遗传的分子基础.ppt

第五章遗传的分子基础,第一节核酸的结构第二节DNA复制第三节遗传信息的表达与调控第四节基因的概念与发展第五节遗传工程简介,第一节核酸的结构,一、DNA的一级结构二、DNA的二级结构三、从DNA到染色体四、RNA的分子结构,两种核酸的化学组成以核苷酸为单元构成的多聚体，是一种高分子化合物。五碳糖：脱氧核糖、核糖核苷酸磷酸鸟嘌呤、腺嘌呤环状的含氮碱基胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶,核酸的分布：高等植物：DNA存在于染色体，叶绿体、线粒体中；RNA在核（核仁、染色体）、细胞质中。细菌：DNA和RNA。噬菌体：多数只有DNA。植物病毒：多数只有RNA。动物病毒：有些含RNA、有些含DNA。,一、核酸的一级结构,(一)、贾格夫准则及其意义；(二)、核苷酸序列及其测定。,(一)、贾格夫准则及其意义,E.Chargaff于1946-1950年根据纸层析、离子交换层析和紫外分光光度试验结果提出贾格夫定则：四种碱基的数量不是等量的；同一物种DNA碱基组成不变，而物种间则有很大不同；嘌呤碱基总量与嘧啶碱基的总量(克分子总量)相等(A+G=T+C)，且A=T、G=C。,(二)、核苷酸序列及其测定,贾格夫准则表明：核酸并不是四核苷酸结构的简单重复，核酸的碱基序列信息可能具有重要意义。碱基序列正是核酸生物学功能的基础，是遗传信息的内在形式。,核苷酸序列测定,DNA及RNA分子序列分析技术也是最重要的分子遗传学研究技术：Sanger双脱氧法；MaxamandforalltypesofRNA,内含子intron剪切与外显子exon拼接,3)Modificationofcertainnucleotides,Addamethylgroupto2-OHofriboseinmRNA(A)andrRNAExtensivechangesofbasesintRNA,primarytranscript,matureRNA,NucleusorNucleolus,Cytoplasm,RNAprocessing,Romovalofnucleotides,additionofnucleotidestothe5-or3-ends,modificationofcertainnucleotides,二、遗传密码及其特性,（一）遗传密码的来历；（二）遗传密码字典；（三）遗传密码的特点；,（一）遗传密码DNA分子碱基只有4种，而蛋白质氨基酸有20种。碱基与氨基酸之间不可能一一对应。141=4种：缺16种氨基酸；242=16种：比现存的20种氨基酸还缺4种；343=64种：由三个碱基一起组成的密码子能够形成64种组合，20种氨基酸多出44种。简并：一个氨基酸由二个或二个以上的三联体密码所决定的现象。三联体或密码子：代表一个氨基酸的三个一组的核苷酸。,（二）遗传密码字典每一个三联体密码所翻译的氨基酸是什么呢?从1961年开始，在大量试验的基础上，分别利用64个已知三联体密码，找到了相对应的氨基酸。19661967年，完成了全部遗传密码表，如UGG为色氨酸。,（三）遗传密码的基本特征1遗传密码为三联体：三个碱基决定一种氨基酸；61个为有意密码，起始密码为GUG、AUG(甲硫氨酸)；3个为无意密码，UAA、UAG、UGA为蛋白质合成终止信号。2.遗传密码间不能重复:在一个mRNA上每个碱基只属于一个密码子；均以3个一组形成氨基酸密码。,3.遗传密码间无逗号：AUGGUACUGUCALL甲硫氨酸缬氨酸亮氨酸丝氨酸密码子与密码子之间无逗号，按三个三个的顺序一直阅读下去，不漏读不重复。如果中间某个碱基增加或缺失后，阅读就会按新的顺序进行下去，最终形成的多肽链就与原先的完全不一样(称为移码突变)。AUGUACUGUCA甲硫氨酸酪氨酸半胱氨酸,4简并性：简并现象：色氨酸(UGG)和甲硫氨酸(AUG)例外，仅一个三联体密码；其余氨基酸都有一种以上的密码子。61个为有义密码，起始密码为GUG、AUG(甲硫氨酸)。3个为无意密码，UAA、UAG、UGA为蛋白质合成终止信号。简并现象的意义：同义的密码子越多，生物遗传的稳定性也越大。如：UCUUCC或UCA或UCG，均为丝氨酸,5遗传密码的有序性：决定同一个氨基酸或性质相近的不同氨基酸的多个密码子中，第1个和第2个碱基的重要性大于第3个碱基，往往只是最后一个碱基发生变化。例如：脯氨酸（pro）：CCU、CCA、CCC、CCG。,6通用性：在整个生物界中，从病毒到人类，遗传密码通用。4个基本碱基符号所有氨基酸所有蛋白质生物种类、生物体性状。,通用性的例外,1980年以后发现：具有自我复制能力的线粒体tRNA(转移核糖核酸)在阅读个别密码子时有不同的翻译方式。如：酵母、链孢霉与哺乳动物的线粒体,三、遗传信息的翻译（蛋白质合成）1.核糖体的组成,核糖体是蛋白质生物合成的工厂，其上有两个与tRNA结合的位点，各占一个密码子空间。A位（acceptersite）:氨酰tRNA结合位点P位（peptinesite）:肽酰tRNA结合位点功能：小亚基单独或与大亚基一起与mRNA结合大亚基单独不能与mRNA结合，但可与tRNA非专一结合大、小亚基共有P、A位大、小亚基组成核糖体与mRNA结合，并按53方向沿mRNA移动，每次移动一个密码子距离。,1.2核糖体,每个核糖体独立完成一条多肽链的合成，多个核糖体可以同时在一个mRNA分子上进行多条多肽链的合成，大大提高了翻译效率。由一个mRNA分子与一定数目的单核糖体形成的念珠状结构称为多核糖体。Multipleribosomescannotbepositionedcloserthan80nt.多核糖体处于工作状态，游离的单个核糖体则是贮备状态，核糖体亚基无疑是刚从mRNA上释放的，它们通常很快结合成非活性状态单体或很快参与下一轮蛋白质合成。核糖体在这三种状态之间的转换称为核糖体循环。,多核糖体Polysomes,Polysomes,Electronmicrographsofribosomesactivelyengagedinproteinsynthesisrevealedbybeadsonastringappearance.,2、在核糖体中合成蛋白质多肽链的起始：多肽链的延伸；多肽链的终止：多聚核糖体提高蛋白质的合成效率：,蛋白质合成(动画),四、中心法则及其发展,中心法则(centraldogma)阐述生物世代、个体以及从遗传物质到性状的遗传信息流向，即遗传信息在遗传物质复制、性状表现过程中的信息流向。最初由Crick提出，并经过了多次修正。,.RNA的反转录RNA肿瘤病毒：反转录酶，以RNA为模板来合成DNA。如：HIV病毒RNA经反转录成DNA，然后整合到人类染色体中。对于遗传工程上基因的酶促合成、致癌机理研究有重要作用。增加中心法则中遗传信息的流向，丰富了中心法则内容。.RNA的自我复制：大部分RNA病毒还可以把RNA直接复制成RNA。.DNA指导的蛋白质合成：60年代中期，麦克斯（McCarthy）和荷勒（Holland）：试验体系中加入抗生素等，变性的单链DNA在离体条件下可以直接与核糖体结合，指导蛋白质的合成。,中心法则的发展,中心法则的发展,反转录(逆转录)：反转录酶；cDNA。RNA的自我复制。DNA指导蛋白质合成。,第四节基因的表达调控,一、经典遗传学中基因的概念二、现代遗传学基因的概念三、分子遗传学对基因概念的新发展四、基因的作用与性状表达五、基因表达调控,一、经典遗传学基因的概念孟德尔：把控制性状的因子称为遗传因子。如：豌豆红花(C)、白花(c)、植株高(H)、矮(h)。约翰生：提出基因(gene)取代遗传因子。摩尔根：对果蝇、玉米等的大量遗传研究，建立了以基因和染色体为主体的经典遗传学。基因是化学实体，以念珠状直线排列在染色体上。,基因共性（按照经典遗传学关于基因的概念）：基因具有染色体的主要特性：自我复制和相对稳定性，在分裂时有规律地进行分配。交换单位：基因间能重组，而且是交换的最小单位。突变单位：一个基因能突变为另一个基因。功能单位：控制有机体的性状。经典遗传学认为：基因是一个最小的单位，不能分割；既是结构单位，又是功能单位。,二、现代遗传学关于基因的概念,(一)、现代基因概念基因是DNA分子上带有遗传信息的特定核苷酸序列区段。基因由重组子、突变子序列构成的。重组子是DNA重组的最小可交换单位；突变子是产生突变的最小单位；重组子和突变子都可以是一个核苷酸对或碱基对(bp)。基因可以包含多个功能单位(顺反子)。,突变子(muton)：性状突变时产生突变的最小单位。一个突变子可以小到只有一个碱基对；如移码突变。重组子(recon)：性状重组时，可交换的最小单位。一个交换子可以只包含一个碱基对。顺反子(cistron)：表示一个作用的单位，基本符合通常所述基因的大小或略小。所包括的一段DNA与一个多肽链合成相对应；平均为5001500个碱基对。,三、分子遗传学对基因概念的新发展结构基因(structuralgene)：指可编码RNA或蛋白质的一段DNA序列。,调控基因(regulatorgene)：指其表达产物参与调控其它基因表达的基因。,重叠基因(overlappinggene)：指在同一段DNA顺序上，由于阅读框架不同或终止早晚不同，同时编码两个以上基因的现象。,隔裂基因(splitgene)：指基因内部被一个或更多不翻译的编码顺序即内含子所隔裂。内含子(intron)：DNA序列中不出现在成熟mRNA的片段；外显子(extron)：DNA序列中出现在成熟mRNA中的片段。外显子：参加蛋白质编码的DNA片段；内含子：不参加蛋白质编码的DNA片段。,跳跃基因(jumpinggene)：即转座因子，指染色体组上可以转移的基因。实质：能够转移位置的DNA片断。功能：在同一染色体内或不同染色体之间移动引起插入突变、DNA结构变异（如重复、缺失、畸变）通过表现型变异得到鉴别。遗传工程：转座子标签法。,.假基因(pseudogene):同已知的基因相似，处于不同的位点，因缺失或突变而不能转录或翻译，是没有功能的基因。真核生物中的血红素蛋白基因家族中就存在假基因现象。,四、基因的作用与性状的表现rRNA如发生致死突变，不能形成核糖体，易死亡。DNAtRNA发生突变后，多肽链改变。mRNA翻译蛋白质结构蛋白直接性状表达生物酶间接,五基因表达调控,基因组(genome)：一个细胞或病毒所携带的全部遗传信息或整套基因。基因表达(geneexpression)：在一定调节机制控制下，基因经过转录及翻译，产生具有特异生物学功能的蛋白质分子的过程。rRNAtRNA的合成也属于基因表达。,时间特异性(temporalspecificity)空间特异性(spatialspecificity),基因表达特性,基因表达的方式,组成性表达诱导和阻遏表达,基因表达的多级调控,基因激活转录起始转录后加工及转运翻译翻译后加工,第五节遗传工程,一、遗传工程的含义二、染色体工程三、细胞工程四、基因工程,一、遗传工程的含义,生物技术生物工程：遗传工程；蛋白质工程、酶工程；微生物工程；遗传工程：在分子遗传理论、技术的基础上，通过工程设计与施工方式，从细胞、分子水平改造生物遗传特性。,作为一个综合性的技术群体系，广义的遗传工程包含许多相关的组成部分，其主要的部分有三个：1.染色体工程；2.细胞工程；3.基因工程。狭义的遗传工程指的是基因工程。,二、染色体工程,染色体工程是物种间遗传转移的最传统的方式，也是目前广泛进入生产应用的遗传工程。,(一)、种间有性杂交,生殖隔离是物种形成的原因之一，也是染色体工程面临的第一个难题，获得种间有性杂种的难易直接影响外源基因导入栽培作物。种间杂交障碍的机制可能截然不同，其表现阶段也各不相同。目前认为，种间杂交产生杂种的障碍可能表现在以下几个阶段：受精前柱头和花柱中的障碍；受精过程中的障碍；受精后胚与种子发育过程中的障碍。,受精前障碍与克服,障碍机制：物种间花粉管与雌蕊不亲和，在花粉管到达胚珠之前，停止伸长而不能受精。主要克服办法：主要是选择适当的授粉时期，采用正反杂交、蒙导授粉、植物生长调节剂等。另外，有明确试验证据表明，栽培物种和野生种内均存在可杂交性遗传变异，并受简单遗传控制。利用可杂交性基因，能提高种间杂交的效率。,受精过程的障碍与克服,被子植物受精过程属于双受精，对种间杂交受精过程的生殖生物学研究表明：种间杂交的失败往往是由于双受精之一失败引起的。讫今为止，人们对受精的控制机制知之甚少，所以这一领域明显是一个有风险，但又极可能富有成效的研究领域。,受精后发育障碍与克服,受精过程的障碍机制：受精胚珠发育过程中也经常由于胚、胚乳和母本组织发育异常或发育不平衡而最终不能产生种间杂种种子。克服方法：常用技术是从生理角度进行调节，如：采用植物生长调节剂或去除母本植株的营养生长中心。近年研究表明：提高亲本倍性水平，可能有利于胚珠发育。通过离体培养方法可以挽救可能(即将)败育的杂种胚。一般而言，达到心形期或以后的胚更易于培养成功。,(二)、染色体操作,染色体微切割；染色体置换。,三、细胞工程,细胞工程的主要技术和研究领域包括：细胞、原生质体的分离、培养；细胞、原生质体植株再生；体细胞无性系变异的诱导、筛选与应用；以细胞、原生质体作为基因工程受体；细胞、原生质体融合、杂种细胞筛选、鉴定与应用。,(一)、细胞、原生质体植株再生,采用体细胞杂交在物种间进行遗传转移与应用的必要条件是：细胞、原生质体遗传全能性能充分实现，再生成新的生物个体。对植物而言，细胞和原生质体再生技术已经比较成熟。对动物而言，克隆羊“多利”的诞生表明：动物细胞(包括人体细胞)再生成为个体都是可能，其技术实现需要的仅仅是时间。,(二)、植物原生质体作为基因工程的受体,最初常用的转基因受体有叶圆片、幼胚、愈伤组织等植物组织器官。在这些组织、器官中：细胞壁的存在会增加操作的难度；产生细胞嵌合体现象，难以筛选转化子。因此原生质体是最具潜力的植物基因工程受体，转化效率高、筛选方便。,(三)、细胞、原生质体融合,采用细胞、原生质体融合产生杂种细胞，通过诱导再生获得杂种个体(双二倍体)，可避免有性杂交障碍。植物细胞融合由于细胞壁的存在而受到极大的限制。因此，去除细胞壁分离原生质体的技术是植物细胞杂交的基础。获得杂种细胞及其再生植株后，即可进行物种间细胞核、染色体以及细胞器的转移。,四、基因工程,基因工程的基本步骤可以概括为：目的基因的获得(基因克隆)；目的基因与载体连接(DNA分子重组)；重组DNA分子导入受体；转化子的筛选、鉴定。,限制性内切酶与DNA连接酶,细菌细胞内特异性降解外源(异源)核酸分子的核酸酶。其作用特点是：特异性降解异源DNA分子(甲基化修饰差异)；I类限制酶随机切割双链DNA分子，II类限制酶识别、切割特殊的回文(对称)序列；II类限制酶交错切割DNA双链，产生粘性单链末端。来源不同、具有相同粘性末端DNA片段在DNA连接酶的作用下可准确连接形成重组DNA分子。通常使用来自T4噬菌体DNA连接酶。重组DNA技术是基因工程最核心的技术，贯穿于整个基因工程各个步骤中。,载体(vector),用于承载、克隆、转移目的基因(DNA片段)，能自我复制的DNA分子。在基因克隆时：将目的片段转移到宿主细胞中进行复制克隆克隆载体；在基因导入受体时：将目的片段转移到受体细胞中并进行使之表达转化载体或表达载体。,常用基因工程载体有：细菌质粒(克隆)；噬菌体(克隆)；柯斯质粒(克隆)；穿梭质粒(克隆/表达)；细菌人工染色体(克隆/表达)；酵母人工染色体(克隆/表达)；Ti质粒及其衍生载体(转化)。,(一)、目的基因的获得,基因工程最主要的特点是其定向性，也就是对特定的基因进行操作。因此分离目的基因并获得足够的拷贝数(基因克隆)是基因工程及相关研究工作的前提。1.基因库构建与目的基因分离；2.PCR扩增、克隆基因；3.化学法合成基因。获得目的基因后可进行的研究还包括：序列分析、结构分析、表达机制以及表达机制研究。,克隆(clone)的含义,名词(clones)：克隆、无性系。生物个体、细胞的无性系；同一基因或DNA片段的多份拷贝。动词(cloning)：克隆。细胞克隆：从单个细胞产生一组具有同样遗传组成的细胞；分子克隆：获得单个基因/DNA片段多份拷贝。常用的方法有将带有目的片段的重组DNA分子导入到特定宿主细胞中，利宿主细胞DNA复制系统进行复制；利用DNA聚合酶在无细胞系统中复制(PCR,聚合酶链式反应)。,基因库构建与目的基因分离,基因库(基因文库)：包含特定基因组所有基因、DNA区段的全部分子克隆的集合体。根据分子克隆中所含核酸片段的类型，基因库可分为：核基因库、染色体库、cDNA库和线粒体库等。,(二)、转基因受体,转基因受体的种类和特性对目的基因导入、导入后筛选、受体的再生等都有很大的影响。植物基因工程常用受体包括：组织、器官、悬浮培养细胞、未成熟胚、合子以及原生质体等。可分别通过器官发生、胚状体或直接发育而获得转基因植株。,(三)、目的基因导入受体,将目的基因导入受体，并整合到受体染色体上是基因工程目标实现的关键环节。在基因工程研究领域的人们倾向于把所有将外源基因导入受体的过程称为转化(transforming)，将接受外源基因并整合到染色体上的细胞、个体称为转化体/转化子(transformant或transgenic)。最常用转化方法是：载体导入；理化方法导入(微注射、基因枪、电穿孔法、化学法)；,1.载体法导入外源基因,载体法将目的基因连接到特定的载体(转化载体)上，利用载