不同处理对大鼠移植心脏存活时间的影响.doc

不同处理对大鼠移植心脏存活时间的影响【摘要】目的观察供体脾细胞（SPC）与环磷酰胺（CP）联合预处理对大鼠移植心脏存活时间的影响。方法应用大鼠颈部心脏移植模型，实验分为对照组（未干预组）、CsA组、SPCCP组。CsA组心脏移植后予环孢霉素A(CsA)10mg/kg，SPCCP组采用供体SPC和CP预处理移植受体，然后行大鼠颈部心脏移植术。观察移植心脏存活情况及组织病理变化。结果对照组、CsA组、SPCCP组移植心脏存活时间分别为(7.22.4)、（15.84.3）、（30.410.7）天；组织病理检查显示，经SPC+PC预处理的移植心脏排斥反应明显减弱。结论SPC和CP预处理可以诱导受体对移植物的免疫耐受，延长移植心脏的存活期，效果优于CsA。【关键词】心脏移植免疫耐受供体脾细胞环磷酰胺环孢霉素A大鼠Abstract:ObjectiveToevaluatetheeffectofpretreatmentwithdonorspleencells(SPC)andcyclophosphamide(CP)onthesurvivaltimeofcardiacallograft.MethodsTheexperimentwasperformedonSDratmodelsofheterotopiccervicalhearttransplantation.Theanimalsweredividedinto3groups.ThecontrolgroupconsistedofSDmodelswithouttreatment.InthecyclosporineA(CsA)drugcontrolgroup,therecipientsweretreatedaftertransplantationwithCsA10mg/kgipq2d.IntheSPC+CPpretreatmentgroup,theSDratswerepretreatedwithSPCivonD0andwithCP80mg/kgiponD2,andthetransplantationwascarriedoutonD10.Thelivingconditionandthesurvivaltimeoftheallograft,anditspathologywerenoticed.ResultsThesurvivaltimeinthecontrolgroup,CsAgroupandSPC+CPgroupwas(7.22.4),(15.84.3)and(30.410.7)respectively.HistopathologyshowedtheHVGrejectionreactionswereevidentlyattenuatedinthepretreatmenttestgroup.ConclusionPretreatmentwithSPCplusCPenablesthehosttoproduceimmunetolerancetothecardiacallograft,extendingthesurvivaltimeofthegraft,evenlongerthantheconventionalCsAtreatment.Keywords:cardiactransplantation；immunetolerance；pretreatment；donorspleencell；cyclophosphamide；cyclosporinA；rats器官移植在临床医学的应用越来越广泛，然而移植后排斥反应却严重阻碍着移植医学的发展。本研究应用大鼠异位心脏移植模型，采用门静脉输注供体脾细胞（donor-specificspleenocyts，SPC）及环磷酰胺（cyclophosphamide，CP）注射诱导免疫耐受，对移植心脏的存活情况进行了观察，现报道如下。1材料和方法1.1实验动物和材料健康近交系Wistar大鼠为供体，SD大鼠为受体，由山东大学实验动物中心和徐州医学院实验动物中心提供，雌雄不限，816周龄，体质量200250g，随意进食和饮水。质量浓度1%的戊巴比妥钠，体积分数为75%的乙醇，25103U/L肝素，质量浓度2的罂粟碱，显微外科手术器械（上海医疗仪器厂），医用无损伤缝线，套管，丝线。1.2方法1.2.1脾细胞悬液的制备取Wistar大鼠，1%戊巴比妥钠按4ml/kg(40mg/kg)腹腔内注射麻醉后，无菌开腹取脾。将脾脏制备成单细胞混悬液1，显微镜下计数淋巴细胞数量。1.2.2实验分组及处理分为对照组、CsA组和SPCCP组，每组受体和供体各12只，受体为SD大鼠，供体为Wistar大鼠。对照组（未干预组）：受体不做任何预处理。CsA组：受体不做任何预处理，心脏移植手术当日开始用环孢霉素A(CsA)10mg/kg，腹腔内注射，每2天1次，共810次。SPCCP组：取受体SD大鼠，将制备好的供体脾细胞（SPC）5108个，自SD大鼠的门静脉内注入（d0），第2天(d2)SD大鼠的腹腔注射环磷酰胺（CP）80mg/kg；分别于第10天进行心脏移植手术。1.2.3心脏移植方法采用套管法行大鼠颈部心脏移植，具体方法见文献2。1.3观察指标1.3.1术后每日2次颈部视诊或触诊，观察移植心的博动情况。1.3.2病理观察:分别于术后第7、11天及终末期等时间点各取4只供心，送病理学检查，采用苏木精-伊红染色方法制作病理切片。观察移植心脏大体情况，切片观察炎性细胞、心肌坏死、肉芽组织增生情况，判断病理改变程度。1.4统计学处理大鼠移植心脏存活时间用s表示，组间比较采用t检验，P0.05认为差异有显著性。2结果2.1术后移植心脏观察对照组（未干预组）术后移植心脏收缩有力、搏动幅度较大、心率快慢不等，心率均慢于受体心率（300500次/min）；随时间延长，移植心脏逐渐增大，收缩力明显减弱，搏动幅度降低，常在术后711天停跳。移植部位打开时见移植心脏周围明显水肿和渗出，但没有脓液及明显的感染征象。CsA组移植心脏的改变基本上也经历心脏搏动由强到弱再好转、心脏增大再缩小的过程，总趋势与SPC+CP组相似，但在移植心脏功能最差时仍可触及搏动。SPCCP组移植心脏早期变化与对照组基本一致，出现收缩力逐渐减弱，搏动幅度逐渐减小，移植心脏明显增大，在711天时最为严重；本组约有1/41/3移植心脏常触不到搏动，仅可见颈部毛动，个别需要麻醉后观察，而此时切开颈部手术区皮肤后，可见移植心脏有较弱的收缩。此种状况常在术后15天左右好转，随着颈部手术瘢痕的软化，移植心脏开始缩小，心率逐渐增快，搏动幅度和收缩力逐渐增加。有趣的是，在移植心脏功能最差时只要出现收缩力和搏动幅度增加等好转征象，便能够长期存活。在术后15天到1个月内移植心脏明显缩小，心率快慢不等，约有半数以上移植心脏出现心律不齐，持续时间长短不一，但均能自行好转，有的可出现多次心律不齐，个别移植心脏心率比受体心率快。2.2移植心脏存活时间应用CsA治疗后，移植心脏的存活时间明显延长，CsA组与对照组比较，差异显著（P<；0.05），说明CsA可以显著延长移植心脏的存活时间。SPC+CP组移植心脏的存活时间与CsA组比较，二者差异显著（P<；0.05），说明SPC+CP联合预处理对预防移植心脏排斥反应的效果优于CsA。3组大鼠移植心脏存活时间见表1。表13组大鼠移植心脏存活时间比较2.3各组终末期移植心脏大体变化对照组：移植心脏体积增大，明显充血、水肿。CsA组：移植心脏体积轻度增大，呈实性变，质韧，充血、水肿不明显。SPC+CP组：移植心脏增大不明显，质软、红润。2.4各组移植心脏组织病理学检查术后7天、11天组织病理检查见图1。对照组：移植心脏的心肌坏死和细胞浸润明显增多；浸润的炎性细胞主要为淋巴细胞、巨噬细胞和少量的中性粒细胞。CsA组：心肌坏死和细胞浸润明显减轻，浸润的炎性细胞主要为淋巴细胞和巨噬细胞。与对照组比较，浸润细胞中巨噬细胞明显增加，而淋巴细胞明显减少。3讨论有报道称通过门静脉注射脾细胞，在不使用免疫抑制剂的情况下可以诱导完全异基因小鼠间的皮肤移植耐受3。通过门静脉途径给予同种异体抗原，可诱导供体特异性耐受，并且经门静脉输注最为有效；其次为外周静脉、腹腔；皮下最差。我们采用供体的脾细胞处理受体（d0），在第2天给予门静脉注射CP5080mg/kg。在这种模型中，供体抗原和干细胞联合治疗对产生耐受是必需的，在注射供体抗原后，对供体抗原发生反应的T细胞被激活并进行增殖，而增殖的细胞可被随后给予腹腔注射的CP选择性破坏4，抗原激活的T细胞首先从外周消失，随后在外周和胸腺内便出现了暂时的嵌合体状态5-6，使得在外周7和胸腺内8对供体反应的免疫细胞发生克隆丢失。由此可见，来源于供体的骨髓成分在胸腺髓质中生存导致了与移植物起反应的胸腺细胞不断缺失。在这种模型中，移植耐受的维持是胸腺水平与移植物发生反应T细胞持续缺失的结果。克隆丢失与移植耐受的作用是克隆无反应性伴有某种程度的细胞程序性死亡的结果。本实验对SPC+CP诱导的免疫耐受进行了研究，即用SPC通过门静脉注射，2天后给予80mg/kg的CP。因为在输注异体抗原后，受体内的T细胞在13天内增殖活跃，此时用药容易杀死增殖的T细胞，造成克隆排除9，因此，我们选择SPC注射后2天作为CP用药的最佳时间。10天后进行心脏移植，结果移植物的存活时间明显延长。病理检查结果中，经SPC+CP处理后，移植心脏炎症反应、心肌坏死及肉芽组织增生情况较CsA组、对照组轻，说明该法诱导免疫耐受效果良好。采用SPC+CP预处理后，我们观察到大部分移植心脏在手术后均逐渐增大，搏动幅度逐渐降低，频率也有减慢，而在711天之后，增大的移植心脏开始缩小，随着伤口周围瘢痕的软化，移植心脏搏动幅度渐增大，频率也加快，自此以后移植心脏可以长期存活。本组术后存活至12个月的移植心脏通常缩小至手术时大小。而在对照组中，移植心脏早期的变化与SPC+CP组基本相同，但增大更明显，搏动幅度降低，频率渐减慢，常在711天完全停跳(没有好转征象)，移植心脏周围常有明显水肿渗出，心肌也有肿胀、充血，显微镜下可见到心肌细胞坏死，少数水肿明显者切口愈合欠佳，缝线处的皮肤裂开。在急、慢性排斥反应模型中，移植心脏的早期变化有许多相似之处，仅根据颈部心脏观察情况很难对二者进行区分。但急性排斥反应时移植心脏增大、炎症水肿常更明显，且至停跳时无好转征象，而SPC+CP组虽然搏动幅度和频率逐渐减低，但后来渐好转，可以长期存活。本组实验结果表明，SPC+CP预处理诱导免疫耐受效果良好，能够明显延长大鼠同种异体心脏移植的存活时间，效果优于CsA。【参考文献】1郭宏伟，吴清玉，谢蜀生，等.多次输注供体脾细胞诱导心脏移植免疫耐受的实验研究J.中华外科杂志，2004，42(11):664-667.2张伟，张中明，钱伟民，等.大鼠颈部心脏异位移植模型的建立J.徐州医学院学报，2008，28（6）：360-363.3MoritaH，SugiuraK，InabaM，etal.AstrategyfororganallograftswithoutusingimmunosuppressantsorirradiationJ.ProcNatlAcadSciUSA,1998，95(12):6947-6952.4MaedaT，EtoM，NishimuraY，etal.Directevidenceforclonaldestructionofallo-reactiveTcellsinthemicetreatedwithcyclophosphamideafterallo-primingJ.Immunology,1993，78(1):113-121.5MayumiH，HimenoK，ShinT，etal.Drug-inducedtolerancetoallograftsinmice.ToleranceinductioninH-2-haplotype-identicalstraincombinationsinmiceJ.Transplantation,1985，40(2):188-194.6MayumiH，GoodRA.Inductionoftoleranceacrossmajorbarriersusingatwo-stepmethodwithgeneticanalysisoftoleranceinductionJ.Immunobiology,1989，179(1):86-108.7MaedaT，EtoM，NishimuraY，etal.Roleofperipheralhemopoieticchimerisminachievingdonor-specifictoleranceinadultmiceJ.JImmunol,1993，150(3):753-762.8EtoM，