（微生物学专业论文）兰科菌根真菌与植物专一性关系研究.pdf

摘要 摘要 兰科是高等植物中最大科之一，菌根真菌对于自然状态下兰科植物完成正常的生活 史具有不可替代的作用。深入开展兰科植物共生菌根真菌的研究，全面系统的研究兰科 植物与其共生菌根真菌专一性关系已经成为兰科菌根众多相关研究中最热最重要的内 容，然而国内对这方面研究工作的关注程度不够，报道零星，不成系统。本研究对我国 具有代表性兰科植物的菌根真菌进行了分离，根据形态学特征进行了初步鉴定，并通过 r d n ai t s 序列分析，初步探讨了兰科植物与其共生菌根真菌的专一性关系。本论文的 研究归纳如下： 1 从不同地理分布、不同种类的野生兰科植物共4 7 株中，分离获得菌根真菌共5 3 l 株，并将这些菌根真菌菌株初步鉴定为兰科共生丝核菌。 2 形态学方法结合r d n ai t s 序列分析这一分子生物学手段将从独花兰 ( c h a n g n i e n i aa m o e n a ) 、金佛山兰( t a n g t s i n i an a n c h u a n i c a ) 中分离获得的菌根真菌鉴 定为胶膜菌属( t u l a s n e l l a ) 真菌，两种方法的鉴定结果互相参考，表明i t s 技术应用于 独花兰、金佛山兰等珍贵的非中国兰属的兰科植物菌根真菌的分类鉴定研究中显示出很 好的适用性。 3 对自湖北、安徽和浙江野生春兰( c y m b i d i u mg o e r i n g i i ) 、蕙兰( c y m b i d i u m f a b e r i ) 、 独花兰和金佛山兰中分离获得的菌根真菌共1 5 9 株进行了r d n ai t s 序列测定、比较、分 析。i t s 序列比对和聚类结果初步揭示了在共生专一性关系上的内在规律： ( 1 ) 胶膜菌属( t u l a s n e l l a ) 真菌可能趋向于与地生类型兰科植物共生； ( 2 ) 分离浙江同一地区春兰、蕙兰所获得菌根真菌二者在物种因素上具有专一性 关系； ( 3 ) 分离获得的菌根真菌与其共生春兰存在地理分布因素相关的显著专一性，蕙 兰则相对薄弱； ( 4 ) 自同一春兰或蕙兰植株的同一根段中分离获得的菌根真菌菌株具有丰富遗传 多样性，且不同兰花种类，不同地区，不同根段中获得的菌根真菌多样性程度有所差异。 关键词兰科菌根菌根真菌r d n ai t s专一性丝核菌属 a b s t r a c c a b s t r a c t o c r h i d a c e a ei so n eo ft h el a r g e s tf a m i l i e si nh i g h e rp l a n t s t h e r ea r es om a n ys c i e n t i s t s w h oa r ei n t e r e s t i n gi no r c h i dm y c o r r h i z a lf o ri t sv i t a lf u n c t i o no ft h en a t u r a lg r o w t ho f o c r h i d a c e a e t h es p e c i f i c i t yr e l a t i o nb e t w e e no r c h i d sa n dt h e i rs y m b i o t i cf u n g ih a sa l w a y s b e e nar e s e a r c hh o ts p o ti no r c h i dm y c o r r h i z a ls t u d yf i e l d sw h i l ed o m e s t i cr e s e a r c hw o r ki n t h i sa r e ai su n s y s t e m a t i c t h i ss t u d yh a si s o l a t e dm y c o r r h i z a lf u n g if r o mt y p i c a lo r c h i d a c e a e o fc h i n a ，i d e n t i f i e dt h e mb o t hb yt r a d i t i o n a lc l a s s i f i c a t i o nm e t h o do fm o r p h o l o g ya n dr d n a i t ss e q u e n c ea n a l y s i so fm o l e c u l a rb i o l o g yt e c h n i q u e sa n ds t u d i e dt h es p e c i f i c i t yr e l a t i o n b e t w e e no r c h i d sa n dt h e i rs y m b i o t i cf u n g ip r e l i m i n a r i l y r e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 513m y c o r r h i z a lf u n g ih a si s o l a t e df r o m4 7o r c h i d so fd i f f e r e n td i s t r i b u t i o n sa n d d i f f e r e n ts p e c i e s a l ls t a i n sh a v ei d e n t i f i e da sg e n e r a l i z e dr h i z o c t o n i af u n g ia c c o r d i n gt o t r a d i t i o n a lc l a s s i f i c a t i o nm e t h o do fm o r p h o l o g y 2 m y c o r r h i z a lf u n g iw h i c hh a si s o l a t e df r o mc h a n g n i e n i aa m o e n aa n dt a n g t s i n i a n a n c h u a n i c ai si d e n t i f i e da st u l a s n e l l ab yb o t ht r a d i t i o n a lc l a s s i f i c a t i o nm e t h o do f m o r p h o l o g ya n dr d n ai t ss e q u e n c ea n a l y s i so fm o l e c u l a rb i o l o g yt e c h n i q u e s 3 r d n ai n t e r n a lt r a n s c r i b e ds p a c e r ( r d n ai t s ) a n a l y s i sh a su s e dt of i n dt h ed i v e r s i t y a m o n g15 9m y c o r r h i z a lf u n g iw h i c hh a si s o l a t e df r o mc y m b i d i u mg o e r i n g i i ，c y m b i d i u m f a b e i ，c h a n g n i e n i aa m o e n aa n dt a n g t s i n i an a n c h u a n i c ai nz h e j i a n g ，h u b e ia n da n h u i p r o v i n c ea n dp r e p a r a t o r yr e s e a r c ha b o u tt h es p e c i f i c i t yr e l a t i o n s h i pb e t w e e nm y c o r r h i z a e a n do r c h i d sh a sm a d eb a s e do nr d n ai t sa n a l y s i s ( 1 ) t u l a s n e l l am i g h tb et h em o s tg e n e r a ls p e c i e sw h i c hc a nd e v e l o ps y m b i o s i s r e l a t i o n s h i pw i t ht e r r e s t r i a lo r c h i d s ( 2 ) m y c o r r h i z a lf u n g iw h i c hh a si s o l a t e df r o mc y m b i d i u mg o e r i n g i i ，c y m b i d i u m f a b e ii n z h e j i a n g p r o v i n c eh a v ea n o b v i o u s l yc o r r e s p o n d i n gs y m b i o t i cs p e c i e ss p e c i f i c i t y r e l a t i o n s h i p ( 3 ) c y m b i d i u mg o e r i n g i ia n dt h e i rm y c o r r h i z a lf u n g ih a v ea no b v i o u s l yc o r r e s p o n d i n g l y s y m b i o t i cs p e c i f i c i t yr e l a t i o n s h i pi n f l u e n c e db yt h es i t ew h e r eo r c h i d sd i s t r i b u t ( 4 ) t h e r ei sar i c hd i v e r s i t ya m o n gm y c o r r h i z a lf u n g iw h i c hw e r ei s o l a t e df r o mt h es a m e r o o to fc y m b i d i u m f a b e r i k e y w o r d s o r c h i dm y c o r r h i z a l m y c o r r h i z a lf u n g i r d n ai t s s p e c i f i c i t y r h i z o c t o n i a l i 河北大学 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教 育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。 作者签名：日期：盟年 月上日 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存 论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年月日解密后适用本授权声明。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方格内打“) 保护知识产权声明 本人为申请河北大学学位所提交的题目为星铆溺黝寺雠以绝毖勾纪 的学位论文，是我个人在导师甑山铹样旨导并与导师合作下取得的研究成果， 研究工作及取得的研究成果是在河北大学所提供的研究经费及导师的研究经费 资助下完成的。本人完全了解并严格遵守中华人民共和国为保护知识产权所制定 的各项法律、行政法规以及河北大学的相关规定。 本人声明如下：本论文的成果归河北大学所有，未经征得指导教师和河北大 学的书面同意和授权，本人保证不以任何形式公开和传播科研成果和科研工作内 容。如果违反本声明，本人愿意承担相应法律责任。 声明人： 作者签名： 趟聋 日期：丛年上月上日 导师签名： 建主垒魏逮日期：- ! 乙年上月上日 引言 引言 在植物界中，高等植物中最大科之一兰科( o c r h i d a c e a e ) ，全世界范围约有7 0 0 属、2 0 0 0 0 种以上，广泛分布于温带、亚热带及热带的广大区域，其中有1 7 4 属1 2 0 0 余种( 未包括科下大量变种和品种) 产于中国。许多种类兰科植物可作观赏和药用，因 而具有重要科学价值和经济价值。兰属( c y m b i d i u m ) 在中国分布种类占全球5 0 以上 ( 约3 0 - - 4 0 种) ，包括地生、附生和腐生多种生态类型【l 】。春兰( c y m b i d i u mg o e r i n g i i ) 、 蕙兰( c y m b i d i u m f a b e r i ) 是中国较为广泛分布的地生类型兰属植物中的代表性种类；也 是我国具有悠久栽培观赏历史的重要种类，由其野生植株中培育获得了许多优良品种。 因此，春兰、蕙兰不仅具有很高的经济价值，而且对于开展我国兰科植物系统发育、兰 科菌根真菌等研究具有重要的代表性和学术意义【2 1 。 兰科植物具有巨大的经济价值和开发潜力，然而，兰科植物的种子非常细小( 只有 未分化的原胚) ，在自然条件下不能正常萌发；根粗大但根毛不发达，不能满足植物体 对水分和营养物质的需求【3 】，兰科植物这样的生理特性成为阻碍其在花卉产业和科研领 域发展的瓶颈。兰科植物只有与特定的真菌形成稳定的共生关系，通过菌根真菌为其生 长发育提供必需的营养物质，才能完成种子萌发并生长为健康的成年植株。这种特殊的 共生结构就是菌根【4 】。兰科植物和真菌形成的菌根具有独有的特征，被独立划分为“兰 科菌根”【5 】。 r e s s i e k 首次报道了鸟巢兰的菌根结构，并确认在鸟巢兰根部细胞中有真菌菌丝体存 在【6 】，之后对于各种兰科植物与内生真菌形成的菌根结构不断有研究者进行研究。前期 较为全面和深入的对菌根形态结构、菌丝侵入兰科植物根或根状茎皮层的机制及菌丝体 在皮层的定殖形式等方面进行了研列7 以0 1 。b e r n a r d 等人最早从兰科植物分离获得菌根真 菌，探讨了真菌在兰科植物种子萌发中所起的作用，表明，兰科植物种子在没有内生真 菌的协助下是不能完成萌发过程的”1 2 】。直至b e r n a r d 提出在种或属的水平上兰科植物总 是与特定种类的菌根真菌共生，即存在兰科植物与菌根真菌的共生专一性关系，并由此 引发学者对这一问题的关注和深入研究，一系列的研究成果不断见诸报导。因此，深入、 全面、系统的研究兰科植物与共生菌根真菌的专一性关系已经成为兰科菌根众多相关研 究中最热最重要的内容。 河北人学理硕十学伊论文 随着分子生物学技术的发展，及其在兰科菌根真菌研究中越来越广泛的运用，中国 的研究者逐渐丌展了对于我国广泛分布且特有的地生类型兰科植物( 侧重于兰属) 的共 生菌根真菌研究 1 5 - 1 6 】，但由于选材分散，样本数量有限，没能充分综合考虑植物分类 等级、地理分布和生态类型等，使研究缺乏系统性，因此无法为两者的专性关系提供 确凿充实、全面系统的数据，难以获得令人信服的结论。 2 第1 章文献综述 第1 章文献综述 1 1 兰科菌根与菌根真菌 1 1 1 兰科菌根的形成 兰科菌根( o r c h i dm y c o r r h i z a ) 属于内生菌根类型，菌根真菌菌丝通过侵染种子和 侵染根这两种途径侵染定殖到细胞内，最终形成菌根【1 7 】。途径一：通过种子侵染。当种 子萌发后形成原球茎时，菌丝侵染原球茎细胞，外皮层形成菌丝团，内皮层的菌丝被消 化。途径二：通过根侵染。兰科植物菌根真菌可以通过破坏根外皮层薄壁通道细胞、破 坏根被组织、破坏根外皮层细胞三种方式侵染根皮层细胞，形成内生菌根。1 9 7 2 年h a d l e y 在兰科植物根毛细胞中观察到有真菌菌丝分布【8 】。潘超美对野生建兰菌根的研究表明， 几乎所有成年根都受过真菌的侵染，菌根真菌主要侵染位于根毛区，很少侵染根尖和新 生根【1 8 】。丁晖等研究卡特兰菌根结构的发现，证明了菌根真菌可以由根部的外皮层薄 壁通道细胞侵染根皮层组织细胞【1 9 】，范黎及e s n u a l t 在墨兰等其他兰科植物中也观察到了 同样情况【2 0 圳】。我们通常认为，兰科菌根形成的标志是兰科植物的根皮层细胞中出现菌 丝斟2 2 1 。 1 1 2 兰科菌根的特征 兰科菌根与其他类型菌根( 外生菌根、丛枝菌根) 相比具有明显特征。兰科菌根与 外生菌根的区别在于，兰科菌根的根表面不形成菌套，菌丝定植于细胞内，很少存在于 根皮层的细胞间隙，不形成哈蒂氏网。被兰科共生菌根真菌侵染并形成菌根的组织与未 被兰科菌根真菌侵染的植株根部组织在外观形态上没有显著差异，只有通过显微镜观察 其内部才能发现真菌的侵染。兰科菌根与丛枝菌根的区别在于兰科菌根真菌菌丝有隔， 菌丝团集中分布在兰科植物根部外皮层细胞内，呈螺旋状扭曲状，且兰科菌根真菌可以 分离并实现纯培养。 1 1 3 兰科茵根真菌的生物学作用 兰科植物从萌芽到长成，期间必须与菌根真菌形成稳定的共生关系，通过菌根真菌 获得生长必需的营养等。众多研究表明，兰科菌根真菌对于兰科植物具有重要的生物学 作用。其生物学作用主要表现为以下几个方面： 3 河北人。z 理。学硕十学何论文 兰科菌根真菌促进兰科植物种子萌发。兰科菌根真菌促进了兰科植物种子内部的糖 异生作用并利用贮藏的营养物质在其丌始光合作用前持续提供营养物质。l a w r e n c e 等从 地生兰p l a t a n t h e r ac l a v e l l a t a 的根中分离获得菌根真菌，并在此基础上与该兰科植物种子 进行共生萌发实验，以播种一年后的发芽率来评估结果。实验表明从该地生兰获得的其 中一种菌根真菌( e p u l o r h i z as p p ) 可极大地促进种子萌发，发芽率达7 6 4 8 1 5 【2 3 1 。 兰科菌根真菌为原球茎持续生长提供营养物质，从而促进其生长发育，成为完整的 植物体。研究者用从云南野生卡特兰中分离获得并初步鉴定为丝核菌属的3 个菌株接种 于中国台湾卡特兰组培苗，分别使这些组培苗鲜重增i j h 6 7 5 ，6 7 3 和6 2 4 ，表明这 几株菌株在不同程度上促进了卡特兰组培苗的生长【”】。 此外，兰科菌根真菌还能提高兰科植物抵抗病害的能力。这是因为菌根真菌侵染兰 科植物根皮层细胞形成菌根后，菌丝团在根皮层细胞内定殖并最终被消化，这种消化作 用控制了菌根真菌侵入兰科植物根部的速度，阻止真菌对幼苗产生病害，而且菌根真菌 还能够通过分泌代谢产物和在侵染宿主的过程中引起兰科植物应激反应从而促进其形 成有效的抗病机制。 兰科菌根真菌通过侵染到植物根部外皮层细胞的真菌菌丝的消化作用向兰科植物 提供营养。该途径为兰科植物提供碳源、维生素b 1 、维生素前体、对氨基苯甲酸( p a p b ) 、 氨基酸、植物激素等生长所需的多种元素【2 4 】。许多研究发现都支持以上说澍2 5 之7 1 。 随着研究的发展，2 0 0 7 年t e d e r s o o 的研究涉及兰科植物与其共生菌根真菌的平行进 化关系，用同位素1 5 n 标记菌根真菌，同样发现1 5 n 通过某种途径从菌根真菌转移到了植 物体内，从而证实兰科植物依靠与其共生的真菌获得必要的氮源【7 8 】。 1 2 兰科菌根真菌分离鉴定研究 1 2 1国外兰科菌根真菌分离鉴定研究 国外对兰科菌根真菌的分离鉴定研究开展较早，从多种兰科植物中分离获得了大量 菌根真菌，所获得的菌根真菌都属半知菌( d e u t e r o m y c o t i n a ) 范畴，1 9 0 9 年b e r n a r d 从兰 科植物中首次分离获得3 种共生丝核菌的纯培养并对他们进行了简单描述，命名为 r h i z o c t o n i am u c o r o i d e s 、r h i z o c t o n i ar e p e n s 和r h i z o c t o n i al a n u g i n o s a 2 8 】。c a t o n i 于19 2 9 年 从兰科植物c y p r e p e d i u mr 扣分离获得真菌，成功诱导形成了子实体，并鉴定这个菌根真 菌为伏革菌属( c o r t i c i u m ) ，命名为c o r t i c i u mc a t o r i i o 2 9 】。 4 第1 章文献综述 1 9 8 7 年m o o r e 的工作在兰科菌根真菌分离鉴定研究中具有里程碑意义，他依据菌丝 隔膜与细胞核数目为分类特征在兰科共生丝核菌属基础上增加了3 个无性态新属，分别 为角菌根菌属( c e r a t o r h i z ) 、念珠菌根菌属( m o n i l i o p s i s ) 、瘤菌根菌属( e p u l o r h i z a ) ， 他们对应的有性态属分别为胶质菌类角担菌属( c e r a t o b a s i d i u m ) 、蜡壳菌属( s e b a c i n a ) 、 胶膜菌属( 死伽以p a ) ，均为担子菌门层菌纲【3 0 1 。 c u m a h 和z e l m e r 首次编订了兰科菌根真菌检索表，涵盖截至1 9 9 2 年已发现的兰科菌 根真菌1 5 个属( a r m i l l a r i a ，c e r a t o b a s i d i u m ，c e r a t o r h i z a ，e p u l o r h i z a ，e r y t h r o m y c e s ， f a v o l a s c h i a ，m a r a s m i u s ，m e l a n o t u s ，m o n i l i o p s i s ，s e b a c i n a ，s i s t o t r e m a ，t h a n a t e p h o r u s ， t u l a s n e l l a ，y p s i l o n i d i u m ，x e r o t u s ) 和2 个腐生类型( h y p h o m y c e t e s 币h m y c e l i u mr a d i c i s a t r o v i r e n s ) ，检索对这些属的菌根真菌进行了详细的培养和形态特征描述，为以后兰科 植物菌根真菌研究提供了分类依据【3 l 】。 此后，随着有关兰科菌根真菌各个领域研究工作的逐步开展，新方法，新技术手段 的广泛应用，促生了关于兰科菌根真菌分离鉴定越来越多的研究成果 3 2 - 3 4 】。 1 2 2 国内兰科菌根真菌分离鉴定研究 国内兰科植物菌根真菌的研究工作开展相对较晚，与国外相比此方面研究缺乏系统 性，分离植物材料的种类、分布和获得的菌株种类、数量也都有限。国内兰科菌根真菌 分离鉴定研究具有典型特点，即研究工作主要集中于经济效益大，国内市场需求较多的 兰科药用类植物，天麻( g a s t r o d i ae l a t a ) 和石斛属( d e n d r o b i u m ) 等。郭顺星、徐锦堂 等先后自野生天麻( g a s t r o d i ae l a t a1 31 ) 和云南野生铁皮石斛( d e n d r o b i u mc a n d i d u m ) 中分离获得了菌根真菌的两个新种，同时分离获得了一些典型的兰科共生广义丝核菌属 真菌【3 5 3 7 1 。 然而，国内对于兰科菌根真菌的分离鉴定研究也存在些许问题，较突出表现在分离 的兰科植物种类较单一，对有重要观赏价值的兰科植物关注并不多，特别是很少有我国 特有的中国兰属( c y m b i d i u m ) 植物菌根真菌的分离鉴定研究，主要研究工作有：范黎 自西双版纳的墨兰( c y m b i d i 甜聊s i n e n s e ) 中分离得到兰小菇( m y c e n ao r c h i d i c o l a ) 3 s 】。 李潞滨自我国4 种野生兰属植物中分离获得多个瘤菌根菌属( e p u o t k r a z i ) 菌株 3 9 1 ，胡陶 等从不同地理分布的7 种兰属植物中分离获得1 9 株典型的广义的丝核菌属真菌 4 0 l 。 此外，在国内的一些研究中存在内生真菌与菌根真菌概念混淆，将根际常见的微生 5 河北人理2 硕fj 学位论文 物归为兰科菌根真菌。虽然在兰科菌根真菌的分离实验操作过程中会分离得到镰刀菌属 ( f u s a r i u m ) 、木霉属( t r i c h o d e r m a ) 、青霉属( p e n i c i l l i u ml i n k ) 等真菌，但是，严格 意义的菌根真菌应与兰科植物形成特定的结构、具有特定的功能，仅仅从“分离获得 的角度是不能认定其是否为兰科菌根真菌的。 1 3 兰科植物菌根真菌与植物专一性关系研究 人们曾在一定程度上设想并认为兰科植物和共生真菌之间存在一种专一性关系，即 一种兰科植物一种共生真菌( o n eh o s t o n ef u n g u s ) 。然而许多研究结果对兰科植物 与其共生菌根真菌之间的专一性各有支持和反对，至今仍是悬而未决的热点问题【4 6 4 9 1 ， 随着研究不断深入，有越来越多的证据倾向于兰科植物与共生菌根真菌是存在某种特定 的专一性的。 通常认为兰科植物与共生菌根真菌间专一性关系包括以下几个层次的内容： ( 1 ) 受植物地理分布影响的专一性【7 4 1 。研究专一性关系较早期的研究者c u r t i s 离 从美国和墨西哥不同地区的2 3 种兰科植物中分离了菌根真菌，实验发现相同或相近地 区的兰科植物具有共同的菌根真菌【5 0 1 ，这种专一性提现了受植物地理分布影响，而同种 菌根真菌可以与多种兰科植物共生，削弱了这种专一性受共生植物种属的影响。这与 m a s u h a r a 所提出的生态专一性( e c o l o g i c a ls p e c i f i c i t y ) 的思想是一致的【5 6 】，即同一自然 环境条件下兰科植物与特定的真菌形成菌根。p e r k i n s 的实验很好的证明了这种生态专一 性，在自然条件下兰科植物m i c r o t i sp a r v i f l o r a 与真菌r h i z o c t o n i as o l a n ik u h na g 6 具有 共生专一性【5 3 】。 2 0 0 8 年k o t t k e 研究提出了更新的观点，提示我们应该把兰科植物菌根置于更加广 泛的生态系统层次上，从而全面考察研究兰科植物真菌之间，以及与相关生态系统中 其他生物与非生物因素相互之间的关系【5 5 】。 ( 2 ) 共生植物科、属或种层次的专一性【7 5 1 。w a r c u p 、c l e m e n t 、t a y l o r 等的研究都 证明兰科植物与其共生的菌根真菌在某一水平上( 种或属) 体现出显著的专一性【4 4 ，4 5 ，5 1 ， 5 2 1 ，且同为一属的菌根真菌对不同兰科植物种子的共萌发促进作用是不同的。如澳大利 亚兰科植物c a l a d e n i a 只与s e b a c i n av e r m i f e r a 属真菌共生，d i u r i s 和o r t h o c e r a s 只与 t u l a s n e l l ac a l o s p o r a 属真菌共生。此外，兰科菌根真菌本身表现出丰富的多样性，同时 亦与兰科植物具有明显的专一性【蚓 6 第1 章文献综述 ( 3 ) 植物生活史中的阶段专一性和共生植物的组织专一性【7 引。在兰科植物不同生 活史阶段，不同组织中分离获得的菌根真菌只能在特定阶段特定组织中发挥作用，即从 成年兰科植物根中分离获得的菌根真菌并不一定总能促进兰科植物种子的萌发。 目前国内兰科植物菌根真菌研究多集中于兰科植物与菌根真菌共体系的生培养，对 菌根真菌与兰科植物问的专一性关系特别是集中于有特色、有代表性的中国兰属水平上 的研究，数据较少，涉及兰科植物种类，菌根真菌种类数量都较少，此方面的研究尚不 成系统，近年来报道的研究结果只有李潞滨、胡陶等对分离白兰属植物的1 9 株菌根真 菌进行的a f l p 聚类分析，发现中国兰属植物与菌根真菌之间专一性程度的高低在受兰 花的地理分布和种类影响的同时，还受兰花所属生态类型的影唰1 6 】。 综合已有的研究发现，在同一种兰科植物中分离到的菌根真菌在真菌分类系统中可 能是同种、同属或相近属等各种层7 欠【5 7 和1 ，对兰科植物来说，专一性可能存在于种或属 的水平【6 m 3 1 。 1 4 兰科菌根真菌研究方法的发展 目前兰科菌根真菌的分类和鉴定主要依靠形态学方法，但是兰科植物菌根真菌多为 丝核菌( r h i z o c t o n i a ) ，属于无性态的半知菌类，缺乏严谨的形态学鉴定特征，因此微生 物分类鉴定的传统方法的应用存在较大局限性，鉴定的准确性也有限。随着兰科菌根真 菌的研究深入，众多研究领域研究方向的不断拓展，迫切需要新的研究手段和研究方法， 因此分子生物学方法应用到兰科菌根真菌的研究中已成为必然趋势。 随着分子生物学的发展，d n a 分子标记( d n am o l e c u l a rm a r k e r s ) ，即d n a 指纹图 谱技术越来越广泛地运用于菌根真菌鉴定和比较。a n d e r s e n 用隔膜孔超微结构特征和细 胞核数的鉴定标准结合r f l p 分析对分离自北欧兰科植物的4 1 株菌根真菌进行鉴定，得 到了根据形态鉴定相一致的结果 3 0 , 4 1 】。对于形态相似的菌根真菌种类或菌株，可利用各 种分子生物学方法( d a f 、r a p d 、r f l p 、a f l p 、r d n ai t s 等) 比较菌根真菌种间和 种内的差别，判定菌株之间的亲缘关系，从而探讨分析其与兰科植物的专一性。这些方 法都是传统的形态学方法所不能企及的，显示出高效、简便、准确、不受真菌生活史限 制等巨大优越性【4 2 4 3 】，增加了真菌鉴定的准确性和科学性，大大提高了对兰科菌根真菌 的研究分析的水平。正是由于多种分子生物学方法的应用，兰科植物与菌根真菌存在着 一定程度的专一性关系得到越来越多研究结果的支持 0 , 4 1 】。 7 河北人。理学硕十学何论文 1 5 研究目标和主要研究内容 菌根真菌在兰科植物正常生长发育过程中具有不可替代的作用，本研究充分考虑植 物种类、地理分布和生念型等因素，选取中国广泛分布的地生类型兰属( c y m b i d i u m ) 植物( 春兰、蕙兰、建兰、寒兰等) 野生植株和仅在特定地区分布、独属独种的非兰属 植物( 独花兰，金佛山兰) 野生植株，从中分离获得菌根真菌，在传统方法分类鉴定的 基础上利用分子生物学方法对其进行i t s 序列分析，深入探讨二者间专一性关系，得出 兰科植物和共生菌根真菌间专一性是否存在及其存在程度如何等方面较为全面和令人 信服的初步结论。 本研究主要包括以下内容： ( 1 ) 兰科菌根真菌的分离。广泛收集不同地理分布( 湖北、浙江、安徽、重庆、 福建、海南、河南) 、不同种类的野生兰科植物( 春兰、蕙兰、寒兰、建兰、送春、独 花兰、金佛山兰) 作为研究材料进行菌根真菌的分离，获得大量菌根真菌菌株，为后续 研究做准备。 ( 2 ) 菌根真菌的分类鉴定。根据形态学方法( p d a 培养基上茵落形态特征、菌丝 结构、光镜显微结构特征等) 对分离获得的菌株进行初步筛选和鉴定，结合r d n ai t s 序列分析的分子生物学方法对所获菌株进一步分类鉴定，将两种鉴定方法的结果进行比 较分析。 ( 3 ) 兰科植物与其共生菌根真菌的专一性关系研究。利用r d n a i t s 序列分析，结 合传统分类和已有研究结果，从已分离获得的菌根真菌中选取具有代表性的中国兰属植 物( 春兰、蕙兰) 菌根真菌，对其进行遗传多样性和聚类分析，获得不同菌根真菌间分 子生物学层面的内在亲缘关系，初步揭示兰科植物与其共生菌根真菌之间的专一性关 系。 第2 章羔科植物# - i 十m 真菌的分离j j 初步鉴定 第2 章兰科植物菌根真菌的分离与初步鉴定 兰科菌根是植物菌根中一个独特的类型，真菌的分离是研究菌根真菌进而研究兰科 植物与其共生菌根真菌关系的基础。一些研究者认为，兰科菌根真菌并不难获得，由 于兰科菌根对于兰科植物的重要意义，兰科菌根真菌的分离、鉴定一直是一个重要的研 究领域。 2 1材料 本研究所用到的植物材料分别采自我国湖北、浙江、安徽、重庆、福建、海南、河 南等地野生的春兰、蕙兰、寒兰、建兰、送春、独花兰、金佛山兰，详见表2 1 。 表2 1 供试兰科植物材料和分离获菌根真菌统计 t a b 2 - 1s t a t i s t i c so fo c r h i d a c e a ep l a n t st e s t e da n dm y c o r r h i z a lf u n g ii s o l a t i o n 采集地点采集| i 期 兰科植物种类兰科植物数量分离获得的菌株数量 坠旦! q ! i 鲤2 型!兰仑堕! 箜 ! 塑! 垒坠堡垒里兰! 翌也旦坚塑堕 列川江津2 0 0 7 1 0 1 l送春( c y m b i d i u m f a b e r iv a r s z e c h u a m i c u m ) 28 5 四川江津 2 0 0 7 1 0 i1寒兰( c y m b i d i u mk a n r a n ) 26 5 福建武夷山2 0 0 7 1 1 2 5寒兰( c y m b i d i u mk a n r a n )3 2 8 福建武夷山 2 0 0 7 1 1 2 5建兰( c y m b i d i u m 绷s 珈l i u m ) 34 5 海南 2 0 0 7 1 2 1寒兰( c y m b i d i u mk a n r a n ) 38 7 海南2 0 0 7 1 2 1建兰( c y m b i d i u m 删咖l i u m ) 44 7 湖北随州 2 0 0 8 1 4春兰( c y m b i d i u mg o e r i n g i i ) l5 6 湖北随州2 0 0 8 1 - 4蕙兰( c y m b i d i u m f a b e r i )l 1 5 安徽天堂寨 2 0 0 8 - 4 1 5蕙兰( c y m b i d i u m f a b e r i ) 75 1 浙江天目山2 0 0 8 - 4 2 0蕙兰( c y m b i d i u m f a b e r i )72 7 浙江天目山 2 0 0 8 - 4 2 0春兰( c y m b i d i u mg o e r i n g i i ) 78 安徽天堂寨2 0 0 8 - 4 - 2 0 独花兰( c h a n g n i e n i aa m o e n a ) l l 重庆金佛山 2 0 0 8 - 5 1 4春兰( c y m b i d i u mg o e r i n g i i ) 31 5 重庆金佛山 2 0 0 8 5 1 4金佛山兰( t a n g t s i n i a n a n c h u a n i c a ) 3 2 2 方法 2 2 1主要仪器、试剂及培养基 超净工作台：上海成顺仪器仪表有限公司y j 一9 0 0 电热恒温培养箱：湖北省黄石市恒丰医疗器械有限公司s r p - o l a 9 河北人学理学硕十学何论文 立式自动电热压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂l d z x 4 0 bi 光学双目显微镜：奥林巴斯c x 2 1 7 0 乙醇，o 1 氯化汞( 升汞) ， p d a 培养基成分：去皮马铃薯2 0 0g ，切成1c m 3 小块，加水1 0 0 0m l 煮沸3 0 分 钟，过滤，将滤液补足至1 0 0 0m l ，加葡萄糖2 0g ，琼脂8g ，溶化后分装，1 2 1 湿热灭菌2 0 分钟。 2 2 2 菌根真菌的分离、纯化与保藏 剪取野生兰科植物老嫩适中、无伤、无病的根部，放入烧杯流水冲洗过夜，将冲洗 过夜的根用7 0 酒精消毒3 0 秒，再用0 1 升汞消毒6 8 分钟，无菌水冲洗4 6 次，取 出后切成o 5i l l n l 厚的根片，将根片接种于p d a 培养基，2 8 恒温培养。当从根片外皮 层长出真菌菌丝后，用竹签挑取最外侧菌丝接种于新鲜的p d a 培养基，2 8 恒温培养， 重复上述步骤直到获得菌根真菌的纯培养。纯化后的菌株接种于p d a 斜面，4 。c 保藏。 2 2 3 菌根真菌的初步鉴定 将菌株接种于p a d 培养基，2 8 恒温培养。记录菌株生长速度，观察菌落特征， 产孢情况等，制作水封片于光学显微镜下进行形态观察。 2 3结果 2 3 1 菌根真菌的分离 供试野生兰科植物材料( 不地理分布、不同种类) 共4 7 株，选取每株兰科植物1 至3 条根进行菌根真菌的分离，共分离获得菌根真菌5 3 1 株，详见表2 ，1 。 2 3 2 菌根真菌的初步鉴定 分离获得的5 3 1 株菌根真菌在p d a 培养基上均表现出以下共同的培养特征：菌落 灰白色或浅黄白色，菌丝程圆周状发散生长，有的可形成间隔不等的同心园菌落环纹， 菌落表面湿润，质感温润细腻，菌丝下沉生长，有的菌有稀松的白色气生菌丝；7 1 0 天 可长满直径9c i i l 的p d a 培养基平皿；不形成有性生殖孢子( 见图2 1 - a ) 。 分离获得的菌根真菌菌丝在光学显微镜下均观察到以下共同特征：菌丝有隔；分枝 几近直角，分枝处略呈缢缩状，距茵丝分枝点较近处形成隔膜；具有由桶状细胞( 无性 厚垣孢子，c h l a m y d o s p o r e s ) 串联而成的念珠状细胞群结构( 见图2 1 b ，图2 1 c ) 。 1 0 第2 章 兰科植物苗根奠苗的分离与初步鉴定 u j ? ? f 蛰 、邋恣 a 菌根真苗在p d a 培养基上的苗落特征，b 苗根真菌苗丝光学显微特征，c 苗根真菌念珠状细胞 群结构无性厚垣孢子 ac o l o n y c h a r a c t e r i s t i c s o f m y h l z a lm n 目o l ip o a ，bo p t i c a l m i c r o s c o p i ce h a r a e t e r i s t i e s o f m y e e l i u m ， cc h l a m y d o s p o r e so f m y e o r r h i z a lf u n g j 图2 - 1 苗根真菌的形态特征 f i g2 - ic h a r a c t e t i s t i c so f m y c o r r h i z a lf l l n g i 2 4 讨论 2 4 1 菌根真菌的分离 本试验从不同兰科植物的不同根中分别分离获得了数量不等的菌株，有的多迭几十 株菌根真菌，有的只有一株或几株菌根真菌，这样的分离结果提示我们，不同兰科植物 不同根部的被真菌侵染程度存在较大差异。 由于真菌侵染并定殖于兰科植物根部的几率、位置受多种因素影响，同一植株根系 中所有的根不定都形成菌根，真菌菌丝团在同一条菌根中的分布也是不连续的，因此， 分离兰科植物菌根真菌时，应选取适宜发育程度和适宜部位进行操作( 即选取无病无伤， 老嫩适中的根) ，且要根据根的清洁程度，发育程度选取适当的消毒方法，控制消毒时 问，才能达到理想的分离效果。 2 4 2 菌根真菌的初步鉴定 根据丝核菌( r h i z o c t o n i a ) 公认的形态学特征，即无性世代不形成任何有性生殖孢 子，菌丝分枝在其基部缢缩，近基部形成隔膜，菌丝分枝几近直角，具有念珠状细胞群 结构，菌株生长速度较快，结合国内外已有兰科植物菌根真菌分离鉴定的相关报道口8 枷】， 初步将这些菌根真菌菌株鉴定为兰科共生丝核菌( o r c h i dr h i z o c t o n i a ) 。 河北人学理。硕十学何论文 第3 章菌根真菌i t s 序列分析及其与共生兰科植物专一性研究 兰科菌根真菌的多样性及其与共生兰科植物专一性关系一直是菌根研究中的焦点 之一。目前关于兰科植物与菌根真菌之间专一性关系的研究报道，主要集中在】两个层次 上专一性受兰科植物的地理分布影响【1 3 】和专一性受与菌根真菌共生的兰科植物的 种、属影响【1 4 1 。 已有的研究中由于所选用的植物材料类别、数量有限，未能充分考虑植物的分类等 级、地理分布和生态类型等因素，往往得到了许多不同甚至是相互矛盾的结果，本研究 利用r d n ai t s 序列分析从分子生物学角度对不同地理分布、不同种类兰科植物的共生 菌根真菌进行全面的系统学分析，初步揭示兰科植物地理分布、所属种对其共生菌根真 菌专一性关系和菌根真菌遗传多样性的影响。以期对菌根真菌与兰科植物专一性关系这 一复杂问题有更深入、准确的了解。 3 1材料 3 1 1供试菌株 试验选取自湖北、安徽、浙江野生春兰和蕙兰( 中国兰属植物的代表种类) 分离获 得的菌根真菌；以及自安徽野生独花兰和重庆野生金佛山兰中( 非中国兰属植物，仅在 特定区域分布，独属独种) 分离获得的菌根真菌，详见表3 1 。 表3 1 用于r d n a i t