水稻包穗突变体esp1的遗传分析与ESP1(t)基因定位-硕士论文

研究方向： 研究生： 指导教师： 水稻遗传育种 卓敏 周元昌教授 官华忠讲师 完成时间：20 10 年4 月 T h e s i sf o rM a s t e r SD e g r e eo fF u ji a nA g r i c u t u r ea n dF o r e s t r yU n i v e r s t y G e n e t i c A n a l y s i so fe s p lM u t a n ta n dM a p p i n g o f S u b j e c tF i e l d ：A g r o n o m y F i r s tS u b j e c t ：C r o pS c i e n c e S e c o n dS u b j e c t ：S e e dS c i e n c ea n dE n g i n e e r i n g S t u d yF i e l d ：G e n e t i c sa n dB r e e d i n go fC r o p R e s e a r c hF i e l d ：R i c eg e n e t i c sa n db r e e d i n g C a n d i d a t e ：Z h u oM i n S u p e r v i s o r ：P r o f Z h o uY u a n c h a n g D r G u a nH u a z h o n g S u b m i t t e dt i m e ：A p r i l ，2 0 10 C o l l e g eo fC r o pS c i e n c e ，F u j i a nA g r i c u l t u r ea n dF o r e s t r yU n i v e r s i t y F u z h o u ，F u j i a nP R o fC h i n a , 3 5 0 0 0 2 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独 立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致 谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。 与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢 意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 敝储亲笔签名库酞 论文使用授权的说明 日期：纠p ，易3 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。酉 学位哔业) 敝储亲笔鹕库孤 指导教师亲笔签名： 日期：2 吖D 陟一3 日期：加口，弓 目录 摘要1 A b s t r a c t 3 前 言5 l 文献综述6 1 1 水稻突变体的来源及突变体库的构建7 1 1 1 突变体的来源7 1 1 2 水稻突变体库8 1 1 2 1 自然突变的收集及利用9 1 1 2 2 人工诱变突变体库的构建一9 1 1 2 2 1 物理诱变突变库的构建9 1 I 2 2 2 化学诱变突变群体的构建9 1 1 2 2 3 组织培养诱发的突变9 1 1 2 2 4 插入突变体库的构建l O 1 2 水稻矮杆突变体的研究现状。l O 1 2 1 水稻矮秆突变体s d e ( t ) 的研究l l 1 2 2 水稻矮秆突变体C H A 1 的研究。1 2 1 3 水稻长穗颈基因e u i 的研究1 2 1 3 1e u i 基因的发现与定位1 2 1 3 2e u i 基因的作用机理1 3 1 3 3水稻e u i 基冈对农艺性状的影响。1 4 1 3 3 1 对不育系若干农艺性状的影响1 4 1 3 3 2 不同e u i 基因对杂交稻若干性状的影响1 4 1 4 水稻包穗突变体l5 I 4 1 水稻S H 尸6 基因的遗传分析及定位15 1 4 2 水稻f s p 全包穗突变体l 5 1 4 3 包穗突变体研究的意义1 6 2 材料与方法l7 2 1 实验材料17 2 1 1e s p l 突变体l7 2 2 实验方法l7 2 2 1 突变体e s p l 的形态学研究1 7 2 2 2 突变体e s p l 对赤霉素的敏感性试验l7 2 2 3 水稻包穗突变体e s p l 的遗传分析18 2 2 4 包穗基因E S P I ( t ) 与长穗颈基因e u i 互作方式的研究1 8 2 2 5 正常株D N A 混合池与突变株D N A 混合池18 2 2 6 定位群体的构建。l8 2 2 7D N A 的提取、P C R 扩增和电泳检测( 见附录) 。1 8 2 2 8 引物的筛选18 2 2 9E S P I ( t ) 基因的定位1 9 2 2 9 1E S P I ( t ) 基因的初步定位1 9 2 2 9 2E S P I ( t ) 基因的精细定位1 9 2 2 1 0 数据分析1 9 3 结果与分析2 0 3 1 突变体e s p l 的形态学特征与发育特性2 0 3 1 1e s p l 的形态特征2 0 3 1 2 突变体与早R 9 7 4 的主茎叶数、出叶速度和幼穗发育进度差异2 l 3 1 2 1 突变体与早R 9 7 4 的主茎叶数和出叶速度的差异2 l 3 1 2 2 突变体与早R 9 7 4 对应叶长的比较2 2 3 1 2 3e s p l 突变体和早R 9 7 4 植株幼穗发育进度的差异2 2 3 2 突变体e s p l 对赤霉素的敏感性试验2 3 3 3 突变体e s p l 的遗传分析2 4 3 3 1 包穗性状的遗传分析2 4 3 3 2 包穗基因E S P I ( t ) 与长穗颈基因e u i 的关系2 4 3 4E S P I ( t ) 基因定位2 5 3 4 1E S P I ( t ) 基因的初步定位2 5 3 4 2E S P I ( t ) 基因的精细定位2 6 2 I 讨论3l 4 1 控制水稻倒，一节问长度的相关基因3 1 4 2e s p l 突变体的获得及研究意义。3 3 参考文献3 5 附勇之。4 0 致谢4 4 福建农林大学硕士学位论文 摘要 水稻突变体的筛选及突变基因的定位克隆在水稻分子育种中的作用越来越 受到重视。2 0 0 7 年从6 0 C oy 射线辐照水稻恢复系早R 9 7 4 的诱变后代中；筛选到 一个具有包穗性状( e n c l o s e ds h e m h e dp a n i c l el ，e s p D 的突变体。本研究对突变体 e s p l 的形态特征、对赤霉素的敏感性以及遗传进行研究，并对E S P I ( t ) 基因进行 分子定位。主要结果如下： 1 突变体e s p l 的形态特征 对早R 9 7 4 和e s p l 突变体的生育期、叶片数、幼穗发育进程、倒一节长度、 穗伸出长度、穗长、每穗粒数等形态性状的系统观察表明，突变体在营养生长阶 段与亲本早R 9 7 4 相似；但在幼穗分化初期，突变体的幼穗几乎没有生长，进而 导致突变体幼穗变短，穗粒数减少，穗伸出长度变短，倒一节间变短，使得突变 体表现为包穗性状。 2 突变体e s p l 对赤霉素的敏感性 在幼穗分化期末，利用不同浓度的外源赤霉酸( G A 3 ) 处理e s p l ，研究赤 霉素对突变体倒一节问长度、穗伸出长度和穗长的影响。结果表明，e s p l 突变体 的倒一节对赤霉素不敏感，穗伸出长度也没有明显的变化，但倒二节和倒三节有 明显伸长。因此，利用赤霉素处理e s p l 突变体并不会解除其包穗现象。 3 突变体e s p l 的遗传分析 在e s p l 与日本晴杂交的F 2 代共3 2 1 2 株群体中，正常植株有2 3 8 7 株，突变 株为8 2 5 株，其分离比率符合3 ：1 。在B C F l ( e s p l H 本晴e s p l ) 共1 0 5 6 株群 体中，正常植株有5 4 2 株，突变株5 2 4 株，分离比率符合1 ：l 。表明该突变性状 由隐性单基因控制，暂定名为E S P I ( O 。 4 包穗突变基因E S P I ( t ) 与长穗颈基因e u i 的关系 将e s p l 突变体分别与X e l B ( 携有e u i l ) 、X e 2 B ( 携有P 材刀) 杂交，测验E S P l ( ，) 基因与e u i 的互作方式。在两个F 2 分离群体中，其正常株、包穗株和长颈穗植株 的比率经卡平方( # ) 检测均符合9 ：3 ：4 。表明e u i 基因对E S P I ( t ) 基因起隐性 上位作用。 5 E S P I ( t ) 基因定位 将包穗突变体e s p l 与日本晴杂交构建F 2 群体，在F 2 群体中共有8 2 5 株突变 体，并作为定为群体，对控制包穗的基因进行定位。根据前人研究结果，在1 2 条染色体上较均匀地挑选出多态性高的8 8 对水稻微卫星引物检测e s p l 突变体和 日本晴两个亲本及正常株D N A 混合池与突变株D N A 混合池，发现位于水稻第 1l 号染色体上3 个标记R M 3 3 2 、R M l 6 7 和R M 2 0 2 与E S P l ( O 基因表现出连锁关 系。初步定位结果是，E S P I ( t ) 基因被定位在R M l 6 7 和R M 2 0 2 两个标记之间， 与R M l 6 7 和R M 2 0 2 的遗传距离分别为9 6 5 c M 和4 7 5 c M 。 在初步定位的基础上，进一步在R M l 6 7 和R M 2 0 2 之间设计了1 9 对引物。 利用这些标记对亲本进行多态性分析，共有6 对引物R M 3 1 3 7 、I 洲2 6 2 8 1 、 G R M 4 0 、G R M 3 8 、G R M 4 3 b 和G R M l 7 在e s p l 突变体与日本晴这两个亲本问表 现多态性，其中G R M 4 3 b 足I n D e l 标记，其他5 对都是S S R 标记。利用这6 个 标记对E S P I ( t ) 基因进一步定位。利用M a p m a k e r E x p3 0 软件构建局部分子标记 连锁图，并精细定位了E S P I ( t ) 基因。它与上述6 个标记的关系分别为 R M 3 1 3 7 R M 2 6 2 8 1 E S P I ( t ) G R M 3 8 G R M 4 3 b G R M l 7 ，其中R M 3 1 3 7 和R M 2 6 2 8 1 与E S P I ( t ) 基因的遗传距离分别为1 6 2 c M 和0 2 8 c M ；另一侧标记G R M 3 8 、 G R M 4 3 b 和G R M l 7 与E S P I ( t ) 基因的遗传距离分别为0 0 8 c M 、0 5 3 c M 和1 3 9 c M ； G R M 4 0 与基因共分离。 关键词：水稻，e s p l 突变体，基因互作，E S P I ( t ) 基因定位 2 福建农林大学硕士学位论文 A b s t r a c t I tw i l lp l a ya l li n c r e a s i n g l yi m p o r t a n tr o l et os e l e c tr i c em u t a n t sa n dc l o n et h e m u t a n tg e n e si nr i c eb r e e d i n g ，e s p e c i a l l yi nr i c em o l e c u l a rb r e e d i n g Ar i c em u t a n t w i t he n c l o s e ds h e a t h e dp a n i c l el ( e s p l ) W a sg o t t e nf r o mar i c er e s t o r e rl i n eZ a o R 9 7 4 b yu s i n g6 0 C oy - r a yi r r a d i a t i o ni no u rl a b o r a t o r yi n2 0 0 7 I nt h i sp a p e r ，w ef o c u s e do n t h es t u d i e so ft h eo b s e r v e a t i o no ft h em o r p h o l o g i c a lt r a i t s ，t e s to fg i b b e r e l l i n s e n s i t i v i t y ，g e n e t i ca n a l i s i so fe s p lm u t a n t ，a n dm a p p i n g o ft h ec o r r e s p o n d i n gg e n eo f e s p lm u t a n t T h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s 1 M o r p h o l o g i c a lt r a i t so ft h ee s p lm u t a n t O b s e r v a t i o n ss h o w e dt h a tt h ee s p lm u t a n ta n dt h eZ a o R 9 7 4 a r es i m i l a ri ng r o w t h d u r a t i o na n dl e a v e so fm a i ns t e ma n da l m o s ts i m i l a ri nt h e i rp h e n o t y p e sa tt h e v e g e t a t i v eg r o w t hs t a g e B u tt h e ya r ed i f f e r e n ti nt h el e n g t ho fu p p e r m o s ti n t e m o d e a n dt h el e n g t ho fp a n i c l e C o m p a r i o nw i t ht h eZ a o R 9 7 4 ，t h es p i k e l e to ft h ee s p l m u t a n td e v e l o p e ds l o w l ya tt h eb e g i n n i n go fd i f f e r e n t i a t i o n ，w h i c hl e d st Os h a r p l y s h o r t e nt h ep a n i c l el e n g t ha n dr e d u c e st h eg r a i nn u m b e r s A n dt h ee s p lw a s s i n i f i c a n t l ys h o r t e ri nt h eu p p e r m o s ti n t e r n o d et h a nt h eZ a o R 9 7 4 ，S Ot h a ti t sp a n i c l e i s c o v e r e db yf l a gl e a fs h e a t h 2 T h ee f f e c t so fg i b b e r e l l i ca c i do nt h ee s p lm u t a n t I no r d e rt os t u d yt h ee f f e c t so fe x o g e n o u sg i b b e r e l l i ca c i d ( G A 3 ) o nb o t ho ft h e l e n g t h so fu p p e r m o s t i n t e r n o d ea n dp a n i c l e ，t h ee s p lm u t a n tw a st r e a t e db yd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so fG A 3a tt h ee n do f s t a g eo ft h es p i k ed e v e l o p m e n t R e s u l t s s h o w e dt h a te x o g e n o u sG A so b v i o u s l ye l o n g a t e dt h eu p p e r - s e c o n da n dt h i r d i n t e r n o d e s ，b u tn oo b v i o u sc h a n g ew a so b v e r s e di n t h eu p p e r m o s ti n t e m o d e ， i n d i c a t i n gi ti sg i b b e r e l l i n i n s e n s i t i v e ，a n de x o g e n o u sG A s W a sn o ta b l et or e l e a s e t h es h e a t h e dp a n i c l ei np r a c t i c e 3 G e n e t i ca n a l y s i so fe s p lm u t a n t I nt h et o t a l3 212p l a n t so fF 2p o p u l a t i o no fe s p lc r o s s i n gw i t hN i p p o n b a r e ，t h e r e w e r e2 3 8 7n o r m a lp l a n t sa n d8 2 5m u t a n tp l a n t sr e s p e c t i v e l y ，w h i c hw a sg o o df i tt o 3 福建农林大学硕士学位论文 3 ：1r a t i o I nt h et o t a l1 0 5 6p l a n t so fB C F l ( e s p l N i p p o n b a r e e s p l ) p o p u l a t i o n ，t h e r e w e r e5 4 2n o r m a lp l a n t sa n d514m u t a n tp l a n t sr e s p e c t i v e l y ，t h a tw a sg o o df i tt o1 ：1 r a t i o T h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h ee s p lm u t a n tt r a i ti sc o n t r o l l e db yas i n g l e r e c e s s i v eg e n e T h eg e n ew a sn a m e dE S P I ( t ) t e n t a t i v e l y 4 T h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nE S P I ( Oa n de u i I nt h et w oF 2p o p u l a t i o n so fe s p lm u t a n tc r o s s i n gW j t hX elB ( c a r r y i n ge u i l ) a n d X e 2 B ( c a r r y i n ge u i 2 ) r e s p e c t i v e l y ，t h en o r m a lp l a n t s ，t h ee s p lm u t a n t sa n dt h ee u i m u t a n t sw e r eg o o df i tt o9 ：3 ：4r a t i o ，i n d i c a t i n gt h a tb o t ht h ee u i la n de u i 2w e r e r e c e s s i v ee p i s t a s i so v e rE S P I ( t ) 5 M a p p i n go fE S P l B a s e do nt h ep r e v i o u ss t u d y ，8 8S S Rm a r k e r sw e r ec h o o s e df r o mt h er i c el2 c h r o m o s o m e st oa n a l y z et h e i rp o l y m o r p h i s mb e t w e e nt h ee s p l ，Z a o R 9 7 4a n dt h e8 2 5 m u t a n t sd e r i v e df r o mt h ep o p u l a t i o no f e s p lc r o s s i n gw i t hZ a o R 9 7 4 I tw a sf o u n dt h a t S S Rm a r k e r sR M 3 3 2 、R MI6 7a n dR M 2 0 2o nc h r o m o s o m e11w e r el i n k e dt oE S P I ( t ) B yu s i n gM a p m a k e r E x p3 0p r o g r a m ，t h eE S P I ( t ) w a sl o c a t e da tb e t w e e nR M 16 7 a n dR M 2 0 2 ，9 6 5c Ma w a yf r o mR M16 7a n d4 7 5c Ma w a yf r o mR M 2 0 2 ， r e s p e c t i v e l y B a s e do na b o v er e s u l t ，19n e wm a r k e r sw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt ot h er i c e g e n o m es e q u e n c et o f u r t h e ra n a l y z et h e i rp o l y m o r p h i s mb e t w e e nt h ee s p la n d Z a o R 9 7 4 6m a r k e r sR M 3 l3 7 ，R M 2 6 2 81 ，G R M 4 0 ，G R M 3 8 ，G R M 4 3 b ( 1 n D e lm a r k e r ) a n dG R M17w e r ep o l y m o r p h i c B yt h eu s eo fM a p m a k e r E x p3 0 p r o g r a m ，a m o l e c u l a rm a pw a sc o n s t r u c t e d F r o mt h em a p ，t h ea r r a n g e m e n tb e t w e e nt h eE S P I ( t ) a n dt h em a r k e r sw a sR M 3 1 3 7 - R M 2 6 2 8 1 E S P I ( t ) 一G R M 3 8 - G R M 4 3 b G R M l 7 。t h e i r g e n e t i cd i s t a n c e sw e r e 1 6 2c Mt oR M 3 13 7 ，0 2 8c Mt oR M 2 6 2 81 ，0 0 8c Mt o G R M 3 8 ，0 5 3 c Mt oG R M 4 3 ba n d1 3 9c Mt oG R M17 ，r e s p e c t i v e l y ，a n dE S P l ( t ) w a s C O - s e g r e g a t i o nw i t hG R M 4 0 m a r k e r K e yw o r d s ：r i c e ，e s p lm u t a n t ，g e n ei n t e r a c t i o n ，E S P I ( t ) m a p p i n g 4 福建农林大学硕士学位论文 二l - - J - 刖吾 在杂交水稻制种中，不育系的包穗是影响其产量的一个主要因素。无论是光 温敏核不育系还是细胞质雄性不育系均存在不同程度的包穗现象。生产上是通过 喷施赤霉素等方法来促进穗颈节节间伸长，使穗全部抽出便于接受父本花粉。而 赤霉素的大量使用不仅增加了种子生产成本，而且还加剧了环境污染和加重稻粒 黑粉病的发生造成种子质量下降n 一1 。因此，通过遗传改良来解决不育系包穗问 题已成为杂交稻育种的重要目标。 一个重要途径是通过y 射线辐射诱变获得的长颈穗e u i 突变体，该突变体的株 高明显增加，而株高的增加主要是由倒一节间伸长造成的。李毓等通过对长颈穗 不育系研究表明，e u i 基因对大多数不育系包穗的缓解有显著作用，特别是e u i l 基因，可以基本解除部分不育系包穗口1 。 另一个重要途径是通过组织培养及T D N A 插入等技术，获得了多个包穗突 变体，包括s h p ，s h p 2 ，s h p S ，s h p 6 ，f s p 等H 吖1 。上述包穗突变体都具有植株矮化、 倒一节间缩短和包穗的特性，但在包穗的程度上有较大差异，s h p l ，s h p 6 等均 为部分包穗，j 而f s p 突变体为全包穗。它们对赤霉素的敏感性都存在差异，s h p ， s h p 6 表现对赤霉素敏感，f s p 表现为钝感。H S P 6 已被定位在第2 号染色体的短臂 的S H 0 0 3 和S H 0 0 6 标记之间约1 0 0 0 k b 的基因组D N A 区域H 1 。 随着辐射诱变技术在分子育种中的普遍应用，新的种质资源也不断出现。其 中本实验的e s p l ( e n c l o s e ds h e a t h e dp a n i c l e1 ) 突变体就是从6 0 C o 照射水稻恢复 系早R 9 7 4 的诱变后代中筛选出来的。该突变体表现为倒一节问缩短和包穗。目 前，还没有其他包穗突变体深入研究的报道。因此，对E S P I ( t ) 基因的定位和克 隆并深入研究其功能，对水稻不育系包穗的解除具有重要的意义。本实验是对 e s p l 突变体形态和遗传特性的初步研究，并在此基础上定位E S P I ( t ) 基因，为最 终克隆该基因奠定基础。 福建农林大学硕士学位论文 1 文献综述 水稻是世界上最主要的粮食作物之一，与小麦具有同等重要的地位。在中国， 水稻更是第一粮食作物。所以，水稻的增产就显的格外重要，其方法主要是通过 栽培和育种。但随着科技的进步，育种特别是分子育种在选育水稻优良品种上显 得尤为重要。 在世界水稻育种中，早期是通过收集和评选地方品种并进行单株或群体的选 择，再通过比较试验从中鉴定出良种供生产应用，这是比较简单易行的方法。在 全球稻米的增产中，半矮生高产良种的育成和增施化学肥料的兴起都起到了重要 作用。但由此产生了不少令人担忧的问题：( 1 ) 由于中国籼型杂交水稻大部分都 具有野败胞质，而大多数的半矮生高产品种的半矮生基因都为s d - 1 ，从而造成了 遗传单一性和脆弱性；( 2 ) 由于目前的多数品种只是单一的主基因抗性，而半矮 生高产品种的种植方式为增肥密植，因此比较容易导致病虫害爆发而减产；( 3 ) 生产成本的增加；( 4 ) 大量使用农药和化肥不仅造成环境污染，而且还破坏农业 生态环境。因此，通过提高育种技术来解决这些问题成为了今后水稻育种研究的 重点8 1 。 从1 9 4 9 到1 9 9 0 年中国水稻的发展共经历了三个阶段。多样的遗传资源和育 种方法的利用是每一阶段水稻品种改良的共有特点。 第一阶段是从老品种中选择育种；首先是征集和整理各省的地方品种，再通 过区域试验对筛选的丰产、抗逆品种进行繁殖推广。 第二阶段矮化育种成为了重点；通过南特1 6 与广陆矮而衍生出了许多优良的 新品种。 第三阶段是杂交水稻的推广；主要是袁隆平教授和他的助手在海南岛发现了 一株花粉败育的野生稻，并实现了杂交水稻技术的突破，从而为杂交水稻的大面 积推广奠定了基础。在这一阶段，我国的水稻平均产量提高了2 吨公顷，主要 是因为采用了杂交种子旧1 。 杂交水稻自问世以来就显示出强大的生命力，其杂种优势的利用对我国粮食 大幅增产与增收及解决我国十几亿人口的温饱问题做出了巨大贡献，被称之为农 业发展的第二次绿色革命n 们。目前，杂交水稻的种植面积已经达到了l7 3 3 万h m 2 ， 占中国水稻种植面积的一半以上n ，每年需制种1 5 万h m 2 左右n 羽。 6 诱变，一般诱变率在0 1 左右，比自然突变高出1 0 0 倍以上。人工诱发的变异范 围较大，往往能产生自然界尚未出现或者较难出现的新基因资源n 引。 到了2 0 世纪5 0 年代后期，植物辐射诱变育种在植物育种中才开始得到广泛 应用。农业上主要是利用理化因素诱发变异，再通过选择培育新品种。实践证明， 辐射诱变育种是创造新种质的有效方法，可以创造植物新类型、选育新品种。其 主要的特点是，可提高突变率，扩大突变谱；对改良单一性状比较有效，改良多 个性状较困难；性状稳定快，育种年限短。缺点是诱发突变的方向和性质尚难掌 握1 钔。 在新品种不断育成的同时，对新种质的要求也在逐步提高，而诱变技术是创 造新种质的主要途径之一。诱变技术中最常用的方法有物理诱变和化学诱变。物 理诱变方法主要是使用一些射线，如紫外线、X 射线、丫射线和中子等。航天诱 变育种就是利用太空射线及失重等特殊环境条件诱发变异来育种的。化学诱变方 法主要是使用化学药剂，如叠氮化钠、烷化剂、碱基类似物等化学诱变剂来诱发 变异的口副。本研究利用6 0 C o - 射线辐射水稻种子使其基因产生突变，并对其后 代突变株进行观察及筛选。丫射线与X 射线相比，它具有波长短、能量高、穿透 力强等优点，它是核内电磁辐射。因此，Y 射线诱变育种已经在国内外得到普遍 的应用引。 随着科技的发展，生物诱变技术成为了比较常见的诱变方法。生物诱变技术 是利用诱变因子及离体培养条什下诱导植物产生变异的技术。这些诱变因子主要 是外源D N A 、转座子和逆转座子等，它们通过插入受体D N A 而引起变异。这种 诱变的特点是诱变物本身就是遗传物质，并直接参与基因突变，且不会像理化诱 变那样产生有害性甚至致死突变n 引。由于现在世界各国牛物学实验室在生物学研 究中已经广泛应用这种技术，因此，通过生物诱变技术获得的突变体己成为新种 质获得的重要来源之一n 引。随着航天技术的发展，环境诱变技术作为一种新的诱 7 福建农林大学硕士学位论文 变技术随之诞生。主要是利用特殊的环境条件诱发突变的一种技术。太空诱变技 术就是其中比较典型的一种，利用航天器将种子送到太空，由于太空是处在大气 层保护之外及较远离地球，形成了一个真空、微重力及宇宙射线较强的环境，因 此在这些特殊的条件下可直接导致种子内部结构的改变也就是基因结构的改变 n 钔。这种方法的特点是变异幅度广和变异频率高，使其在作物育种中发挥重要的 作用啪3 。 辐射诱变育种技术在农业科研和农业生产上发挥着越来越重要的作用。在辐 射诱变育种技术中，还有许多如基础研究和应用研究等方面的问题有待于我们去 进一步研究和探索。因此，辐射诱变育种技术无论是在科学研究方面，还是在实 际应用方面都有其存在和进一步发展的巨大空间和必要性。随着科学技术和世界 经济的发展，辐射诱变育种技术会受到更加的重视，它的历史和发展现状，已经 证明了它所具有的创新能力和独特优势及对农业生产与科研的巨大影响力。它所 创造出的新种质及培育的新品种，为作物育种做出了巨大贡献心。 1 1 2 水稻突变体库 纵观水稻育种的历程，每一次新突破都离不开新技术的利用和新遗传种质资 源的发掘。 水稻的遗传改良曾给人类带来了两次绿色革命，为人类解决温饱问题做出了 重要贡献。但是随着水稻改良品种的大面积推广，其遗传基础的日益狭隘，导致 对进一步改良产量、抗性等重要农艺性状越显困难，只有通过利用新技术和创新 种质资源才能为水稻育种创造新的突破晗2 1 。 突变体库的构建能为水稻新品种的培育提供重要的资源。突变体库是指由某 种方法产生并包含各种不同基因突变的群体。饱和突变体库理论上是该基因组的 每个基因都发生突变的突变体库。通过突变体来确定基因功能，有正反向遗传学 两种策略。正向遗传学是通过突变体的表型克隆突变的基因，最终确定该基因的 功能。反向遗传学是通过突变基因的序列，鉴定该基因突变产生的突变体，确定 该基因的功能。构建突变体库的方法有物理、化学诱变、基因沉默、同源重组以 及插入突变等，但各自都有优缺点。比如物理、化学诱变，较其他方法更易得到 饱和突变体库，但要通过较复杂的图位克隆方法来克隆突变基因，因此对基因功 能的研究比较困难晗3 1 。在线虫突变体库的构建中基因沉默得到了成功应用晗4 1 ，然 福建农林大学硕士学位论文 而这种方法并不适合于植物。 1 1 2 1自然突变的收集及利用 自然条件下发生的突变，是新种质产生和生物进化的基础。对于低等生物、 高等动植物以及人类，都有发生自发突变的可能。许多有价值的育种材料都是由 自然突变获得的。在水稻中，矮化育种是从矮秆突变株的发现开始的；水稻三系 法杂种优势的利用之所以能成为现实，是因为细胞质雄性不育株的发现；而光( 温) 敏核不育株的发现对于通过两系法利用水稻亚种间的杂种优势做出了巨大贡献。 自发突变的频率很低，在高等生物中其突变率大概是l O 1 0 一，且许多突变体 的丢失是因为通过表型是无法鉴定的，所以很难进行系统的收集。对于许多有意 义的突变株，要分离并鉴定该突变的基因功能也是很困难，需要较复杂的方法才 能分离到相应的突变基因瞳副。 1 1 2 2 人工诱变突变体库的构建 1 1 2 2 1 物理诱变突变库的构建 在植物中，快中子被认为是很有效的突变剂乜创。快中子的轰击主要是导致基 因缺失突变，用基因组相减的方法可以分离相应的突变基因，再根据突变表型来 鉴定基因的功能。但基因组相减的方法比较繁琐，不适合进行大规模的基因功能 鉴定。 1 1 2 2 2 化学诱变突变群体的构建 通过使用化学诱变剂诱发的变异被叫做化学诱变。E M S ( E t h y lM e t h a n e S u l f o n i ca c i d ) 是目前使用较普遍的化学诱变剂，在水稻等植物的诱变育种中已被 广泛应用。E M S 诱变剂的优点是稳定、高效。E M S 的使用可能会导致错义突变、 无义突变和沉默突变，但沉默突变不会导致任何变异。在拟南芥中，E M S 的使用 大约会产生6 5 的错义突变，5 的无义突变和3 5 的沉默突变瞳”。 1 1 2 2 3 组织培养诱发的突变 体细胞变异是指通过组织培养诱发的变异晗8 1 。随着培养时间的延长其变异频 率也会随之提高，为了实现一定程度的定向诱发，可以通过利用选择压力和结合 化学诱变的方法进行细胞突变体筛选啪棚1 。通过利用组织培养诱发的变异已经育 9 福建农林大学硕士学位论文 成若干水稻品种阳1 捌。组织培养诱发的变异主要是由染色体断裂和重排引起的口3 3 钔，以及D N A 的甲基化，然而在基因功能鉴定上很难利用到由这两种因素造成 的突变。 1 1 2 2 4 插入突变体库的构建 插入突变是将某些元件插入到水稻基因组中，从而抑制了此基因组中相应位 点基因的表达，插入的元件也可以作为标签，从中分离出相应的基因并鉴定其功 能。T D N A 、反转录转座子、转座子和基因沉默是水稻中最为常用的插入元件。 随着水稻转基因技术的不断发展汹1 ，构建插入突变库的方法中T D N A 已成为主 要方法之一。T D N A 插入的优点是比较稳定，且不具有位点特异性，可以得到 饱和的T D N A 插入突变库7 1 。在水稻插入突变库构建中转座因子也已得到广 泛应用，其中可在水稻中活跃转座的有玉米中的A c D s 和拟南芥中的T a g l 啪3 。由 于拟南芥h 拘T a g l 在水稻中的转座频率比较低，因此只有A c D s 在水稻插入突变体 库的构建中得到应用3 。通过抑制基因的表达来构建突变体库，如利用反义或共 抑制的方法来打断已知基因的表达，但在抑制基因功能方面所产生的效果并不 好。 由于物理诱变中的快中子轰击方法比较简单，同时也可以在短时间内获得大 量缺失突变体，但内含子、多位点和多基因等缺失可能导致无法检测到突变变异。 因此构建插入突变体中T D N A 、转座子和反转录转座子等已成为了突变库构建 的主要方法瞳引。 1 2 7 1 ( 稻矮杆突变体的研究现状 随着世界经济的发展和人口的不断增长再加上世界耕地面积的减少，作物高 产无疑成为了育种家们的首要目标。同时随着生物学等科学的迅速发展，对作物 高产机理的研究也更加深入。追求理想的作物株型是遗传改良的基础，水稻矮化 育种的成功对水稻增产做出了巨大贡献。多年来，国内外育种家们在研究和利用 作物矮生基因资源方面取得了很大进展，并育成了许多优良的杂交种。同时，许 多矮生基因也被相继鉴定和克隆，并初步阐明矮生基因的作用机理，为矮生基因 的高效利用奠定了重要基础1 。 I O 福建农林大学硕士学位论文 日本学者构建了水稻高密度遗传图谱，其中含有1 3 8 3 个标记，至少有1 3 个水 稻矮秆或半矮秆基因被定位。许多与株高有关的D N A 位点区域和Q T L 位点被 H u a n g 等找到，且在水稻的1 2 条染色体上都有分布H 。1 9 8 0 年日本水稻研究机构 统一以d 为符号代表矮秆基因和少数半矮秆基因，并根据被鉴定的时间顺序，从 d l 编录至d 6 l ，但其中缺少d 8 ，d 1 5 ，d 1 6 ，d 2 5 ，d 3 4 和d 3 6 ，因而只有5 5 个以d 命名 的矮秆基因。在这些矮秆基因中，只有d 4 ，在水稻育种中发挥了重要作用且s d - J 被定位在第1 号染色体上1 。M o n n a 等已分离得N s d - J 基因n 钔。 1 2 1 水稻矮秆突变体s d e ( t ) 的研究 突变体s