牛SPAG11D基因的原核表达及其抑菌活性研究.doc

牛SPAG11D基因的原核表达及其抑菌活性研究 胡修忠，凌明湖，王定发，程蕾，向敏，刘晓华，夏瑜 （武汉市畜牧兽医科学研究所，武汉） 摘要：为了检测重组蛋白的抑菌活性，提取牛睾丸组织总，经扩增了基因，将该基因插入（）融合表达载体，并转入（）进行原核表达，通过改变浓度和诱导时间优化表达条件，并用琼脂扩散法测定重组蛋白体外抑菌活性。结果显示，成功扩增牛基因，产物大小为，其序列与公布序列相一致；正确构建了原核表达载体（），重组蛋白最佳表达条件为终浓度、诱导时间为；表达产物的分子质量约为；该重组蛋白对霍乱弧菌具有明显的体外抑菌活性。本研究成功构建了牛基因的原核表达载体，并获得了具有抑菌活性的重组蛋白。 关键词：牛；原核表达；基因；抑菌作用 ：A：0439114（15）051135-04 DOI：10.14088/j.ki.issn0439-8114.xx.05.027 ： 基金项目：武汉市农业科学技术研究院创新基金项目（） 作者简介：胡修忠（），男，山东曹县人，畜牧师，主要从事动物遗传育种与繁殖工作，（电话）（电子信箱）。 精子相关抗原（aa，）是精子膜上的一种蛋白，也是防御素的一种，由个相互独立的防御素基因通过通读转录连接到一起，主要在哺乳动物的睾丸、附睾和雄性生殖道中表达。被认为在雄性生殖道的先天免疫、精子的成熟以及透明带的识别和精卵结合等事件中起到重要的作用。 雄性生殖系统的病原感染严重威胁其生殖和内分泌功能，如沙眼衣原体可以引起附睾炎并阻碍附睾内精子的运动。而蛋白能够抵御病原微生物对机体生殖道的侵害。对人的各蛋白亚型研究表明，其端都具有抗菌活性，而且人的蛋白抗大肠杆菌活性远大于该亚型端的抗菌活性，。此外还发现，猕猴的蛋白也具有抗菌活性。 目前认为在精子通过附睾的过程中参与精子的成熟。等发现大鼠附睾头部的蛋白结合在精子的头部，在附睾尾部的蛋白结合在精子顶体后部，这表明蛋白在精子通过附睾时对精子起一定的修饰作用，此外蛋白能够提高未成熟精子的运动能力。 在牛体内共发现种蛋白亚型：、，它们存在于睾丸、附睾、输精管上皮以及非生殖道组织中。余树民等在牦牛生殖器官中也检测到了这个亚型的表达。 材料与方法 试剂 试剂购自公司；反转录试剂盒、聚合酶、和限制性内切酶均购自公司；连接酶购于公司；质粒快速提取试剂盒、琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；购自公司；异丙基硫代半乳糖苷（）购自公司；氨苄青霉素（）购自公司；丙烯酰胺、过硫酸铵、乙二胺四乙酸（）、十二烷基硫酸钠（）等均为国产分析纯试剂。 菌种和质粒 、（）购自北京全式金生物技术有限公司；（）、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、大肠杆菌、大肠杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌为本实验室保存。 试验动物 刚出生的小公牛。 引物设计 根据上公布的牛抗精子抗体（）基因的核苷酸序列设计特异引物：，： 基因的克隆和测序 取小公牛睾丸和附睾组织，于液氮中保存。提取参照文献的方法提取组织的总，以（）为引物反转录生成第链。以、为引物扩增基因。反应体系（）如下：，模板，和（）各，聚合酶。反应条件如下：预变性；变性，退火，延伸，个循环；延伸；保存。产物于琼脂糖凝胶中电泳检测。 用凝胶回收试剂盒回收基因的产物，连接于克隆载体，构建质粒并转化感受态细胞，提取重组质粒，经双酶切鉴定后送上海生工生物工程有限公司测序。 原核表达载体的构建 用和双酶切，再克隆到原核表达载体（）的和位点之间，构建重组表达质粒（），转化感受态细胞，经双酶切鉴定筛选得到阳性克隆。 重组蛋白的诱导表达及表达条件的优化 将鉴定好的重组质粒和空载体质粒（）分别转化到（）感受态细胞中。挑取单菌落，接种到含的液体培养基中，振荡培养过夜。取活化后的菌液加入到液体培养基中，、振荡培养，当菌液为时，加入至终浓度，继续振荡培养，分别取诱导、和的菌液，离心，收集菌体，加入灭菌，再加入等体积加样缓冲液，混匀，煮沸，电泳检测重组蛋白的表达情况。 分别用不同的剂量（终浓度为、）和诱导时间（、）进行表达条件的优化。优化表达条件后，进行分离，经考马斯亮蓝染色、数次脱色后拍照观察结果。 抑菌活性测定 收集诱导表达的细菌，压力破碎后离心收集上清液。利用琼脂扩散法检测重组蛋白的体外抑菌活性：金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、大肠杆菌、大肠杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌于液体培养基中，摇床振荡培养。调整菌液浓度为；再将菌液稀释适当倍数。将稀释后的菌液均匀涂布于平板上。待琼脂表面水分干燥后，用镊子将无菌的牛津杯轻轻放入培养皿中，吸取上清液至牛津杯中。平皿放置冰箱扩散，转入温箱中后观察并测定抑菌圈的大小。 结果与分析 基因的扩增 基因的的产物经琼脂糖凝胶电泳检测，显示大小约左右的片段，与预计的片段大小相符（图）。 克隆载体的构建及鉴定 将基因的产物连接于克隆载体，转化大肠杆菌，经双酶切鉴定后测序。双酶切结果如图所示，测序结果与上发表的序列相一致。 表达载体的双酶切鉴定 经测序鉴定正确的克隆载体经和双酶切，克隆至原核表达载体（）上，构建表达载体（），转化感受态细胞，经双酶切鉴定筛选得到阳性克隆（图）。 原核表达产物的检测及条件优化 将含有质粒（）阳性克隆菌分别在条件下经诱导后，用对表达产物进行分析。诱导后在左右处有一明显蛋白带，与预期的大小相符，而未诱导菌没有同样大小的特征带，说明目的基因成功表达（图、图）。诱导最佳时间为，诱导最佳浓度为。 重组蛋白抑菌活性测定 检测了表达的重组蛋白在体外对霍乱弧菌、大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的体外抑菌性。结果显示，重组蛋白对霍乱弧菌的生长有抑制作用（图）。 讨论 睾丸、附睾和精囊等生殖道的感染严重威胁雄性的生殖和内分泌功能。泌尿生殖道微生物大多数为表皮葡萄球菌和棒状杆菌，少数为革兰阴性杆菌、大肠杆菌、支原体、衣原体等。其中大肠杆菌可引起的精子活动凝聚，使精子活力下降，从而影响生育。防御素是存在于哺乳类动物体中的抗微生物肽，在天然免疫过程中起到重要的作用，而且对机体无毒副作用。蛋白是防御素的一种，对人、猴的研究表明一些蛋白亚型对大肠杆菌、奈瑟菌、肠球菌和葡球菌具有很好的杀伤能力。本研究表达的融合蛋白对霍乱弧菌具有明显的生长抑制现象，表明牛蛋白具有抗菌活性，与其他物种具有类似的抗菌功能。牛蛋白可能在抵御病原菌侵害雄性生殖道方面发挥重要的作用。 在精子成熟过程中可能起到重要的作用，未成熟精子不具有运动能力，等发现大鼠附睾中未成熟精子与附睾上皮细胞或能表达（）的小肠上皮细胞共同培养后具有了运动能力，而加入抗体后，未成熟精子不具有运动能力；此外还发现，精子的运动能力随表达量的降低而下降。牛的存在于发育后期的精子细胞中，且在精子细胞的尾部，与大鼠相类似，可能与精子的运动能力相关。 鉴于牛在抵御微生物对机体的侵害和生殖功能方面起到重要作用，本研究表达了牛融合蛋白，且具有很强的抑菌生物活性，而在生殖方面的功能将进一步分析研究。 参考文献： ？魻，（）： 刘新颜，李建斌，仲跻峰，等精子相关抗原（）基因研究进展畜牧与兽医，（）： ，：P，（）： ，（）： ，？魧，（）： ，（）：I，（）： ，（）： ，（）（），（）： 余树民，李计尚，张