3种经典工艺生产的金银花提取物中糖类成分含量比较.doc

3种经典工艺生产的金银花提取物中糖类成分含量比较作者：陈有根张蓉邬国庆王志斌【摘要】：目的比较3种经典工艺生产的金银花提取物中果糖、葡萄糖、蔗糖和总糖的含量差异,为指导含金银花中成药的生产和质量控制提供科学依据。方法用经典的水-醇法、石-硫法和改良石-硫法生产金银花提取物样品,用高效液相-梯度洗脱法测定3种提取物样品中果糖、葡萄糖和蔗糖含量,用分光光度法测定3种提取物样品中总糖含量。结果3种提取物中果糖含量分别为5.44%、3.47%、4.74%,葡萄糖含量分别为4.35%、2.73%、4.21%,蔗糖含量分别为17.41%、8.47%、14.47%,总糖含量分别为50.63%、41.12%、35.90%。结论测定了金银花提取物中除绿原酸类以外的36%51%总成分含量,并揭示了其中19%27%的化学成分组成为果糖、葡萄糖、蔗糖。【关键词】金银花提取物果糖葡萄糖蔗糖Abstract：ObjectiveTodeterminethecontentsoffructose,glucose,sucroseandtotalsaccharideinhoneysuckleextractswhichwereproducedbythreeclassicalmethods,toprovidescientificdataforproducingandcontrollingofthosepatentmedicinescontaininghoneysuckleextract.MethodsThreeclassicalextractmethodswereusedforproducinghoneysuckleextracts.HPLC-ELSDmethodwasusedfordeterminingthecontentsoffructose,glucose,sucrose,andaspectrophotometricdeterminationmethodwasusedfordeterminingthecontentsoftotalsaccharide.ResultsThecontentsoffructoseinthreehoneysuckleextractswere5.44%,3.47%,4.74%,glucosewere4.35%,2.73%,4.21%,glucosewere17.41%,8.47%,14.47%,andtotalsaccharidewere50.63%,41.12%,35.90%,respectively.ConclusionAbout36%51%oftotalcomponentsofhoneysuckleextractsweredeterminedexceptchlorogenicacids,and19%27%ofcomponentsintheextractswerefructose,glucose,sucrose.Keywords：honeysuckleextract；fructose；glucose；sucroses金银花为常用中药,来源于忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾,具有清热解毒、凉散风热的功能。金银花提取物是生产多种中成药制剂的中间原料。中华人民共和国药典和卫生部药品标准中收载的金银花提取物的生产工艺有3种,即：水-醇法1、石-硫法2和改良石-硫法3,它们均属于有法定标准的工艺方法。用这3种工艺生产的提取物分别作为双黄连、茵栀黄和银黄注射液的中间原料。这3种注射剂在临床都有十余年的使用历史,其疗效得到众多临床医生和患者的肯定。关于金银花提取物的质量控制报道较多,多数以绿原酸含量作为控制指标,未见用糖类成分作为指标对金银花提取物进行质量控制研究的报道。本试验采用RP-HPLC-ELSD法测定了3种经典工艺生产的金银花提取物中果糖、葡萄糖和蔗糖含量,本研究可为含金银花中药注射剂的生产和质量控制提供具有实用价值的实验数据。1仪器与试药Agilent-1100高效液相色谱仪,四元泵,自动进样器,柱温箱,AlltechELSD2000ES检测器,AgilentA10.02工作站。岛津UV-2450PC型可见-紫外分光光度仪。果糖、葡萄糖和蔗糖对照品(中国药品生物制品检定所提供)；金银花药材(采自山东省平邑县白彦镇)。乙腈为色谱纯,水为去离子水,其它试剂均为分析纯,苯酚重蒸后用水配成5%的溶液。2方法与结果2.1果糖、葡萄糖和蔗糖的含量测定2.1.1色谱条件色谱柱：Inertsil-NH2(4.6mm250mm,5m)；流动相：乙腈-水(7822)；流速：1mL/min；柱温：30；ELSD检测器氮气流速2.2L/min,漂移管温度85。2.1.2供试品溶液的制备取金银花提取物A、B、C细粉300mg(3种提取物样品的制备方法见文献4),精密称定,分别置50mL量瓶中,加70%乙醇至刻度,超声(600W)处理10min,0.45m微孔滤膜滤过,取续滤液,备用。2.1.3线性关系考察分别精密称取果糖、葡萄糖和蔗糖适量,加70%乙醇制成每1mL含果糖1.484mg、葡萄糖1.456mg和蔗糖2.648mg的混合对照品溶液。精密吸取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL,置10mL量瓶中,加70%乙醇至刻度,摇匀,制成系列混合对照品溶液。按上述色谱条件分别进样10L,以进样量的自然对数(lnm)为横坐标,峰面积的自然对数(lnA)为纵坐标,计算,得果糖的回归方程为：lnA1.3086lnm7.9464,r0.9996,线性范围为0.7287.280g；葡萄糖的回归方程为：lnA1.2771lnm7.9793,r0.9996,线性范围为0.7427.420g；蔗糖的回归方程为：lnA1.2577lnm7.9826,r0.9999,线性范围为1.32413.420g。2.1.4系统适应性在上述色谱条件下测定,结果表明,理论塔板数以果糖峰计算为12745,以葡萄糖峰计算为5578,以蔗糖峰计算为13425(见图1)。2.1.5精密度试验取果糖、葡萄糖和蔗糖质量浓度分别为0.2968、0.2912和0.7944mg/mL的混合对照品溶液,连续进样5次,每次10L,以果糖、葡萄糖和蔗糖的峰面积计算进样精密度,RSD分别为1.62%、1.59%和1.50%。2.1.6重复性试验取提取物C,按供试品溶液制备方法制备5份供试液,依法测定,计算,得果糖平均含量为4.74%(RSD1.43%),葡萄糖平均含量为4.21%(RSD1.52%),蔗糖平均含量为14.47%(RSD1.49%)。2.1.7稳定性试验取同一份供试品溶液,每隔2h进样测定,结果5次测定的果糖、葡萄糖和蔗糖的峰面积基本不变,RSD分别为1.03%、1.12%、1.46%,表明供试品溶液在8h内稳定。2.1.8加样回收率试验取已测定含量的提取物C细粉150mg,5份,精密称定,分别置50mL量瓶中,精密加入果糖、葡萄糖和蔗糖质量浓度分别为0.2968、0.2912和0.7944mg/mL的混合对照品溶液25mL,再加70%乙醇至刻度,超声(600W)处理10min,0.45m微孔滤膜滤过,依法测定,计算回收率,结果见表1表3。表1果糖加样回收率试验结果(略)表2葡萄糖加样回收率试验结果(略)表3蔗糖加样回收率试验结果(略)2.1.9样品测定取上述3种金银花提取物,按“2.1.2”项下操作制备供试品溶液,各3份,按上述色谱条件测定果糖、葡萄糖、蔗糖的含量,结果见表4。表4样品含量测定结果(略)2.2总糖含量测定2.2.1供试品溶液的制备取金银花提取物细粉100mg,精密称定,置50mL量瓶中,加水至刻度,超声处理10min,取出,冷却至室温,精密吸取1mL,置25mL量瓶中,加水至刻度,摇匀,即得。2.2.2检测波长的确定取显色后的对照品和供试品溶液,在400700nm波长范围内进行扫描,结果表明,对照品溶液和供试品仅在490nm处有1个吸收峰,因此,选择490nm作为检测波长。2.2.3线性关系考察精密称取无水葡萄糖对照品,加水使溶解制成每1mL含无水葡萄糖0.0446mg的对照品溶液。分别精密量取对照品溶液2、4、6、8、10mL,置10mL量瓶中,加水至刻度,摇匀,制得系列对照品溶液。分别精密吸取系列对照品溶液2mL于具塞试管中,加5%苯酚试液1.0mL,混匀,迅速加5.0mL浓硫酸,密塞,摇匀,置沸水浴加热15min,取出,迅速置冰水中冷却,以5%的苯酚-硫酸溶液为空白,于490nm处测定吸收值。以对照品浓度(C)为横坐标,吸收度(A)为纵坐标,计算回归方程为：A14.589C0.1311,r0.9992(n3)。结果表明,葡萄糖在8.9244.60g/mL浓度范围内具有良好的线性关系。2.2.4精密度试验取金银花提取物C细粉100mg,精密称定,置50mL量瓶中,加水至刻度,超声处理10min,取出,冷却至室温,精密吸取1mL,置25mL量瓶中,加水至刻度,摇匀,精密吸取2mL,5份,依法显色,测定吸收值,结果RSD0.27%。2.2.5重复性试验取金银花提取物C细粉100mg,5份,精密称定,分别置50mL量瓶中,依法处理,显色,测定吸收值,计算,得总糖平均含量为35.90%(RSD1.32%)。2.2.6显色稳定性试验取同一份供试品溶液,测定时间-吸收值曲线,结果在30min内吸收值基本不变,表明供试品溶液显色后在30min内稳定。2.2.7加样回收率试验取金银花提取物C细粉50mg,5份,精密称定,分别置50mL量瓶中,分别精密加入无水葡萄糖对照品30mg,加水至刻度,依法处理,显色,测定吸收值,计算回收率,结果见表5。表5总糖加样回收率试验结果(略)2.2.8样品测定分别取金银花提取物细粉100mg,精密称定,置50mL量瓶中,依法处理,显色,测定吸收值,计算含量,结果见表6。表6总糖样品含量测定结果(略)3讨论双黄连、茵栀黄和银黄注射液是目前国内使用最广的3种含金银花的中药注射剂,在临床都有十余年的使用历史,以其疗效好、起效快、给药方便而得到众多临床医生和患者的肯定。然而,近年来频频发生的危及患者生命安全的中药注射剂不良反应(其中含金银花的中药注射剂尤其突出),又使人们对中药注射剂的认识蒙上了一层面纱。因此,中药注射剂中功效成分以外的化学组分也成了此类制剂质量控制的关注焦点。我们曾经报道了上述3种金银花提取物样品中的绿原酸、3,5-二咖啡酰基奎宁酸和总绿原酸的含量4,本实验分别用HPLC方法测定了这3种提取物中除绿原酸类成分外18%27%的化学组分,用分光光度法测定了其中除总绿原酸以外36%51%的总成分含量,使我们对含金银花的中药注射剂的组分有了更明确的了解。本实验结果可为指导含金银花中药注射剂的生产以及质量控制提供具有实用价值的研究方法和实验数据,