Tim3及其配体Gal9与宫颈鳞状细胞癌病理分级和预后的相关性研究.doc

Tim3及其配体Gal9与宫颈鳞状细胞癌病理分级和预后的相关性研究 徐国荣1冯秀兰2许作鹏3 1.江门市人民医院妇科，广东江门529000；2.江门市人民医院检验科，广东江门529000；3.江门市人民医院病理科，广东江门529000 摘要目的探究不同病理分级的宫颈鳞状细胞癌患者血清及癌组织中T细胞免疫球蛋白黏蛋白3（Tim-3）及其配体半乳凝素9（Gal-9）表达，分析其临床意义。方法收集17例上皮瘤样病变（CIN），38例含低（PSCC）、中（MSCC）、高分化（WSCC）宫颈鳞状细胞癌（SCC）组织以及血清样本，17例正常妇女血清，并依次分为CIN组、PSCC组、MSCC组、WSCC组以及正常组。分别采用蛋白质免疫杂交技术（Westernblot）以及qRT-PCR技术检测CIN组、PSCC组、MSCC组以及WSCC组组织样本中Tim-3以及Gal-9的表达，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测CIN组、PSCC组、MSCC组、WSCC组以及正常组血清样本中Gal-9的表达水平。分别比较各组组织中Tim-3和Gal-9的表达以及血清中Gal-9的表达水平与宫颈鳞状细胞癌不同病理分级的相关性。结果Westernblot与qRT-PCR结果均显示Tim-3和Gal-9在SCC各组组织中表达高于CIN组（P0.05），且与病理分级呈正相关（r=0.738、0.671，P0.05）。ELISA结果亦显示Gal-9在SCC各组血清中高于正常组以及CIN组（P0.05），切与病理分级呈正相关性（r=0.687，P0.05），各组患者术前均未经过放化疗。 1.2方法 1.2.1癌组织样本中Tim-3及Gal-9表达检测采用Westernblot技术检测CIN组、PSCC组、MSCC组、WSCC组组织样本中Tim-3以及Gal-9蛋白的表达。分别取各组组织样本100mg，采用IM-PER蛋白抽提试剂（购自Therrmo公司）抽提蛋白，通过BCA蛋白浓度定量试剂盒（购自Thermo公司）进行定量，定量蛋白上样后进行电泳及转膜，分别采用抗Tim-3抗体以及抗Gal-9抗体对硝酸纤维素膜进行第1次孵育，分别采用HRP标记的相应抗体进行二次孵育，采用荧光化学法显色，观察结果；采用qRT-PCR检测CIN组、PSCC组、MSCC组、WSCC组组织中Tim-9以及Gal-9的表达。取各组组织样本100mg，采用TRIZOL法抽提组织样本总RNA，经一步法反转录试剂盒（购自Takara公司）进行反转录PCR后，采用SYBRR荧光定量试剂进行qRT-PCR进行定量检测。以上检测均以GAPDH作为内参，以CIN组作为对照组，其中qRT-PCR引物序列如下： Tim-3正义：5-CAGATACTGGCTAAATGGGGAT-3， 反义:5-ACCTTGGCTGGTTTGATGAC-3； Gal-9正义：5-AATGGCCTTCAGCGGTTCCCAG-3， 反义：5-CTATGTCTGCACATGGGTCAG-3； GAPDH正义：5-TGACCACAGTCCATGCCATC-3， 反义：5-GACGGACACATTGGGGGTAG-3 1.2.2血清中Gal-9的表达检测采用ELISA检测正常组、CIN组、PSCC组、MSCC组、WSCC组血清中Gal-9的表达量，取各组外周血进行30min2000rpm离心，取上清采用ELISA试剂盒（购自R&D公司）进行Gal-9浓度检测。 1.3统计方法 通过GraphPadprism5.0软件，采用t检验分别计算Tim-3及其配体Gal-9在组间表达差异性分析。通过SPSS17.0软件，采用spearman检验分别计算Tim-3以及Gal-9与不同病理分级的宫颈鳞状细胞癌之间相关性。 2结果 2.1Tim-3在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达 Westernblot结果显示，在宫颈鳞状细胞癌组织中Tim-3的表达比CIN高，并且，Tim-3表达量随着病理分级的改变而改变，具体表现为WSCC较MSCC高，MSCC较PSCC高（图1，A）。通过qRT-PCR我们在mRNA水平上加以验证，也得到了同蛋白水平相似的结果，即Tim-3的表达在SCC中较高，差异有统计学意义（P0.05），且由PSCC至WSCC逐渐上调，差异有统计学意义（P0.05）（图1，A）。 2.2Gal-9在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达 实验结果显示，Gal-9的表达与Tim-3的表达变化高度相似。其中，Westernblot结果显示，Gal-9在SCC组织中表达高于CIN，且由PSCC向WSCC逐步递增（图2，A）。通过qRT-PCR我们对结果进一步验证发现，Gal-9在SCC中较CIN表达上调，差异有统计学意义（P0.05）,且其表达随着癌组织分化程度增高而上调（图2，B）。 2.3血清中Gal-9的表达量与病理分级的相关性 ELISA结果显示，SCC患者血清中Gal-9表达量较正常以及CIN高，差异有统计学意义（P0.05），在不同病理分级中，Gal-9的表达量随癌组织分化程度增加而增加，且各级间差异有统计学意义（P0.05）（图3）。spearman秩相关系数，r=0.687显示血清中Gal-9表达量与癌组织分化程度呈现明显正相关性。 2.4组织中Tim-3和Gal-9基因表达与病理分级的相关性 进一步分析qRT-PCR数据显示，宫颈鳞状细胞癌病理分级与Tim-3和Gal-9基因表达差异有统计学意义（P0.05），spearman秩相关系数，分别是0.738和0.671,说明病理分级与Tim-3和Gal-9基因表达均呈现明显正相关。这与Gal-9在血清中的表达量与病理分级的相关性一致。 3讨论 Tim-3作为一种抗肿瘤的负向调控因子，在调控多种肿瘤凋亡过程中起着重要作用4。目前研究报道，Tim-3在前列腺癌、肾癌、急性白血病以及黑色素瘤等多种癌组织中呈强阳性表达5-8。对于宫颈鳞状细胞癌中Tim-3的表达以及Tim-3的表达与宫颈鳞状细胞癌病理分级的相关性则仍未有报道。该研究中，Westernblot与qRT-PCR结果均显示Tim-3在SCC各组组织中表达高于CIN组（P0.05），说明Tim-3在SCC中表达，且作为机体抗肿瘤因子在宫颈鳞癌发生过程中可能起着重要作用，关于其作用机制尚需进步一研究。进一步分析Tim-3的表达与病理分级的关系，发现Tim-3表达在PSCC、MSCC、WSCC3组中有明显差异（P0.05），且与病理分级呈现明显的正相关性（r=0.738），两者的关系揭示了Tim-3可以作为临床宫颈鳞状细胞癌病理分级一个重要指标，为宫颈鳞状细胞癌的预后提供一个有意义的参考指标。 该研究又对Tim-3的特异性配体Gal-9的表达进行了进一步研究。Gal-9是Tim-3的主要配体，与Tim-3一同在抗肿瘤免疫起着重要的负向调控作用9。已有文献报道称血清中Gal-9的表达量与宫颈鳞状细胞癌的病理分级呈现正相关关系10，但并未在基因表达水平进步一验证，且研究过于简单，没有深入验证。首先该研究通过Westernblot验证了Gal-9在SCC中的表达，发现相比CIN组，Gal-9在SCC各组中均呈强阳性表达，预示作为Tim-3的特异性配体Gal-9可能在癌症发展过程中起着重要的调控作用，而在SCC各组表达呈现由低分化癌向高分化癌递增的现象表明Gal-9可能与病理分级呈正相关关系。接下来通过qRT-PCR在mRNA水平进一步