调控的“节点( n o d e s ) 和网络【7 6 】( g a z z a r r i n i 等，2 0 0 3 ) 。对不同激素间相互作 用( c r o s s t a l k ) 的分子机理的研究成为近年来植物激素研究领域的热点。 第三节课题的研究目的及意义 在整个高等植物的生长发育过程中，多种不同植物激素可以在不同层次上 发生相互作用，从调控生物合成、到共享信号传导途径的某些特殊组分，从而 共同调控植物的生长发育。气体植物激素乙烯对高等植物体的生长发育具有重 要的调控作用，在这些调控过程中，乙烯与其它激素相互作用机制的研究，是 了解植物体如何利用各大激素协调均衡整体发育的重要方面。 近年来，乙烯信号传导途径的研究取得了突破性进展。但是相应于不同的 发育或刺激信号而启动的不同的乙烯信号传导途径、和特定的传导途径所作用 的关键a c c 合成酶这两个重要过程的分子机制还不清楚。在这个大的范围之内， 建立不同植物激素通过a c c 合成酶介导的对乙烯生物合成途径的调控网络是一 个重要课题，虽然近年来有某些激素信号传导单一组分的突变导致乙烯合成水 平变化的报道，但是现阶段这方面整体水平的研究，尤其是调控网络的建立， 还几乎处于空白状态。 9 第一章引言 在上述理论分析和研究工作的基础上，本课题提出从乙烯合成自我调控机 制入手，检测乙烯受体突变体e t r l j 背景下a t a c s 4 ，a t a c s 5 ，a t a c s 7 启动子 驱动的报告基因g u s 在转基因拟南芥整体发育和不同激素刺激条件下的表达模 式，以确定乙烯信号途径的阻断对这三个a c s 基因的表达模式和激素响应的影 响；同时利用遗传杂交的方法将已经确定受乙烯自催化调控的a t a c s 4 ：g u s ， a t a c s 7 ：g u s 分别转入乙烯信号传导突变体( e t r l j ，e r s 2 一j ，e i n 4 - 1 ) 及生长素 运输突变体( a u x l 7 ) 中，检测在相应突变体背景下，这两个a t a c s ：g u s 基因 的时空表达特异性。这些研究成果的取得，对于深入探讨乙烯合成的自调控机 制、以及乙烯与不同激素之间在调控乙烯合成过程中的相互作用机制具有重要 意义。 l o 第二章材料与方法 第二章材料与方法 第一节实验材料 2 1 1植物材料 植物材料拟南芥( a r a b i d o p s i s t h a l i a n a ( l ) h e y h n ) ，生态型为“c o l o m b i a ， 取自拟南芥生物资源中心( a r a b i d o p s i sb i o l o g i c a lr e s o u r c ec e n t e r ) 。 各种突变体种子及与其相对应的野生型种子( 突变体种子e t r l j ，e r s 2 一j ， e i n 2 j 来自美国a b r c ) ； 表2 1各突变体特点，背景及对应野生型 2 1 2植物激素 表2 2 植物激素 第二章材料与方法 抗生素英文全称 缩写溶剂工作浓度供货商 ( r a g l ) 2 1 4工具酶 用于p c r 的d n a 聚合酶购自上海 i ( s a n g o n ) 牛_ 物工程公司。用于载体 构建的d n a 聚合酶( e x t a q ，p f u b ，f t a q ) 购自大连宝生物( t a k a r a ) 公一2 0 。c 保存 备用。 2 2 1转基因植物的鉴定 第二节实验方法 不同突变体背景下转基因植物的杂交及筛选纯合体流程见( ( a r a b i d o p s i s ：a l a b o r a t o r ym a n u a l ) ) 。 1 2 第二章材料与方法 2 2 1 1 表型鉴定 乙烯信号传导路径相关突变体的鉴定：突变体种子经过消毒后转入暗培， 种子萌发后注射l o p p m 乙烯，观察三重反应。或种子消毒后，直接铺在含 1 0 1 a m a c c 的1 2 m s 培养基上，种子萌发后三天观察三重反应。 生长素信号转导路径相关突变体的鉴定：突变体种子经过消毒后，均匀铺 在1 2 m s 培养基上。4 下处理2 3 天。光照下培养一周，选取生长一致的苗铺 于垂直板中，观察根长变化。 2 2 1 2 分子鉴定 核d n a 的提取按照分子克隆( 第二版) 方法。 以核d n a 为模板的p c r 检测引物为： a c s 4 s ，5 - a c gg a t c c gt t ac t tt r ca a at c t t c c c t c - 3 ； a c s 5 s ，5 - a c gg a tc c ag g ga g ca t a a a tg g t c c ta r t - 3 ； a c s 7 s ，5 - a c gg a tc c a g t gt a a a t gg a t a g cc a cc c a 3 ； p g u s l ：5 t c gc g at c ca g ac t g a a tg c c 一3 p c r 反应体系： 试剂用量 灭菌双蒸水3 9 6 肛l e xt a qd n a p o l y m e r a s e10 xr e a c t i o nb u f f e r 5 p l d n t p ( 1 0 m m ) 1 “l a c s 4 s a c s 5 sa c s 7 s 1p l p g u s l1 i l l e xt ad n a p o l y m e r a s e ( 2 u 1l)04pl 核d n a 2 “l p c r 反应程序： 9 4 5 m i n ： 1 3 第二章材料与方法 蓁58兰。c3 0 l m s i n ：) 3 2 l m i n 3 0 s 个循环 ： 个循环 7 2 j 2 2 。2 植物材料的激素处理 2 2 2 1植物材料的选择 在1 2 m s 固体培养基( 5 0 m g l 潮霉素，0 7 a g a r ，p h 5 7 ) 平板上平铺一 张滤纸，把消毒后的转基因拟南芥种子均匀涂布在滤纸上。光周期1 6h r 光8l l f 暗，温度2 2 4 - 1 状态下萌发生长2 周后进行激素处理，相同生长状态的野生 型拟南芥幼苗作为负对照。 2 2 2 2 植物激素对拟南芥的处理 分别用含有2 0 p m6 - b a 、2 0 “mi a a 、2 0 p mg a 3 、1 0 01 t ma b a 、2 0l a m a c c 、4 1 a mb r 、5 0 “mj a 或0 5 m ms a 的1 2 m s 液体培养基( p h 5 7 ) 浸润 生长有转基因拟南芥幼苗的滤纸进行处理，激素处理2 4 小时后立即进行g u s 荧光活性的测定。用不含激素的1 2 m s 液体培养基( p h 5 7 ) 同时处理作对照。 试验重复3 - - 5 次，所有处理均在光周期1 6l l r 光8l l r 暗，温度2 2 1 条件下 进行。 2 2 2 3 转基因植物的g u s 组织化学染色 g u s 染色参照b l u m e 和g r i e r s o n 的方法【7 7 】进行。转基因m i c r o t o m 的染 色时间为4 小时左右，转基因拟南芥的染色时间为5 小时左右。 将材料的染色结果使用e p s o np e r f