电子克隆课件.ppt

电子克隆简介,南京农业大学生命科学学院 沈文飙,什么是电子克隆 拼图游戏一样的原理 应用 如何做拼图游戏 常用软件及网络资源简介 优点与缺点的讨论 现状与展望,什么是电子克隆,Watson & Crick 成功解析了DNA分子二级结构，开创了分子生物学时代 Karry Mullis 发明了PCR反应，体外大规模、有目的和快速地克隆目标基因成为可能 信息科学技术特别是数据库技术在战后飞速发展,什么是电子克隆,表达序列标签（expressed sequence tags，EST）是对某个基因cDNA克隆测序所得的部分序列片段，长度大约为200600bp 由于基因表达调控作用不同，同一个基因的mRNA剪接位点和方式不同，所以同一个基因的全长cDNA可能包含多个EST EST既代表了基因cDNA的某一区段，也表征了成熟mRNA可能的剪接方式,什么是电子克隆,电子克隆技术是生物学数据库中EST数据库、核酸序列数据库、基因组数据库，采用同源性序列比对和归类分析、重叠区域组装和拼接等方法延长EST序列，直至没有与之同源的序列可供拼接为止，所得到的序列可以认为是相对应基因的全长cDNA，根据所得的cDNA序列设计囊括开放阅读框两端的引物，进行RT-PCR克隆出相应基因的方法,什么是电子克隆,传统的克隆方法是利用基因特异性引物大量扩增cDNA末端或构建cDNA文库并采用原位杂交进行筛选，实验进程长、步骤繁琐、成本高、得率低；运用电子克隆的方法延伸得到的cDNA几乎囊括了所有疑似为目的基因的cDNA序列，无论表达转录如何调控，都能通过PCR扩增出表达的那一段基因 传统的方法如同小规模地捕捞一条或几条鱼，电子克隆与之相比就如同集约化地捕捞一群鱼,拼图游戏一样的原理,相近的物种在核酸序列上有相似性，相近物种中的同源基因序列在一定程度上可以代表目的基因的序列 可代表程度与两序列的相似度直接相关，加之遗传密码的简并性，这种混同在理论上是可行的 ，但需要作同源性检验以克服主观因素的影响,拼图游戏一样的原理,借助计算机找到具有相同或相似图案的图块，拼成完整的图案，我们需要做的是进行局部的微调。 剩下的工作就是对拼接出的cDNA进行可能的开放阅读框的分析，设计囊括开放阅读框两端的引物，RT-PCR扩增侯选基因,应用,电子克隆主要应用于两个方面： 一个是利用EST序列检索同源性序列，并由此拼接cDNA序列以期挖掘新基因 另一方面是在全基因组已经测序的物种中，研究整个基因组序列以推测其中可能尚未发现的基因 目前应用比较广泛的是第一方面,应用,数据库查询 数据库比对 文件下载 序列分析 序列装配 分子模型 结构分析 功能分析,应用,在全基因组已经测序的物种中推测新基因的步骤如下： 分析和定位开放阅读框 虚拟翻译并对多肽链序列检索比对 可靠性检查 分析与之相关的调控序列,如何做拼图游戏,以电子克隆新的水稻过氧化氢酶（catalase，CAT）基因为例，简介延伸cDNA的流程： 以登录号为CA759712的EST在对其在核酸序列数据库中进行BLAST检索比对时，发现登录号为CB652681的序列推测为水稻CAT基因的部分序列，与信息标签 EST具有比较高的同源性，该EST序列将作为种子序列,如何做拼图游戏,将检索得到的同源序列保存到PC机上，运行DNAStar软件包，将上述序列输入，由于基因测序是借助质粒载体完成的，序列中难免混有载体序列，因此需要运行程序查找载体序列，对序列进行末段修剪去掉冗余部分,如何做拼图游戏,程序根据外显子和内含子的编码规则和排布方式搜索和定位开放阅读框，开放阅读框是电子克隆的重点研究对象；接着，程序对各段序列的重复序列和差异序列进行逐一检索和比对，并对重叠区域进行拼接和组装，构建重叠序列群 以上各步骤由程序自动完成,如何做拼图游戏,以构建的重叠序列群为信息标签，进一步检索比对，搜索其高度同源序列 如果发现了与之高度同源的未知序列，则重复上述步骤；若没有新的发现，说明拼接组装得到的EST可能囊括了所以可能的目的基因序列 根据以上步骤，得到了一个全长为1678 bp的EST序列,如何做拼图游戏,以此EST序列为cDNA序列，对其设计囊括整个开放阅读框的特异性引物，设计得到的上游引物为：5-CTA-GCC-CAC-TAC-CAT-GGA-TCC-TTG-3，下游引物为：5-CAG-AAT-TTC-TGT-AGC-CTT-GCT-GAT-3， 引物的具体合成可交由经营分子生物学相关产业的公司商业化合成,2019/11/17,17,可编辑,如何做拼图游戏,对延伸出的cDNA其作人工的可靠性验证 提取水稻中总RNA，进行RT-PCR，电泳检测结果 转录调控的研究,常用软件及网络资源简介,DNAStar是一款电子克隆中常用的软件包，它以功能全面和强大而著称，它主要包括以下几个应用程序：EditSeq、GeneMan、GeneQuest、MapDraw、MegAlign、PrimerSelect、Protean、和SeqMan II,常用软件及网络资源简介,EditSeq是输入并且修剪DNA或蛋白质序列的工具。EditSeq能读取大部分的序列格式，也可以通过使用键盘输入，或者从其他地方复制、粘贴得到。序列被打开后，EditSeq能使用标准或者指定的遗传密码进行翻译或反翻译、寻找开放读框以及进行阅读校对,常用软件及网络资源简介,GeneQuest可以发现注释DNA序列中的基因，并提供相关的参数，包括ORF、拼接位点、转录因子结合位点、重复序列、限制性内切酶酶切位点等。通过应用“methods”命令，序列的各项相关信息和参数可以以图形的形式展示出来。,常用软件及网络资源简介,MapDraw可以制作简单的线性图到有注释的环形图，在展示限制性酶切位点的同时，还可以同时展示序列的feature、开放阅读框及其翻译结果。MapDraw工具主要应用与规划酶切位点和克隆实验，产生详细和充分的结果概括,常用软件及网络资源简介,MegAlign提供了比对方法，进行DNA和蛋白质序列的配对和多序列比较。多序列比对可以在MegAlign的工作界面中进行查看和编辑。可以根据队列的结果制作进化树，有关序列距离的数据和残基替代可以作成表格,常用软件及网络资源简介,PrimerSelect能够辅助设计引物和探针。输入DNA、RNA 或反向翻译的蛋白质模板序列后，PrimerSelect可以在计算序列的各种参数，用户可以通过控制各种参数限定计算结果。在模板处理后，PrimerSelect按照用户定义的参数确定引物的位置，并给引物评分，然后筛选出模板序列上的最佳引物序列。,常用软件及网络资源简介,美国国家生物信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI），/ 美国冷泉港实验室（Cold Spring Habor Laboratory，CSHL），/ 欧洲分子生物学信息网（European Molecular Biology Net，EMBnet），/,常用软件及网络资源简介,欧洲分子生物学实验室（European Molecular Biology Laboratory，EMBL），http:/www.embl-heidelberg.de/ 日本国立遗传研究所（National Institute of Genetics，NIG），http:/www.ddbj.nig.ac.jp/ 北京大学生物信息学中心（Peking University Center of Bioinformatics，PKUCBI），,优点与缺点的讨论,与传统的基因克隆方法相比，电子克隆有以下的优点： 简便快速，成本低廉，设备简单 对操作人员技术要求不高 成功率高,优点与缺点的讨论,尽管电子克隆在理论上已没有什么障碍，然而在实际操作中依然存在些不足之处： 电子克隆得到的cDNA序列是由计算机虚拟出来的，现实中可能并不存在 研究人员不可完全迷信软件提供的结果，最好对分析做人工可靠性验证 普遍适用性较差 电子克隆后需要研究其指导合成的蛋白质的功能才更有实际意义,现状与展望,国外的科研人员做了许多有益的贡献，特别是水稻、拟南芥等全基因组测序完成后，借助软件分析，从中发现和克隆了一系列全新的基因 我国的研究人员也进行不少的具有建设性和创造性的探索和尝试，也取得了令人鼓舞的成果,现状与展望,随着科学技术的不断发