当归多糖的分离、纯化及分析鉴定.doc

当归多糖的分离、纯化及分析鉴定作者：商澎杨铁虹贾敏梅其炳赵文明曹之宪赵德化【关键词】当归/分离和提纯关键词:当归/分离和提纯；当归/分析；多糖摘要:目的从新鲜中国当归Angelicasinensis（Oliv）Diels中分离纯化出多个多糖组分，并对其理化性质进行分析鉴定.方法采用水煮乙醇沉淀法从新鲜当归中提取当归总多糖AP-0；AP-0用80g・；kg-1十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）沉淀得到当归多糖亚组分AP-1；CTAB处理后的上清用10g・；kg-1H3BO3，2mol・；L-1NaOH处理得到当归多糖亚组分AP-2；所剩上清，用乙酸处理后，再用乙醇沉淀，得到当归多糖亚组分AP-3.总糖含量测定采用改良苯酚-硫酸法；蛋白质含量测定采用ServaBlue-G染料结合法；糖醛酸含量测定采用间羟基连苯法.采用新华中速滤纸纸色谱和硅胶G薄层色谱分析多糖各组分的单糖组成.高效凝胶过滤色谱和高效离子交换色谱分析多糖各组分的Mr分布和电荷性质.红外光谱法分析多糖各组分的糖苷键构成.结果AP-0总糖970g・；kg-1，其中糖醛酸210g・；kg-1，蛋白质30g・；kg-1；AP-1总糖970g・；kg-1，其中糖醛酸172g・；kg-1，蛋白质30g・；kg-1；AP-2总糖830g・；kg-1，其中糖醛酸257g・；kg-1，蛋白质170g・；kg-1；AP-3总糖970g・；kg-1，其中糖醛酸86g・；kg-1，蛋白质30g・；kg-1.AP-0，AP-1，AP-2和AP-3主要由葡萄糖，阿拉伯糖和少量糖醛酸组成.AP-0，AP-1，AP-2和AP-3分别由5种不同分子量多糖部分组成；在电荷特性上又可分别分为4个不同部分.红外光谱提示4种多糖的糖链构型为-D-葡萄吡喃型.结论当归多糖的分离纯化方法有效、实用；得到的AP-0，AP-1，AP-2和AP-3为具有不同理化性质的多糖组分.Keywords:angelicasinensis/isolation&；purification；angelicasinensis/analysis；polysaccharidesAbstract:AIMToisolateandtopurifysomepolysaccha-ridesfractionsfromAngelicasinensis（Oliv.）Dielsandtoan-alyzeandtodeterminethecharactersofeachfraction.METHODSHotwaterextractingandethanolprecipitatingmethodwasemployedtoisolatetotalpolysaccharide（namedAP-0）fromfreshrootsofAngelicasinensis.BytreatingAP-0with80g・；kg-1CetyltrimethylammoniumBromid（CTAB），theAP-1wasobtainedfromtheprecipitate.AP-2wasobtainedfromtheprecipitatebytreatingthesupernateleftfromprecedingstepwith1g・；kg-1H3BO3，2mol・；LNaOH.Aftertreatingtheleftsupernatewithacetaticacidandprecipitingwithethanol，AP-3wasobtained.Theamountsoftotalcarbohydrates，proteinsanduronicacidsweredeterminedwithimprovedphenol-sulfuricacid，ServaBlueGdyebindingandm-hydroxyldiphenylmethods，respec-tively.Themonosaccharidescontainedineachpolysaccha-rideswereanalysedbyusingpaperchromatographyandthin-layerchromatography.Highperformancegelfiltrationchro-matographyandhighperformanceanion-exchangechro-matographywereemployedtodeterminetherelativemolecu-larmassesandchargecharactersofeachpolysaccharides.In-fraredspectrophotometerwasusedtoanalyzethestructuresofglucosidebondsofeachsample.RESULTSFourAngeli-capolysaccharideswereobtained.Thetotalcarbohydrates，uronicacidsandproteinsofeachAngelicapolysaccharideswere:970g・；kg-1，210g・；kg-1and30g・；kg-1ofAP-0；970g・；kg-1，172g・；kg-1and30g・；kg-1ofAP-1；830g・；kg-1，257g・；kg-1and170g・；kg-1ofAP-2；970g・；kg-1，86g・；kg-1and30g・；kg-1ofAP-3.ThemonosaccharidesconstituentsoftheFourAngelicapolysaccharideswereglu-cose，arabinoseanduronicacids.4Angelicapolysaccharideswerecomposedof5fractionswithdifferentMrand4frac-tionswithdifferentchargecharacters，respectively.Infraredspectrumsuggestedthattheglucosidebondsbe-D-glucopyranose.CONCLUSIONMethodsofpurificationandanalysiswereeffectiveandpracticalforthepreparationofAngelicapolysaccharides.4Angelicapolysaccharidesweredifferentintheirphysico-chemicalcharacters.0引言多糖作为一类重要的生物大分子，具有广泛的生物学作用1，2，但由于多糖分离纯化和结构分析等多方面的限制，大多数多糖仍作为有效部位或条件提取物进行应用.药理学研究，要求所用药物应具有均一、可控的理化性质，以保证实验结果的一致性和可比性.我们参考梅其炳等3-6和Yamada等7-9当归多糖的提取与分离方法，建立了从中国当归中分离提取出总多糖，并进一步分离纯化得到不同多糖组分的方法；并对所得到的多糖组分的理化性质进行分析.1材料和方法1.1材料新鲜中国当归Angelicasinensis（Oliv）Diels，于霜降后3d，采自甘肃省岷县城郊乡叠藏河谷地.950g・；kg-1乙醇（AR），透析袋（截留Mr8000，购自华美生物工程公司），十六烷基三甲基溴化铵（AR，西安化学试剂采供站），硼酸、氢氧化钠、乙酸、浓硫酸、四硼酸钠、正丁醇、乙酸乙酯、吡啶、乙酸苯胺、邻苯二甲酸（均为AR，西安化学试剂厂生产）.苯酚（AR重蒸馏，华美生物工程公司）.间羟基连苯（AR，美国Sigma公司）.ServaBlue-G（德国ServaFeinbochemic）.牛血清白蛋白（华美生物工程公司）.溴化钾（GR，西安化学试剂厂）.新华中速滤纸（杭州新华试纸厂）.碳酸钡（CP，天津化学试剂厂）.D-葡萄糖（AR，西安化学试剂厂）.L-阿拉伯糖（AR，Sigma），D-木糖（中国医药公司德国进口分装），D-甘露糖（上海试剂二厂），D-半乳糖（北京市化学试剂研究所），D-鼠李糖（北京化学试剂公司），D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸（SigmaChemical），硅胶G、羧甲基纤维素（天津化学试剂厂），FlukaDextranStandard:12000，50000，80000，670000（重均相对分子质量Mr分别为:11600，48600，80900，667800，瑞士Fluka），PharmaciaDextranStandard:T-10，T-40，T-70，T-500和T-2000（Mr分别为:10000，40000，70000，500000和2000000，瑞典PharmaciaAB）.EZ-DRY冷冻干燥机（美国FTSSystem公司），WB2000旋转蒸发仪（德国Hejdoiph公司），GL-20冷冻高速离心机（湘仪-TOMY联合制造），TLC-G台式冷冻离心机（军事医学科学院实验仪器厂），调温电热套（河北省黄骅市电器厂），Beckman168高效液相色谱系统（美国Beckman公司），Beck-manDU-600紫外可见光分光光度计（美国Beckman公司），制冰机（日本Sanyo公司），高效凝胶过滤色谱柱BiosepSEC-3000（300mm7.8mm）（美国Phenomenex公司），高效阴离子交换色谱柱TSKDEAE-5PW（7.5mm75mm）（美国Beckman公司），TGL.16G台式高速离心机（上海医用分析仪器厂），PE红外分光光度计（美国P-E公司），DG3022A酶联免疫检测仪（华东电子管厂）1.2方法1.2.1当归总多糖AP-0的分离提取新鲜当归清洗后绞碎，用950g・；kg-1乙醇回流3次，每次4h.合并3次乙醇提取液，用旋转蒸发仪减压回收乙醇，可得到红色的当归精油.醇提残渣烘干后，用蒸馏水回流3次，每次4h.3次提取液合并后，减压蒸馏浓缩.浓缩液预冷后，加入3倍体积的预冷950g・；kg-1乙醇，搅拌.静置后，用高速冷冻离心机收集沉淀得到粗提多糖.粗提多糖用蒸馏水溶解，4条件下对蒸馏水透析3d.离心去除沉淀，最终上清液经冷冻干燥得到白色冻干粉末，即AP-0.1.2.2AP-1，AP-2和AP-3分离纯化每500mL冻干前的AP-0液体中加入80g・；kg-1十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）500mL，产生沉淀，静置12h，5000r・；min-1离心10min收集沉淀.沉淀部分用350mL100g・；kg-1NaCl溶解，加入4倍体积预冷的950g・；kg-1乙醇，产生乳白色沉淀，收集沉淀，蒸馏水溶解后，经透析、冻干得到白色粉末状AP-1.CTAB处理后的上清为无色清液，加入10g・；kg-1H3BO3pH6.0，搅拌再用2mol・；L-1NaOH调pH为11.0，产生乳黄色果冻状沉淀，离心收集沉淀，用20g・；kg-1乙酸调pH为7.0后，用100g・；kg-1NaCl溶解，溶解液中加入4倍体积的预冷950g・；kg-1乙醇，产生乳白色沉淀，离心收集沉淀，蒸馏水溶解后，经透析、冻干得到白色粉末状AP-2.AP-2提取后的上清液用乙酸调pH为4.4，加入4倍体积的预冷950g・；kg-1乙醇，4静置过夜，离心收集沉淀，蒸馏水溶解后，经透析、冻干得到白色粉末状AP-3.1.2.3分析鉴定总糖含量测定10，11采用改良的苯酚-硫酸法12.糖醛酸含量测定13，14采用间羟基连苯法15.蛋白质含量测定采用Servablue-G染料结合法16.重均相对分子质量及电荷特性分析详见参考文献17-20.单糖组成分析:多糖样品的水解分别取AP-0，AP-1，AP-2和AP-3:15.8，18.0，20.0和21.7mg，分别加入浓硫酸2.0mL，溶解后移入水解管中，熔融封管，100烘箱中水解6h.水解后，加入固体碳酸钡中和，4000r・；min-1离心，取上清液做纸色谱和薄层色谱分析.标准单糖液配制:称取Rha，Xyl，Ara，Fru，Gal，Man，Glu，GluA，GalA各25mg，分别溶于0.5mL重蒸馏水中，待纸色谱和薄层色谱分析.单糖和多糖水解物的纸色谱法和薄层色谱法:纸色谱分析采用新华中速滤纸（10cm30cm），展开剂为:正丁醇:乙酸乙酯:吡啶:乙酸=25101013；显色剂:苯胺-邻苯二甲酸正丁醇溶液.薄层色谱法:采用硅胶G自制18cm18cm薄层色谱板，展开剂、显色剂同纸色谱.红外光谱分析:分别取AP-0，AP-1，AP-2和AP-3冻干样品2mg，加入200mg经干燥的KBr晶体，在红外灯照射下，在玛瑙研钵中研磨后，用压片机压片，红外分光光度计4004000cm-1中红外区扫描，测定透光率曲线.紫外光谱分析:分别取AP-0，AP-1，AP-2和AP-3冻干样品，蒸馏水配制浓度约为20mg・；L-1的溶液，用紫外-可见光分光光度计190400nm扫描，测定紫外区的吸收光谱.2结果2.1当归多糖组分表观性状液体状的AP-0为浅米色，AP-1为乳白色，AP-2为浅米色，AP-3为啤酒色.冻干后的AP-0，AP-1，AP-2和AP-3均为白色鳞片状结晶，极易潮解.2.2每批产量、得率和成分每批处理2700g新鲜当归，可得AP-0，AP-1，AP-2和AP-3的产量为81.9，9.8，25.9和30.1g；相对于新鲜当归的提取得率为3.0%，0.36%，0.96%和1.11%.AP-0AP-3中总糖含量为970，970，830和970g・；kg-1；糖醛酸含量为210，172，257和86g・；kg-1；蛋白质含量为30，30，170和30g・；kg-1.2.3Mr分布和电荷特性当归多糖AP-0，AP-1，AP-2和AP-3分别由5个不同的多糖组分组成，其重均Mr（103）AP-0为>；67000，43372，16755，8210和1554；AP-1为>；67000，>；67000，26957，5102和1917；AP-2为>；6700043373，26957，1971和1225；AP-3为>；67000，34194，16755，6472和3171.当归多糖AP-0，AP-1，AP-2和AP-3经高效阴离子交换色谱分析，分别可分为4个不同离子化程度的组分，具有不同的色谱保留时间tR，结果见AP-0为3.0，9.0，12.0和15.5min；AP-1为4.0，13.0，20.0和23.0min；AP-2为4.0，13.0，16.0和19.0min；AP-3为3.0，7.0，15.0和20.0min.2.4单糖组成分析AP-0，AP-