金刚藤抗炎活性部位群的提取纯化工艺及其质量分析研究(1)1 - 副本

南京中医药大学翰林学院药学系毕业设计（论文）开题报告课 题 名 称：金刚藤抗炎活性部位群的提取纯化工艺及其质量分析研究 学 生 姓 名： 学 号： 专 业： 指 导 教 师： 实 习 单 位： * 南京中医药大学翰林学院药学系2015年 3 月 7 日南京中医药大学本科毕业设计(论文)开题报告学生姓名学号专业/年级/班级指导教师姓名职称所在单位或部门课题来源自选课题类型基础研究课题名称金刚藤抗炎活性部位群的提取纯化工艺及其质量分析研究毕业设计（论文）的内容和意义 内容 1. 金刚藤抗炎活性部位群的提取工艺研究 2. 金刚藤抗炎活性部位群的纯化工艺研究 3. 金刚藤提取纯化工艺中试放大研究 4. 金刚藤提取物的指纹图谱研究意义：以金刚藤为原料制成的金刚藤胶囊、金刚藤糖浆、金刚藤片等制剂,用于治疗慢性盆腔炎、附件炎等妇科炎症,疗效肯定,深受广大患者的欢迎,是医务工作者治疗妇科炎症疾患的首选药物。金刚藤胶囊为湖北福人药业有限公司的主导品种,年收入国家基本治疗药物目录。但上述金刚藤制剂为传统工艺制备,生产工艺较落后,存在着药效物质基础不明确,质量可控性差,药物稳定性难以控制,科技含量不高,服用剂量大等弊端,不符合现代临床用药的要求。本论文采用大孔吸附树脂纯化等中药现代化共性关键技术,对金刚藤抗炎活性部位进行了提取纯化工艺研究并建立了金刚藤提取物较为完善的质量标准和指纹图谱,为金刚藤传统制剂的二次开发奠定基础。 研究方案和技术路线1. 金刚藤抗炎活性部位群的提取工艺研究精密吸取金刚藤提取液l0mL，作为供试品溶液，测定其中总皂普、总黄酮及总软质的含量。另精密吸取25mL金刚藤乙醇提取液，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴将其蒸干，在105温度下干燥3小时，然后放置干燥器内，冷却30分钟后迅速称定重量，计算干膏收率。2. 金刚藤抗炎活性部位群的纯化工艺研究将三种大孔吸附树脂按上述方法处理(抽滤至不滴水为止)，精密称取1g，置100mL磨口三角瓶中，精密加入供试品药液50mL，置振荡器上持续振摇24h，使其充分吸附后，取上层液分别测定总黄酮总皂普和总权质的浓度。树脂饱和吸附量计算公式:饱和吸附量=(初始浓度一吸附后浓度)*吸附液体积/树脂量。将饱和吸附的树脂取出，置100mL磨口三角瓶中，加入一定体积70%乙醇，置振荡器上持续振摇12h，使其解吸附，取上层液分别测定总黄酮、总皂普和总鞋质的浓度。并按下式计算洗脱率:洗脱率=(洗脱液浓度*洗脱液体积)/饱和吸附量*100%。3. 金刚藤提取纯化工艺中试放大研究取72kg金刚藤饮片，加8倍量70%乙醇加热回流，共提取三次，第一、二次各2h，第三次1h，合并滤液，减压回收乙醇至一定体积，抽滤得0. 2 gmL-1(相当于原生药)上样药液。取D101型大孔树脂(药用级)20kg，用适量乙醇浸泡，湿法装柱，并用大量乙醇冲洗，不时检测流出液，至与水混合不呈白色浑浊为止(取5mL乙醇加5mL水)。然后用大量的蒸馏水洗去乙醇，备用。4. 金刚藤提取物的指纹图谱研究取金刚藤提取物(批号20090320)，按上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，并按上述色谱条件测定，分别于0h, 3h, 6h, 9h, 12 h测定5次，记录其HPCE图谱。以8号峰为参照峰(S)，计算各峰的相对保留时间和相对峰面积，结果符合指纹图谱的技术要求，其共有峰的峰面积比值的RSD均小于5%，共有峰相对保留时间的RSD均小于2%。研究进度第一阶段：2017年3月上旬：文献综述思路形成，实验方案制定；第二阶段：2017年3月下旬：初步试验、实验条件选择；第三阶段：2017年4月至5月：进行实验研究；第四阶段：2017年5月至六月：整理数据，撰写论文。特色与创新1、 对金刚藤提取物进行了较系统的质量分析研究，采用薄层色谱法，以槲皮素、薯蓣皂苷元为对照品，对金刚藤提取物进行了定性鉴别;采用可见一紫外分光光度法，对金刚藤提取物中总皂苷、总黄酮、总鞣质进行了含量测定，方法稳定，可靠性强。.为制定金刚藤提取物的质量标准提供了科学依据。指导教师意 见指导教师签名： 年 月 日教研室或实习单位意 见负责人签名： 年 月 日学院意见 常务副主任签名： 年 月 日南京中医药大学翰林学院毕业设计（论文）选题审批表学生姓名学号专业/班级设计（论文）选题名称金刚藤抗炎活性部位群的提取纯化工艺及其质量分析研究选题依据及准备情况：金刚藤，又名“菝葜，为百合科(Liliaceae)植物获莫Smilax china L.的干燥根茎。为较常用中药，具有祛风利湿、解毒散疲的功效，用于筋骨酸痛、小便淋漓、带下量多、疗疮痈肿等症。中医临床用于治疗妇科炎症、消除包块、肿瘤等疾患;现代药理研究表明，金刚藤提取物具有明显抗炎和抑菌作用。慢性盆腔炎、附件炎、附件炎性包块等妇科炎症是妇科常见病，多发病。这类疾患不仅严重影响女性身心健康，而且造成家庭和社会负担。传统的治疗方法多采用抗生素，长期使用可使患者产生耐药且易造成双重感染。传统中医药治疗慢性盆腔炎、附件炎、附件炎性包块有着悠久历史和丰富经验。中医理论认为，月经不调、下腹痛、带下和疲痕等症状是由于下焦湿热疲积或创伤疲滞、脉络受阻、气血不畅而致。临床用药以清热解毒、活血化疲为治则，远期疗效显著，形成中药治疗的优势。以金刚藤为原料制成的金刚藤胶囊、金刚藤糖浆、金刚藤片等制剂，用于治疗慢性盆腔炎、附件炎等妇科炎症，疗效肯定，深受广大患者的欢迎，是医务工作者治疗妇科炎症疾患的首选药物。金刚藤胶囊为湖北福人药业有限公司的主导品种，2002年收入国家基本治疗药物目录。但上述金刚藤制剂为传统工艺制备，生产工艺较落后，存在着药效物质基础不明确，质量可控性差，药物稳定性难以控制，科技含量不高，服用剂量大等弊端，不符合现代临床用药的要求。本论文采用大孔吸附树脂纯化等中药现代化共性关键技术，对金刚藤抗炎活性部位进行了提取纯化工艺研究;并建立了金刚藤提取物较为完善的质量标准和指纹图谱，为金刚藤传统制剂的二次开发奠定基础。指导教师意见： 指导教师签字： 年 月 日常务副主任意见： 签字： 年 月 日文献综述：金刚藤抗炎活性部位群的提取纯化工艺及其质量分析研究 摘要：以金刚藤为原料制成的金刚藤胶囊、金刚藤糖浆、金刚藤片等制剂，用于治疗慢性盆腔炎、附件炎等妇科炎症，疗效肯定，深受广大患者的欢迎，是医务工作者治疗妇科炎症疾患的首选药物。金刚藤胶囊为湖北福人药业有限公司的主导品种，2002年收入国家基本治疗药物目录。但上述金刚藤制剂为传统工艺制备，生产工艺较落后，存在着药效物质基础不明确，质量可控性差，药物稳定性难以控制，科技含量不高，服用剂量大等弊端，不符合现代临床用药的要求。采用大孔吸附树脂纯化等中药现代化共性关键技术，对金刚藤抗炎活性部位进行了提取纯化工艺研究;并建立了金刚藤提取物较为完善的质量标准和指纹图谱，为金刚藤传统制剂的二次开发奠定基础。 关键词： 金刚藤；提取春花工艺；质量标准；指纹图谱1、金刚藤的研究概况1.1生物学研究金刚藤为百合科植物金刚藤(smilax china L.)的干燥的根茎。又名获莫(履岩本草)，始载于名医别录，别称金刚骨(儒门事亲)，铁菱角(本草纲目)，假萆(岭南采药录)，金巴斗(中国树木分类学)，冷饭团(广州植物志)，马加勒(江西中草药学)等。金刚藤，药用部位为根茎，茎、叶亦可入药。金刚藤根茎药材性状为:略呈圆柱形，稍弯曲，结节状。其外表褐紫色，凹凸不平，略有光泽。结节膨胀处有坚硬的须根残基和芽痕，其先端留有坚硬的细根断痕。质坚硬，不易折断，断面呈黄棕色，略显粗纤维性。无臭，味酸，甘，微苦。1.2药理作用研究杜德极等研究发现复方金刚藤水、醇提取物灌胃能抑制大鼠角叉菜胶性及蛋清性足肿胀，对二甲苯致小鼠耳肿胀也有一定抑制作用。冯艺文等用金刚藤无糖颗粒灌胃给药，在11.2g生药/kg一90g生药/kg剂量下，对大鼠角叉菜胶足肿、小鼠巴豆油性耳肿有非常显著的抑制作用; 在22.5 g生药/kg一9Og生药/kg剂量下对大鼠棉球肉芽肿，也具有明显的抑制作用。陈东生、吕永宁等用金刚藤水煎液高剂量(100gkg-1)和低剂量(50gkg-1)，分别对小白鼠给药，在灌胃7天之后，眼眶取血，采用derive法测定FIB，采用凝固比浊法对APTT, PT进行测定，采用比浊法体外测定其水煎液对人血小板的聚集功能Ma, M1, V1的影响，采用全自动血细胞计数仪测定血小板数。结果显示金刚藤水煎液的高剂量能显著延长APTT (P0. 05)，金刚藤的水煎液稀释8倍后能抑制体外的血小板聚集功能，尤其是对V1的影响更显著(P0.O1)，但是对血小板数和FIB无明显影响。2、大孔吸附树脂的研究概况大孔吸附树脂是70年代以来发展起来的一种有机高聚吸附剂，具有对有机化合物选择性吸附的能力。它的吸附作用主要是通过表面吸附、表面电性或形成氢键。树脂吸附法是非常有效、而且工艺简单、生产成本较低的一种提取分离中药中有效成分或有效部位的方法。2.1大孔吸附树脂的性质大孔吸附树脂是一种新型非离子型高分子聚合物吸附剂，一般为白色的球状颗粒，粒度在20-60目之间，大孔树脂的宏观小球是由许多彼此间存在孔穴的微观小球组成。目前常用的为苯乙烯型和丙烯睛型，在树脂合成时引入一定极性基团则成为极性树脂，从而可以增强吸附力。大孔吸附树脂在溶液中是通过物理吸附有选择地吸附中草药的有效成分，达到分离纯化的目的，其理化性质较稳定，不溶于酸碱和有机溶剂，对有效成分选择性好，不受无机盐类及强离子、低分子化合物的干扰。大孔吸附树脂按其极性大小和所选单体分子结构不同，可分为四种:非极性、中等极性、极性和强极性。非极性的大孔吸附树脂有苯乙烯、二苯乙烯聚合物，也称芳香族吸附剂;中等极性的大孔吸附树脂有聚丙烯酸醋型聚合物，以多功能团的甲基丙烯酸醋作为交联剂，也称脂肪族吸附剂;极性大孔吸附树脂一般含有硫氧、酸胺基团，如丙烯酞胺;强极性大孔吸附树脂一般含有氮氧基团，如氧化氮类。2.2大孔吸附树脂在中草药分离纯化的应用杨桦，邓晓静等采用AB-8型大孔吸附树脂提取喜树碱，可使其含量达到90%，而且可以完全将有机洗脱溶媒蒸出，在产品中没有残留。蓑营碱、小果碱可采用非极性吸附树脂吸附。而弱极性或非极性大孔树脂对力乌总生物碱有比较好的分离效果，实验表明可分离出样品溶液中85%以上的乌头类生物碱，同时可以将浸膏总量82%的不溶性固体杂质除去。大孔吸附树也可以应用于提取分离穿心莲内醋和桅子黄色素。提取穿心莲内醋时应尽量用极性大的树脂，可以把色素很好的除去，使穿心莲内醋的含量提高。范云鸽，张秀莉等采用ADS-7型树脂提取分离穿心莲总内醋，此树脂吸附量较高，能与杂质分离且脱附容易，可得到质量较好的穿心莲总内醋产品。桅子黄色素的提取可用G-2吸附树脂，能很好的去除杂质如桅子苷等。3、高效毛细管电泳的研究概况毛细管电泳(CE，capillary electrophoresis)又称高效毛细管电泳(HPCE, high-performance capillary electrophoresis)，是经典的电泳技术和现代微柱分离相结合的产物，是近年来发展最快的分析方法之一。高效毛细管电泳技术具有分离效率高、分析速度快、实验成本低、消耗少、仪器结构简单、操作模式多、可实现自动化等特点，越来越广泛地应用于生物化学、分子生物学等多个生命科学领域。毛细管电泳(capillary electrophoresis)是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，利用被分析样品中各组成之间淌度和分配行为上的差异，而实现分离的一类液相分离技术。在高电压作用下，双电层中的水合阳离子层引起溶液在毛细管内整体向负极流动，形成电渗液。带电粒子在毛细管内电解质溶液中的迁移速度等于电泳和电渗流(EOF)二者的矢量和。带正电荷粒子最先流出;中性粒子的电泳速度为“零”，故其迁移速度相当于EOF速度;带负电荷粒子运动方向与EOF方向相反，因EOF速度一般大于电泳速度，故它将在中性粒子之后流出;各种粒子因迁移速度不同而实现分离。参考文献：1 刘思学. 中医治疗慢性盆腔炎的临床经验J. 内蒙古中医药. 2012(23) 2 李世蓉,张三元. 盆腔炎性疾病发病机制的现代研究J. 中国妇幼保健. 2011(27) 3 张樱山,李文雅,赵晖,张琪. 红花如意丸治疗大鼠慢性盆腔炎的研究J. 中国实验方剂学杂志. 2011(15) 4 杨怡姝,孙晓娜,王小利,沈思嗣,李泽琳,曾毅. 实时荧光定量PCR技术的操作实践J. 实验室研究与探索. 2011(07) 5 徐艳华,苗明三,徐鹏,冯素香. 毛冬青有效部位中总黄酮含量测定J. 中医学报. 2011(07) 6 冯书梅,孙维峰. 慢性盆腔炎动物模型子宫病理学改变与血流变学关系J. 临床与实验病理学杂志. 2011(05) 7 徐丽华,刘春雷,常玉梅,梁利群,刘金亮,高国强,韩启霞. 双标准曲线相对定量PCR试验原理与方法J. 生物技术通报. 2011(01) 8 宋国卫,虞慧娟. 慢性盆腔炎中医药治疗基础研究概述J. 中国民族民间医药. 2010(14) 9 黄丽,孙培文,罗隽,李新中. 慢性盆腔炎模型的建立与评价J. 中南药学. 2010(06) 10 卢如玲,许丽绵,操红缨,桑霞,李莉. 盆炎康合剂对慢性盆腔炎大鼠盆腔粘连及病理形态学的影响J. 新中医. 2010(01) 11 Inamullah Khan,Muhammad Nisar,Farooq Ebad,Said Nadeem,Muhammad Saeed,Haroon Khan,Samiullah,Fazli Khuda,Nasiara Karim,Zia Ahmad. Anti-inflammatory activities of Sieboldogenin from Smilax ch